Evaluation of azoximer bromide (polyoxidonium) influence on the adhesive properties of the Yersinia pestis EV NIIEG vaccine strain by atomic force microscopy

T. N. Shchukovskaya; Щуковская Т. Н.; A. Y. Goncharova; Гончарова А. Ю.; S. A. Bugorkova; Бугоркова С. А.; P. S. Erokhin; Ерохин П. С.; O. M. Kudryavtseva; Кудрявцева О. М.

doi:10.36233/0372-9311-93

Оценка действия азоксимера бромида (полиоксидония) на адгезивные свойства вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ по данным атомно-силовой микроскопии

Авторы: Щуковская Т.Н.¹, Гончарова А.Ю.¹, Бугоркова С.А.¹, Ерохин П.С.¹, Кудрявцева О.М.¹
Учреждения:
1. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Выпуск: Том 98, № 3 (2021)
Страницы: 298-307
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 10.03.2021
Дата принятия к публикации: 10.03.2021
Дата публикации: 10.03.2021
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/998
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-93
ID: 998

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Изучить характер действия азоксимера бромида (полиоксидония, ПО) в условиях культивирования на морфометрические показатели и адгезивность вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных Y. pestis КМ218 (pYT–, pYV–, pYP–), Y. pestis КМ216 (pYT–, pYV–, pYP+), Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica с применением атомно-силовой микроскопии (АСМ), а также на адгезию клеток Y. pestis EV НИИЭГ к коллагену человека IV типа.

Материалы и методы. Измерения осуществляли с помощью сканирующего зондового микроскопа с использованием стандартных методов полуконтактной АСМ и программы анализа АСМ-изображений. Адгезию Y. pestis EV НИИЭГ к коллагену человека IV типа человека определяли по количеству клеток, прикрепившихся к стеклянным слайдам с коллагеном IV типа.

Результаты. Внесение ПО в среду культивирования вызывало достоверные изменения морфометрических параметров клеток Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных (увеличение объема, коэффициента уплощённости, индекса I), указывающих на повышение пластичности и снижение ригидности клеточной стенки. Данные изменения сопровождались трансформацией наномеханических свойств клеточной поверхности (снижением среднеквадратической шероховатости, силы адгезии), выраженность которых связана с плазмидным профилем. В меньшей степени понижение силы адгезии при отсутствии достоверных изменений индекса I наблюдалось у клеток Y. pseudotuberculosis I и IV сероваров, а также у бактерий Y. enterocolitica 09 серовара c плазмидой pYV+. У штамма Y. enterocolitica КМ383 (рYV−) ПО не индуцировал значимых изменений изучаемых показателей. Внесение ПО в среду культивирования приводило также к снижению способности клеток Y. pestis EV НИИЭГ прикрепляться к коллагену человека IV типа. Модификация ПО адгезивных свойств вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ сопровождалась повышением его иммуногенности.

Ключевые слова

Yersinia pestis, азоксимера бромид, бактериальная клетка, атомно-силовая микроскопия, морфометрический анализ, поверхностная структура

Полный текст

Введение

В развитии инфекционного процесса адгезия возбудителя к клеткам-мишеням, компонентам внеклеточного матрикса (ВКМ) играет ключевую роль, во многом определяя его начало, характер и течение [1][2][3]. Способность чумного микроба к адгезии обусловлена поверхностными структурами бактериальной клетки, которые могут быть представлены белками наружной мембраны — белком Ail, активатором плазминогена Pla, аутотранспортными белками различных классов YadB, YadC, Ilp; специализированными органеллами — пилями или фимбриями адгезии, образованными антигеном рH 6; наноразмерными везикулами внешней мембраны c включёнными белками Ail, Pla, капсульным антигеном F1 [4][5][6]. Наличие адгезинов способствует фиксации возбудителя чумы на поверхности эукариотических клеток, связыванию в различной степени с белками ВКМ ламинином, фибронектином, коллагеном IV типа, транслокации эффекторных белков в клетки-мишени, что обеспечивает уклонение от фагоцитоза и иммунологического распознавания организмом хозяина [1]. При снижении адгезивной активности штаммов чумного микроба разных подвидов зафиксировано повышение поглотительной способности фагоцитов у лабораторных животных [7].

В России синтезирован и внедрен в практику не имеющий аналогов за рубежом иммуноадъювант азоксимера бромид (полиоксидоний, ПО) — водорастворимое N-оксидированное производное полиэтиленпиперазина с молекулярной массой 80 кДa [8]. В условиях in vivo ПО обладает выраженным иммуномодулирующим, детоксицирующим, антиоксидантным, мембраностабилизирующим и антигенусиливающим эффектом, применяется в схеме терапии ряда инфекционных заболеваний как вирусной, так и бактериальной этиологии, входит в состав вакцин против гриппа [9][10].

Особенностью химической структуры ПО является наличие на поверхности его молекулы большого количества различных активных групп, которые могут взаимодействовать с белками поверхностных структур бактериальных клеток [8]. Имеется ряд сообщений об ингибирующем действии ПО на факторы персистенции патогенов. Установлено, что он изменяет адгезивные свойства патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов (Shigella flexneri, Salmonella enteritidis, Corynebacterium diphtheriae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, Candida albicans), снижает антилизоцимную и антикомплементарную активность микроорганизмов, повышает чувствительность ряда микроорганизмов к определенным антибиотикам групп линкозамидов, фторхинолонов, цефалоспоринов [11][12].

Для изучения адгезивных свойств микроорганизмов на современном уровне применяются методы бионанотехнологии, оперирующей наноразмерными объектами, среди которых особое место занимает атомно-силовая микроскопия (АСМ). АСМ принадлежит к семейству проксимальной зондовой микроскопии для анализа поверхности и ее свойств на атомно-молекулярном уровне, позволяет проводить одновременное исследование с субнанометровым пространственным разрешением локальных свойств клеточной стенки, в том числе жёсткости, пластичности и адгезивности [13][14].

Сведения о непосредственном влиянии адъювантов с иммуномодулирующим действием на биологические свойства возбудителей особо опасных заболеваний бактериальной этиологии, архитектонику их поверхностных структур, в том числе клеток вакцинных штаммов, отсутствуют.

Цель исследования — изучение влияния азоксимера бромида на морфометрические характеристики и адгезивность вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ и других представителей рода Yersinia (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica) с применением АСМ, а также характера действия на адгезию клеток Y. pestis EV НИИЭГ к белку ВКМ — коллагену IV типа.

Материалы и методы

В работе использованы полученные из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» вакцинный штамм Y. pestis ЕV НИИЭГ (pYT⁺, pYV⁺, pYP⁺) и его изогенные производные Y. pestis КМ218 (pYT^–, pYV^–, pYP^–), Y. pestis КМ216 (pYT^–, pYV^–, pYP⁺), штаммы Y. pseudotuberculosis I и IV сероваров, Y. enterocolitica КМ33(201) (pYV⁺) 09 серовара, Y. enterocolitica КМ383 (pYV^–) 09 серовара. Штаммы микроорганизмов культивировали при 28°С и 37°С для Y. enterocolitica в течение 48 ч на питательной среде агар LB по Miller рН (7,2 ± 0,1) как с добавлением 60 мкг/мл иммуноадъюванта ПО (терапевтическая концентрация при разовом введении человеку), так и без внесения в среду ПО. Из выращенных культур готовили взвеси в стерильном 0,9% растворе NaCl рН 7,2 по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-59-85П 10 единиц, эквивалентному 1 × 10⁹микробных клеток на 1 мл, которые обеззараживали 2,5% раствором глутарового альдегида в 0,1 молярном какодилатном буфере рН (7,2–7,4) в течение 2 ч при 4°С с последующей проверкой на специфическую стерильность. Для проведения АСМ обеззараженные и дважды отмытые в стерильной дистиллированной воде бактериальные клетки помещали на поверхность подложки (стерильное предметное стекло) и высушивали на воздухе.

Исследования проводили с помощью сканирующего зондового микроскопа «Solver P47-PRO» («NT-MDT», Россия) в режиме прерывистого контакта АСМ следующими методами: полуконтактным, рассогласования и отображения фазы, а также в режиме непрерывного контакта следующими методами: постоянной силы и АСМ-спектроскопии. Использовали кремниевые зонды серии NSG01 («NT-MDT») жесткостью 5,1 Н/м с радиусом кривизны 10 нм и резонансной частотой 150 кГц и CSG30 («NT-MDT») жесткостью 0,1 Н/м с радиусом кривизны 10 нм и резонансной частотой 48 кГц. Исследования проводили при оптимальных значениях основных параметров сканирования: амплитуда колебаний кантилевера Resonance 22 единицы, начальная фаза его колебаний Phase 240°, скорость сканирования Frequency 0,75 Гц, коэффициент усиления цепи обратной связи FB Gain 0,3 единицы, Set Point 19 единиц (величина Set Point и начальный уровень сигнала DFL определяли величину силы взаимодействия зонда с поверхностью образца).

Оценивали морфометрические показатели бактериальных клеток: длину (L), ширину (W), толщину (высоту, Н), площадь поперечного сечения (S) и объем (V); коэффициент вытянутости клетки (L/W), характеризующий ее форму; коэффициент уплощенности (S/H), характеризующий степень пластичности клетки; индекс (I) отношения ширины клетки к ее высоте (W/H), характеризующий степень ригидности клеточной стенки; показатель среднеквадратичной шероховатости поверхности (root mean square — RMS), рассчитываемый как среднеквадратичная величина отклонений размеров пиков и впадин от средней линии поверхности подложки; силу адгезии. Обработку и анализ АСМ-изображений не менее чем 30 бактериальных клеток в каждом образце проводили с использованием программного обеспечения «Image Analysis» («NT-MDT»).

Изучение действия ПО на адгезию клеток Y. pestis EV НИИЭГ к коллагену человека IV типа человека («Sigma-Aldrich», C7521) проводили по определению количества бактериальных клеток, прикрепившихся к стеклянным слайдам, предварительно обработанным раствором коллагена IV типа в фосфатно-солевом буфере рН 7,2 ± 0,1 концентрацией 20 мкг/мл [15]. Прикрепившиеся клетки фиксировали парами формальдегида, окрашивали кристаллвиолетом и подсчитывали с использованием микроскопа «Olimpus CX 31» с видеокамерой «JVC» в 20 полях зрения в 3 повторах при увеличении 900. Иммуногенность культур Y. pestis EV линии НИИЭГ, выращенных на питательной среде агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 с добавлением ПО и без, оценивали по уровню антител к капсульному антигену F1 чумного микроба в сыворотке крови мышей BALB/c на 21-е сутки после иммунизации подкожно дозой 2,5 × 10⁴колониеобразующих единиц (КОЕ).

Протокол исследований одобрен Комиссией по биоэтике при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 6 от 09.10.2019).

Определение антител проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением сертифицированной иммуноферментной тест-системы «ИФА-АТ-Ф1 YERSINIA PESTIS» рег. уд. № ФСР 2012/13946 — 101012 (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб») в строгом соответствии с инструкцией по применению. Учет оптической плотности осуществляли на микропланшетном фотометре «Stat Fax-3200» при длине волны 405 нм. Наличие антител в сыворотке определяли в 3 повторах и выражали в виде обратного среднегеометрического титра и его среднего квадратического отклонения.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel 2016», «Statistica 10.0» («StatSoft Inc.»). Взаимосвязь между переменными определяли с помощью рангового корреляционного анализа по Спирмену. Достоверность различий сравниваемых величин оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента. Данные представляли в виде М ± m, где М — среднее значение анализируемого показателя, m — средняя квадратическая ошибка средней арифметической. Значимость различий между группами оценивали с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни. Различия между группами наблюдения считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Выбор питательной среды агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 в качестве среды культивирования для изучения действия ПО на морфометрические характеристики и адгезивность вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и других представителей рода Yersinia обусловлен сравнительно близким по данным транскриптомного анализа характером роста чумного микроба в плазме крови человека [16], что позволяет более адекватно экстраполировать результаты исследований на процессы иммунопатогенеза в организме людей при чуме.

Полученные нами результаты экспериментальных исследований, представленные в табл. 1 и 2, свидетельствуют о непосредственном модифицирующем действии ПО на линейные параметры и адгезивные свойства бактериальных клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и других представителей рода Yersinia. На основании морфометрического анализа установлено достоверное увеличение объема клеток у штамма Y. pestis EV НИИЭГ в 1,62 раза и его изогенных производных Y. pestis КМ216 (pYT^–, pYV^–, pYP⁺), Y. pestis КМ218 (pYT^–, pYV^–, pYP^–) — в 1,7 и 1,18 раза соответственно (р ˂ 0,05) при культивировании на среде с ПО. Коэффициент уплощённости, характеризующий степень пластичности бактериальной клетки [17], также достоверно (р ˂ 0,05) увеличивался в 1,26 раза у клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, в 1,1 и 1,12 раза — у штаммов Y. pestis КМ216, Y. pestis КМ218 соответственно.

Таблица 1. Морфометрические показатели клеток микроорганизмов рода Yersinia при культивировании на среде агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 с добавлением ПО и без по данным АСМ (M ± m)
Table 1. Morphometric cell counts of microorganisms of the genus Yersinia in cultivation conditions on the medium LB agar, Miller pH 7,2 ± 0,1 with the addition of PO and without it according to atomic-force microscopy (M ± m)

Штаммы Strains	Среда Medium	Длина, мкм Length, pm	Ширина, мкм Width, pm	Высота, мкм Height, pm	Объем, мкм³Volume, pm³
Y. pestis EV НИИЭГ (pYT⁺, pYV⁺, pYP⁺) Y. pestis EV NIIEG	LB агар LB agar	1,6 ± 0,1	0,9 ± 0,1	0,36 ± 0,05	0,54 ± 0,02
	LB агар + ПО LB agar + PО	2,4 ± 0,1*	1,1 ± 0,1	0,32 ± 0,05	0,88 ± 0,02*
Y. pestis КМ216 (pYT^-, pYV^-, pYP⁺)	LB агар LB agar	1,9 ± 0,1	0,85 ± 0,1	0,35 ± 0,05	0,31 ± 0,01
Y. pestis КМ216 (pYT^-, pYV^-, pYP⁺)	LB агар + ПО LB agar + PО	2,1 ± 0,1	0,85 ± 0,1	0,29 ± 0,05	0,54 ± 0,02*
Y pestis КМ218 (pYT^-, pYV^-, pYP^-)	LB агар LB agar	2,4 ± 0,1	0,8 ± 0,1	0,25 ± 0,05	0,50 ± 0,02
Y pestis КМ218 (pYT^-, pYV^-, pYP^-)	LB агар + ПО LB agar + PО	2,5 ± 0,1	0,9 ± 0,1	0,25 ± 0,05	0,59 ± 0,02*
Y pseudotuberculosis I серовар I serovar	LB агар LB agar	1,5 ± 0,1	0,7 ± 0,1	0,35 ± 0,05	0,38 ± 0,02
Y pseudotuberculosis I серовар I serovar	LB агар + ПО LB agar + PО	1,4 ± 0,1	0,65 ± 0,1	0,30 ± 0,05	0,28 ± 0,01*
Y. pseudotuberculosis IV серовар IV serovar	LB агар LB agar	1,7 ± 0,1	0,7 ± 0,1	0,35 ± 0,05	0,43 ± 0,01
Y. pseudotuberculosis IV серовар IV serovar	LB агар + ПО LB agar + PО	1,9 ± 0,1	0,65 ± 0,05	0,30 ± 0,05	0,39 ± 0,02
Y enterocolitica КМ33(201) faYV⁺) 09 серовар 09 serovar	LB агар LB agar	1,4 ± 0,1	0,6 ± 0,1	0,25 ± 0,05	0,22 ± 0,01
Y enterocolitica КМ33(201) faYV⁺) 09 серовар 09 serovar	LB агар + ПО LB agar + PО	1,2 ± 0,1	0,6 ± 0,1	0,30 ± 0,05	0,23 ± 0,01
Y. enterocolitica КМ383(рYV^-) 09 серовар 09 serovar	LB агар LB agar	1,4 ± 0,1	0,6 ± 0,1	0,35 ± 0,05	0,26 ± 0,01
Y. enterocolitica КМ383(рYV^-) 09 серовар 09 serovar	LB агар + ПО LB agar + PО	1,4 ± 0,1	0,55 ± 0,1	0,30 ± 0,05	0,24 ± 0,01

Примечание. ⃰ р ˂ 0,05 по сравнению с параметрами при культивировании на LB агаре.
Note. *p < 0,05 in comparison with parameters when cultivating on LB agar.

Таблица 2. Морфо- и наномеханические показатели клеток микроорганизмов рода Yersinia при выращивании на среде агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 с ПО и без по данным АСМ (M ± m)
Table 2. Morpho- and nanomechanical cell surface properties of microorganisms of the genus Yersinia in cultivation conditions on the medium LB agar, Miller pH 7,2 ± 0,1 with PO and without it according to atomic-force microscopy (M ± m)

Штаммы Strains	Среда Medium	Индекс I Index I	SIH	RMS	Сила адгезии, нН Adhesion force, nN
Y. pestis EV НИИЭГ (pYT⁺, pYV⁺, pYP⁺) Y. pestis EV NIIEG	LB агар LB agar	2,5 ± 0,1	0,70 ± 0,02	33 ± 1	6,6 ± 0,1
	LB агар + ПО LB agar + PO	3,5 ± 0,1*	0,88 ± 0,03*	25 ± 1*	4,9 ± 0,1*
Y. pestis КМ216 (pYT^-, pYV^-, pYP⁺)	LB агар LB agar	2,4 ± 0,1	0,6 ± 0,02	37 ± 1	6,5 ± 0,1
Y. pestis КМ216 (pYT^-, pYV^-, pYP⁺)	LB агар + ПО LB agar + PO	2,9 ± 0,1*	0,67 ± 0,02*	27 ± 1*	5,0 ± 0,1*
Y. pestis КМ218 (pYT^-, pYV^-, pYP^-)	LB агар LB agar	3,2 ± 0,1	0,64 ± 0,02	30 ± 1	4,7 ± 0,1
Y. pestis КМ218 (pYT^-, pYV^-, pYP^-)	LB агар + ПО LB agar + PO	3,6 ± 0,1*	0,72 ± 0,02*	27 ± 1	4,2 ± 0,1*
Y. pseudotuberculosis Iсеровар I serovar	LB агар LB agar	2,0 ± 0,1	0,54 ± 0,02	35 ± 2	2,3 ± 0,1
Y. pseudotuberculosis Iсеровар I serovar	LB агар + ПО LB agar + PO	2,16 ± 0,10	0,50 ± 0,02	26 ± 1*	1,9 ± 0,1*
Y. pseudotuberculosis IV серовар IV serovar	LB агар LB agar	2,0 ± 0,1	0,54 ± 0,02	36 ± 2	2,7 ± 0,1
Y. pseudotuberculosis IV серовар IV serovar	LB агар + ПО LB agar + PO	2,16 ± 0,1	0,51 ± 0,02	27 ± 1*	2,1 ± 0,1*
Y. enterocolitica KM33(201) faYV⁺) 09 серовар 09 serovar	LB агар LB agar	2,4 ± 0,1*	0,48 ± 0,02	38 ± 2	3,5 ± 0,1
Y. enterocolitica KM33(201) faYV⁺) 09 серовар 09 serovar	LB агар + ПО LB agar + PO	2,0 ± 0,1	0,47 ± 0,02	35 ± 1	2,7 ± 0,1*
Y. enterocolitica KM383faYV^-) 09 серовар 09 serovar	LB агар LB agar	1,7 ± 0,1	0,48 ± 0,02	37 ± 2	2,3 ± 0,1
Y. enterocolitica KM383faYV^-) 09 серовар 09 serovar	LB агар + ПО LB agar + PO	1,8 ± 0,1	0,44 ± 0,02	33 ± 1	2,2 ± 0,1

Примечание. ⃰р ˂ 0,05 по сравнению с параметрами при культивировании на LB агаре.
Note. Index I — wight/length; S/H — square/height; RMS — root mean square. *p < 0,05 in comparison with parameters when cultivating on LB agar.

По данным АСМ зарегистрировано значимое (p < 0,05) влияние ПО на повышение индекса I, уменьшение в нанометровом диапазоне среднеквадратической шероховатости клеточной поверхности и силы адгезии у клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных с различным плазмидным составом.

Полученные нами результаты морфометрического анализа свидетельствуют, что введение ПО в состав среды культивирования приводит к увеличению пластичности и снижению ригидности клеточной стенки, среднеквадратической шероховатости клеточной поверхности, силы адгезии чумного микроба, наиболее выраженным у штамма Y. pestis EV НИИЭГ. Корреляционный анализ показал прямую зависимость увеличения коэффициента уплощенности, индекса I (r_S= 0,954‒0,979 при значении критерия Стьюдента t = 1,61–3,44) и обратную зависимость — для среднеквадратической шероховатости клеточной поверхности и силы адгезии (r_S= −(0,967–0,984) при значении критерия Стьюдента t = 1,93–3,52), что свидетельствовало о функциональной связи выявленных изменений морфометрических показателей с присутствием ПО в среде культивирования. В меньшей степени снижение силы адгезии при отсутствии достоверных изменений индекса I под действием ПО наблюдалось у клеток Y. pseudotuberculosis I и IV сероваров, а также у бактерий Y. enterocolitica 09 серовара c плазмидой pYV⁺. У штамма Y. enterocolitica КМ 383 (рYV^–) 09 серовара при культивировании на среде с ПО не выявлено значимых изменений морфометрических показателей бактериальных клеток и наномеханических свойств их поверхности. Параллельно с определением характера действия ПО на морфометрические характеристики и адгезивность вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ с применением АСМ нами изучено влияние данного иммуноадъюванта на адгезию клеток Y. pestis EV НИИЭГ к белку ВКМ — коллагену человека IV типа. Коллаген IV типа является ключевым структурным компонентом базальных мембран сосудистого эндотелия и слизистых оболочек. Молекула коллагена IV типа служит лигандом для интегринов, рецепторов на поверхности клеток, обеспечивая клеточную адгезию, миграцию и дифференцировку [18][19]. Установлено, что введение ПО в состав среды культивирования приводит к достоверному (p < 0,05) уменьшению количества клеток Y. pestis EV НИИЭГ, прикрепившихся к коллагену человека IV типа по сравнению с культивированием на среде без ПО — 68 ± 4,75 и 96 ± 10,5 микробных клеток соответственно. В то же время мало выраженная по силе отрицательная корреляция (r_S= −0,4755; р = 0,04) свидетельствует о второстепенном значении компонента ВКМ коллагена IV типа в качестве мишени в механизме действия ПО на адгезивность клеток Y. pestis EV НИИЭГ.

Модификация ПО адгезивных свойств вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ сопровождалась изменением его иммуногенности в сторону повышения. Характеристики антигенной активности культур Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных на питательной среде агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 с добавлением ПО и без него, представлены в табл. 3.

Таблица 3. Титры антител к капсульному антигену F1 чумного микроба в сыворотке крови мышей BALB/c, вакцинированных Y. pestis EV линии НИИЭГ в условиях культивирования на среде агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 с добавлением ПО и без (M ± m)
Table 3. Antibody titers to Y. pestis F1 capsule antigen in serum BALB/c mice vaccinated with Y. pestis EV NIIEG cultivated on LB agar, Miller pH 7,2 ± 0,1 with the addition of PO and without it (M ± m)

Иммунизирующий штамм, доза (КОЕ) Strain used for immunization, dose (CFU)	Количество животных Number of animals	Реципрокные значения среднегеометрического титра Geometric mean reciprocal titers
Y pestis EV НИИЭГ (LB агар, Miller рН 7,2) Y pestis EV NIIEG (LB agar, Miller рН 7,2) 2,5 × 10⁴	10	76 ± 35,43
Y pestis EV НИИЭГ (LB агар, Miller рН 7,2 + ПО) Y pestis EV NIIEG (LB agar, Miller рН 7,2 + PO) 2,5 × 10⁴	10	136 ± 36,6*
0,9% NaCl	10	< 40

Примечание. *р < 0,05 по отношению к группе сравнения, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ.
Note. p < 0.05 in comparison with mice immunized with Y. pestis EV NIIEG.

Установлено, что уровень антител к капсульному антигену чумного микроба F1 в 1,7 раза выше в группе животных, иммунизированных вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ, выращенным на питательной среде с ПО.

Обсуждение

Известно, что адгезины патогенных иерсиний действуют на разных стадиях инфекционного процесса, выполняют множественные функции, не только участвуют в процессах прикрепления к клеткам хозяина, но и связаны с проявлением таких свойств, как инвазия, персистенция, выживание в клетках хозяина, биопленкообразование, цитотоксичность [20]. Адгезия бактериальных клеток к контактирующим поверхностям может реализовываться за счет формирования нескольких типов связей, различных по природе и специфичности. К ним относятся неспецифические физико-химические связи, такие как силы Ван-дер-Ваальса, электростатические, гидрофобные, стерические, водородные связи, а также специфические лиганд-рецепторные взаимодействия между поверхностными структурами бактерий (адгезинами) и рецепторами клеток-мишеней организма хозяина [21][22]. АСМ позволяет получить 3D изображения единичных бактериальных клеток и их поверхностных ультраструктур, проводить точную морфометрическую оценку их основных параметров, исследовать молекулярные (гидрофобные и электростатические) взаимодействия на поверхности бактерий, картировать физико-химические свойства, измерять ригидность клеточной стенки и адгезивные свойства клеточной поверхности [23][24]. Результаты нашего исследования показали, что введение ПО в состав среды культивирования приводило к достоверным изменениям индикаторных морфометрических параметров клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV линии НИИЭГ (увеличению объема, коэффициента уплощенности, индекса I), указывающих на повышение пластичности и снижение ригидности клеточной стенки. Выявленные изменения морфометрических показателей сопровождались трансформацией наномеханических свойств клеточной поверхности (снижением среднеквадратической шероховатости, силы адгезии) бактерий Y. pestis EV НИИЭГ, что свидетельствует о присутствии молекулярных мишеней для ПО на наружной мембране чумного микроба.

Биологические функции напрямую связаны с составом и организацией микробной поверхности. Ряд идентифицированных белков наружной мембраны патогенных иерсиний, функции которых определяют адгезию микробных клеток к структурным компонентам хозяина, относятся к аутотранспортным белкам или системе секреции V типа. Патогенные виды рода Yersinia экспрессируют аутотранспортные белки типов Va, Vc и Ve [4]. YadA — многофункциональный белок наружной мембраны Y. pseudotuberculosis и Y. enterocоlitica, относящийся к адгезинам типа Vc и кодируемый плазмидой вирулентности pYV (pCad). Помимо осуществления основной функции — адгезии бактерий, YadA участвует в процессах аутоагглютинации, инвазии, устойчивости к фагоцитозу, бактерицидному действию сыворотки. Интенсивность биосинтеза YadA возрастает при 37°С, обеспечивая покрытие этим белком значительной части поверхности микробной клетки [20]. Как показали результаты настоящего исследования, ПО, по-видимому, может оказывать ингибирующее действие на продукцию белка YadA, на что указывают значимое снижение силы адгезии у бактериальных клеток штамма Y. enterocolitica КМ-33(201) 09 серовара c плазмидой pYV (pCad⁺) при отсутствии таковых у Y. enterocolitica КМ 383 (pYV^–) 09 серовара в одинаковых условиях культивирования на среде с ПО при 37°С.

Одним из факторов адгезии возбудителя чумы является активатор плазминогена Pla, принадлежащий к семейству сериновых протеаз наружных мембран энтеробактерий и кодируемый видоспецифичной плазмидой pYP (pPla, pPCP1 или pPst). Четвертичная структура белка представлена 5 периплазматическими и 5 внеклеточными петлями, выступающими в межклеточное пространство на расстояние около 40 Å от липидного бислоя наружной мембраны. Белок Pla Y. pestis, помимо активации плазминогена и превращения его в плазмин путем ограниченного протеолиза, способен к гидролизу C3 компонента комплемента, протеолитическому инактивированию антимикробного пептида — кателицидина LL-37, а также TNF-α, IFN-γ, IL-8 и протеина 1 хемотаксиса моноцитов [25][26]. Сравнительный анализ полученных нами данных АСМ штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ и его изогенных производных показал, что у безплазмидного штамма Y. pestis КМ218 (pYT^–, pYV^–, pYP^–) значение силы адгезии достоверно (p < 0,05) меньше таковых, измеренных для клеток штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ (pYT⁺, pYP⁺, pYV⁺) и штамма Y. pestis КМ216, имеющего только одну плазмиду pYP. Введение ПО в состав среды культивирования приводило к значимому снижению показателя среднеквадратичной шероховатости поверхности и силы адгезии у клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных, выраженность проявлений которых зависела от плазмидного профиля. У штамма Y. pestis КМ218, утратившего плазмиды pYP, pYV и pYT, зарегистрированы наиболее низкие исходные показатели адгезивных свойств клеточной поверхности бактерий и наименее значимые их изменения под действием ПО.

Активатор плазминогена Pla также может избирательно связываться с белками ВКМ и базальными мембранами (ламинином, коллагеном IV типа), обеспечивая тем самым уклонение от захвата профессиональными фагоцитами хозяина в мало доступных лейкоцитам местах [25][27]. Нами установлено, что введение ПО в состав среды культивирования приводило к снижению способности клеток Y. pestis EV НИИЭГ прикрепляться к коллагену человека IV типа — ключевому структурному компоненту базальных мембран сосудистого эндотелия и слизистых оболочек.

Как известно, липополисахарид (ЛПС) представляет собой сигнальную молекулу, распознаваемую системой врожденного иммунитета и обеспечивающую её активацию на самых ранних стадиях вакцинального процесса. Антигенпрезентирующие клетки (дендритные, клетки Лангерганса) организма хозяина экспрессируют на своей поверхности лектиновые рецепторы DC-SIGN (DC-specific intercellular adhesion molecule-grabbing nonintegrin receptor) или CD209 и лангерин (CD207), которые могут связываться непосредственно с коровой областью ЛПС Y. pestis [28]. CD209 представлен также на поверхности макрофагов, включая альвеолярные макрофаги человека [29]. С помощью атомно-силовой спектроскопии с использованием оптической ловушки показано непосредственное участие в связывании с мембраной макрофага коровой области ЛПС Y. pestis вакцинного штамма EV НИИЭГ [30]. Установлено, что при 28°С синтезируется гекса-ацилированная форма липида А ЛПС Y. pestis со стимулирующей паттернраспознающий TLR4/ MD2-рецептор активностью, имеющей важное значение в инициации формирования антибактериального адаптивного иммунитета [31][32]. По данным S. Montminy и соавт. [33], мутант вирулентного штамма Y. pestis KIM1001-pLpxL с конститутивным синтезом гексагональной формы липида А утрачивал вирулентность для биопробных животных при наличии всех известных детерминант вирулентности и индуцировал формирование защиты в эксперименте от бубонной и легочной форм чумы. В нашей работе зарегистрировано повышение иммуногенных свойств культур вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных на питательной среде с добавлением ПО при 28°С. По-видимому, особенность химической структуры ПО (сополимер N-окси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбокси)- 1,4-этиленпиперазиния бромида), связанной с наличием N-оксидных и карбоксильных групп, может способствовать изменению экспрессии адгезинов на клеточной поверхности и повышению функциональной активности гекса-ацилированного ЛПС за счет уменьшения его экранирования и изменения пространственной ориентации. Также результаты настоящего исследования свидетельствуют о возможной связи направленности трансформирующего действия ПО наномеханических свойств клеточной поверхности (среднеквадратической шероховатости, силы адгезии) со снижением биосинтеза адгезинов, кодируемых плазмидой pYP у вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и плазмидой pYV у штаммов других представителей рода Yersinia (Y. pseudotuberculosis I и IV сероваров, Y. enterocolitica 09 серовара). Вопрос о молекулярных механизмах этого воздействия и связи с защитной эффективностью вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ от чумной инфекции является предметом дальнейших исследований.