SELECTIVE-DIFFERENTIAL NUTRIENT MEDIUM «SHEWANELLA IRHLS AGAR» FOR ISOLATION OF SHEWANELLA GENUS BACTERIA

Full Text

Изучение бактерий рода Shewanella представляет большой интерес для медицины, природоведческой микробиологии, биотехнологии, нанотехнологии вследствие их способности превращать растворимые соединения радиоактивных изотопов, тяжелых металлов в нерастворимые и очищать гидросферу. Некоторые виды шеванелл (S.putrefaciens, S.algae) вызывают заболевания людей [2, 3]. Однако методы выделения этих микроорганизмов еще недостаточно совершенны. Цель исследования - разработка селективно-дифференциальной питательной среды для выделения шеванелл. Нами была разработана селективно-дифференциальная питательная среда «Shewanella IRHLS Agar» для выделения шеванелл. Акроним IRHLS означает селекцию шеванелл иргазаном (I) и рифампицином (R), идентификацию их колоний по признакам продукции сероводорода (H), наличия липазы (Ц),отсутствия ферментации и окисления сорбитола (S). Состав питательной среды, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки 12,0; пептон ферментативный из мяса 12,0; NaCI 6,0; твин-80 5,0; CaCI2 0,2; Na2S2O3x5Н2О 0,35; (NH4)2SO4xFeSO4x6Н2О 0,25; D-сорбитол 13,0; бромтимоловый синий водорастворимый 0,08; иргазан ( DP-300 ) 0,14 - 0,2; рифампицин 0,0005 - 0,001; NaOH 0,8; агар 12,0; вода дистиллированная 1 л, рН 7,2±0,2. Среда готовится следующим бразом: в 1 л дистиллированной воды вносят 42 г сухой питательной среды ГРМ-агар (содержащей панкреатический гидролизат рыбной муки 12 г, пептон ферментативный из мяса 12 г, NaCI 6 г, агар 12 г), растворяют при нагревании, стерилизуют при 121°C в течение 20 минут. Затем в горячую среду добавляют твин-80 (стерильный) 5 мл, CaCI2 0,2 г (2 мл стерильного 10% раствора хлорида кальция), тиосульфат натрия 0,35 г, соль Мора 0,25 г , D-сорбитол 13 г, бромтимоловый синий 0,08 г (5 мл 1,6% водного раствора), ир-газан DP-300 0,14 г (7 мл 2% раствора в 1 N растворе NaOH), рифампицин 0,0005 г (0,5 мл 0,1% раствора в диметилсульфоксиде), NaOH 0,8 г (20 мл 1 N раствора NaOH), pH 7,2±0,2, разливают в стерильные чашки Петри. Среда имеет зеленую окраску, прозрачная, пригодна для использования в течение 14 суток при хранении от 4 до 8°C. Для контроля среды используют штамм S.algae 22-H и местные штаммы Citrobacter freundii, Salmonella enteriditis, Proteus vulgaris. Суточные бульонные культуры засевают на поверхность среды в чашках Петри для получения изолированных колоний, инкубируют посевы при 28°C в течение 48 ч. Качество среды соответствует требованиям, если сальмонеллы и протей на ней не растут; шева-неллы формируют колонии диаметром 3 - 4 мм зеленого цвета с черным центром, окруженные зоной мутного преципитата; бактерии цитробактер образуют колонии диаметром 3 - 4 мм желто-серой окраски. Методика применения среды следующая: исследуемый материал, например, воду вносят по 50 - 100 мкл на поверхность питательной среды в чашках Петри, растирают шпателем, подсушивают. Инкубируют посевы при 28°C в течение 48 ч, после чего выявляют изолированные колонии бактерий, характерные для шева-нелл: 1) диаметром 3 - 4 мм зеленой окраски с широкой черной зоной в центре, окруженные зоной мутного преципитата или без нее; 2) диаметром 2 - 4 мм черносерой окраски, окруженные зоной мутного преципитата или без нее; 3) диаметром 2 - 3 мм зеленой окраски (без продукции сероводорода), окруженные зоной мутного преципитата или без нее. Бактерии из колоний указанных типов отсевают на среду Клиглера и сектор питательного агара для подтверждения их принадлежности к роду Shewanella (тестами на продукцию сероводорода, отсутствие ферментации и окисления глюкозы, наличие цитохромоксидазы и розовой окраски колоний, положительного «теста тяжа» для грамотрицательных бактерий ). Вид шеванелл определяли по [4]. При изучении 80 штаммов 30 видов 22 родов бактерий было установлено, что иргазан и рифампицин в составе данной среды полностью подавляют рост бактерий Salmonella, Proteus, продуцирующих сероводород, не подавляют роста бактерий рода Citrobacter , но подавляют продуцирование ими сероводорода. Кроме того, полностью ингибировался рост бактерий родов Escherichia, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Hafnia, Staphylococcus; не подавлялся рост бактерий родов Aeromonas, Achromobacter, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Pseudomonas, Serratia, Morganella, Enterococcus. Наличие в составе среды комплекса тиосульфата натрия, соли Мора, сорбитола обеспечивает выявление продукции сероводорода бактериями Shewanella и подавление образования сероводорода бактериями Citrobacter. Кроме того, сорбитол позволяет дополнительно дифференцировать колонии цитробактер (желтосерые за счет ферментации сорбитола) и шеванелл (зеленые ввиду отсутствия ферментации сорбитола). Присутствие в составе среды комплекса твина-80 и хлорида кальция выявляет липазу бактерий. Аналитическая чувствительность питательной среды «Shewanella IRHLS Agar» в сравнении с питательной средой «ГРМ-агар» составляла для бактерий S.algae, S.putrefaciens, S.baltica 1 - 2 КОЕ/ мл-1.Такую же высокую аналитическую чувствительность она имела для липазопозитивных бактерий Aeromonas caviae, Stenotrophomonas maltophilia, Serratia marcescens. При изучении на среде «Shewanella IRHLS Agar» посевов 30 штаммов бактерий, продуцирующих сероводород (по 5 штаммов S. enteritidis, S. typhimurium, P. vulgaris, P mirabilis, C. freundii, C. braakii) и 50 штаммов других 19 родов бактерий не выявлено ложноположительных результатов их идентификации как бактерий Shewanella , что подтверждает ее высокую аналитическую специфичность. При прямом посеве воды реки Невы на питательную среду «Shewanella IRHLS Agar» нами были выделены 72 штамма бактерий Shewanella (S. algae - 2, S. baltica - 26, S. putrefaciens - 44 штамма).Из них 91,7±3,2% штаммов продуцировали сероводород на среде Клиглера, что соответствует данным других авторов - 91 - 96% [4]. Концентрация шеванелл в воде Невы составляла 8 - 12 КОЕ/мл. Обращает на себя внимание выявление в Неве бактерий S.algae, которые были ранее обнаружены в акватории Балтийского моря другими авторами [5]. При прямых посевах клинического материала на данной питательной среде был выделен один штамм S.algae [2]. Питательная среда четко дифференцировала колонии бактерий Stenotrophomonas sp., Aeromonas sp., Serratia sp., Citrobacter sp., которые часто встречаются в клиническом материале, что позволяет использовать питательную среду комплексно для выделения этих групп бактерий и шеванелл. На указанную питательную среду получен патент РФ на изобретение [1].

About the authors

E. P Sivolodsky

Kirov Military-Medical Academy

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files