Allergy vaccines for specific immunotherapy

Full Text

Введение

IgE-опосредованные аллергические заболевания занимают важное место среди болезней человека [1]. Аллергенспецифическая иммунотерапия (АСИТ) является единственным примером лечения, воздействующего на патогенетические звенья IgE-опосредованного аллергического процесса с длительным профилактическим эффектом после завершения лечебных курсов [2].

В последние два десятилетия появилось множество экспериментальных исследований по созданию и изучению аллергенсодержащих вакцин, предназначенных для АСИТ. Данное обстоятельство диктует необходимость систематизации и анализа значительного информационного потока научных публикаций на эту тему.

Целью настоящего обзора является ознакомление читателей с новыми лечебными аллергенсодержащими вакцинами, особенностями их строения и иммунологическим воздействием на организм.

Лекарственные формы, основанные на нативных аллергенах

Нативные водно-солевые экстракты аллергенов (ВСА) используются при АСИТ более 100 лет и полностью доказали свою эффективность [3][4]. Однако терапия ВСА не является безопасной и удобной. При АСИТ данными аллергенами существует вероятность возникновения множества системных и местных побочных эффектов, вплоть до анафилактического шока. АСИТ нативными экстрактами занимает много времени у пациента и врача и требует максимального контроля [2][5][6].

Для снижения аллергенности и увеличения иммуногенности ВСА методом полимеризации формальдегидом или глутаральдегидом были созданы химически модифицированные формы лечебных препаратов аллергенов. Такие препараты были названы аллергоидами [2][6][7]. Полагают, что усиление иммуногенности аллергоида связано с увеличением его молекулярной массы и наличием в нём более жёстких внутримолекулярных связей [8], а снижение аллергенности — с блокадой его IgE-связывающих эпитопов альдегидными группами [8].

Существуют аллергоиды и для сублингвальной иммунотерапии. Они могут быть получены путем обработки аллергенных экстрактов янтарным и малеиновым ангидридами, цианатом калия [6]. Низкая молекулярная масса данных мономерных аллергоидов позволяет им всасываться через слизистые оболочки [7]. В настоящее время некоторые из аллергоидов эффективно используются в клинической практике [7][9]. В фазе клинических испытаний в России находятся конъюгированные формы аллергоидов с полиоксидонием — аллерготропины. Иммуногенность аллерготропинов подтверждена как на лабораторных животных, так и на добровольцах [2][8].

Несмотря на значительные успехи науки в совершенствовании препаратов лечебных аллергенов, получаемых из природного сырья, многие проблемы до конца решить не удалось. Прежде всего это проблемы, связанные с недостаточным качеством и высокой аллергенной активностью [9][10][11]. Риск системных побочных эффектов сохраняется и у аллергоидов [7, 9], и у аллерготропинов [8].

Рекомбинантные аллергены

Широкое внедрение рекомбинантных технологий в производство белков аллергенов открыло новые возможности перед АСИТ. На современном этапе развития технологии рекомбинантной ДНК можно получать безопасные вакцины против аллергии, которые позволяют преодолеть многие, если не все, проблемы, связанные с использованием натуральных экстрактов аллергенов. Возможности генетических модификаций полученных рекомбинантных аллергенных молекул здесь поистине безграничны [10–16].

Наиболее перспективными к дальнейшим разработкам для практического применения признаны три направления в модификации рекомбинантных аллергенов:

• гипоаллергенные производные рекомбинантных аллергенов;
• вакцины, состоящие из Т-клеточных эпитопов;
• вакцины, состоящие из В-клеточных эпитопов и высокоиммуногенных белков-носителей.

Гипоаллергенные производные рекомбинантных аллергенов

Создания гипоаллергенных производных рекомбинантных аллергенов добиваются конформационным изменением белковой молекулы, удалением, разрушением или трансформацией аминокислот или пептидов, участвующих в связывании IgE [11][12], а также изменением структуры аллергена путем замены последовательности аминокислот и фрагментацией белка [11].

Смысл вакцинации гипоаллергенными производными рекомбинантных аллергенов в том, что формирование IgG при иммунном ответе возможно к любым 5–8 гидрофильным пептидам длиной 10– 15 аминокислот на поверхностно экспонированном участке дикого аллергена. Это связано с тем, что в организме имеется большое разнообразие В-клеточных рецепторов, за счет чего в норме иммунная система может распознавать все имеющиеся в природе патогены. Специфичность и аффинность продуцируемых ими антител по ходу иммунного ответа возрастает. Вырабатываемые в результате иммунизации IgG блокируют связывание природного аллергена с IgE у пациентов с аллергией [17].

Положительные стороны вакцинации гипоаллергенными производными рекомбинантных аллергенов:

а) отсутствие или снижение IgE-опосредованных реакций немедленного типа при проведении иммунотерапии;

б) способность вызывать при иммунизации аллергенспецифический IgG-ответ к природному аллергену, несмотря на то что гипоаллергенные фрагменты белков теряют часть нативной структуры [11][12][18–20].

Отрицательной стороной данной вакцинации является возможность индукции аллергического воспаления клеточного типа [11, 12, 18]

Вакцины, содержащие антигены с Т-клеточными эпитопами

Разработка данных вакцин затруднительна, т.к. главный комплекс гистосовместимости (МНС) имеет высокую степень полиморфизма, а последнее, как известно, осложняет его связывание с Т-клеточными эпитопами [21][22].

Однако эта проблема решаема. Обнаружено, что различные молекулы человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) могут связывать сходные аминокислотные последовательности пептидов, что позволило исследователям объединить их в группы, известные как супертипы HLA [23][24]. Кроме того, существуют универсальные пептиды, способные связываться с несколькими супертипами HLA. Последним и отдаётся предпочтение при создании вакцин [20]. Данные стратегии позволяют использовать ограниченное число пептидов для разработки вакцин, содержащих антигены Т-клеточных эпитопов [21–24]. Функционально иммунодоминантные пептиды идентифицируют in vitro по их способности приводить к пролиферации и секреции цитокинов (интерферон-γ, IL-10 и IL-13) и по их сниженной или отсутствующей способности связывать IgE [23].

Поиски многих исследователей акцентируются на обнаружении привязки отдельного Т-эпитопа аллергена к выработке определённого интерлейкина, что могло бы целенаправленно искажать иммунный ответ [21, 22]. Хотя уже имеются данные о том, что некоторые CD4-Т-клеточные эпитопы стимулируют специфические подмножества Th [21]. Прошедшие такой двойной отбор Т-эпитопы и составляют основу пептидов, входящих в вакцину. Данные пептиды — это рекомбинантно синтезированные молекулы, представляющие собой иммунодоминантные Т-эпитопы, перекрывающиеся по связыванию с супертипами HLA [23]. Смысл стратегии в том, что вакцинация данными Т-клеточными эпитопами аллергенов приводит к индукции Т-клеточной толерантности, механизм которой до конца не изучен. Возможно, толерантность связана с влияниями Тreg, продукцией интерлейкина-10, дальнейшим повышением соотношения Th1/Th2 и последующим долгосрочным эффектом [18, 22, 23, 25].

При проведении иммунотерапии Т-эпитопами препаратов аллергенов В-клетки остаются интактными. В некоторых исследованиях все же отмечают индукцию аллергенспецифических IgG на вакцины, содержащие антигены с Т-клеточными эпитопами. Данный факт свидетельствует о наличии сохраненных В-эпитопов в данных вакцинах [18, 26].

Положительные стороны вакцинации аллергенами с Т-клеточными эпитопами:

а) отсутствие IgE-зависимых реакций немедленного типа при проведении иммунотерапии [18][27][28];

б) изменение экспрессии цитокинов, свидетельствующее о нарастании Т-клеточной толерантности [18][25][29];

в) устойчивые клинические преимущества после относительно короткого курса лечения по сравнению с использующимися в настоящее время в медицинской практике АСИТ и сублингвальной иммунотерапией [25, 30, 31]. 

Отрицательные стороны данной вакцинации — возможность индукции аллергического воспаления клеточного типа [16][18][21].

Примером исследования возможности рекомбинантной вакцины, содержащей антигены с Т-клеточными эпитопами, целенаправленно искажать иммунный ответ может служить изучение 5 коротких пептидов, полученных из основного аллергена пыльцы оливы. Эти пептиды были определены как иммунодоминантные и как возможные иммунорегуляторные Т-клеточные эпитопы. Доклинические испытания с кровью пациентов, страдающих IgE-опосредованными реакциями на пыльцу оливы, выявили полное отсутствие способности индуцировать активацию базофилов in vitro у всех 5 пептидов в различных комбинациях. У 2 из исследуемых пептидов отмечена 30% способность ингибировать пролиферативный ответ к экстракту аллергена. В ответ на эти 2 пептида обнаружена статистически значимая секреция интерлейкина-10 и -35 в культуре мононуклеаров аллергических больных, что доказывает их иммунорегуляторную способность [32]. Следовательно, два вышеуказанных пептида являются наиболее предпочтительными кандидатами для вакцинации и формирования толерантности к аллергенам у пациентов.

Вакцины, содержащие антигены В-клеточных эпитопов и высокоиммуногенных белков-носителей

Для создания данных вакцин гипоаллергенные пептиды В-клеточных эпитопов сшиваются с неаллергенными и высокоиммуногенными белками-носителями. Такая технология позволяет получить вакцину, способную индуцировать контролируемый протективный гуморальный IgG-опосредованный иммунный ответ против как нативного аллергена, так и белка-носителя [11][12][17][18][33–37]. Механизм иммунного ответа при данной вакцинации основан на принципе гаптен–носитель [11][38][39]. Рецептор В-клетки (BCR) специфически узнаёт и связывает сохранившуюся часть В-эпитопа аллергена. В-клетка процессирует и представляет Т-хелперу белковую гибридную молекулу в виде пептида белка-носителя, что способствует продукции IgG-антител [11][38][39].

Положительные стороны вакцинации аллергенами с В-клеточными эпитопами:

а) не происходит системных анафилактических и поздних Т-клеточных реакций [21][36][39];

б) вырабатываются блокирующие IgG-антитела к нативному аллергену [11][34][36][39].

Подобный тип вакцин способствует формированию комбинированного иммунного ответа на аллерген и белок-носитель [17][39].

Интересна по своей структуре рекомбинантная, основанная на В-клеточных эпитопах вакцина BM32 для АСИТ. Эта вакцина, адсорбированная на гидроксиде алюминия, содержит рекомбинантные, сшитые аллерген-производные белки. Они состоят из неаллергенных пептидов В-клеточных эпитопов: четырёх основных главных аллергенов пыльцы тимофеевки и поверхностного белка гепатита В домена PreS. Проведено рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование данной вакцины. Двухлетняя АСИТ, состоящая из 2 курсов 3 предсезонных инъекций BM32 и 1 инъекции после сезона пыления тимофеевки, индуцировала IgG4-ответ, более выраженный после 2-го года терапии. В результате проведения АСИТ ВМ32 у пациентов отсутствовали аллергенспецифические провоспалительные цитокиновые реакции и был снижен уровень специфического IgE, индуцированного сезонным воздействием пыльцы. Кроме того, отмечено улучшение клинического состояния пациентов и отсутствие усиления Т-клеточных реакций против нативных аллергенов пыльцы травы [2, 40, 41].

Капсулированные аллергены

Некоторые созданные учёными вакцины трудно отнести к описанным в данном обзоре направлениям. При этом они обещают быть очень перспективными при АСИТ. Возможно, механизм воздействия данных лечебных аллергенов отличается от механизма действия вышеперечисленных вакцин и необходимы дополнительные исследования для его понимания. В данных лечебных аллергенах поверхностные структуры белка экранированы, что препятствует связыванию аллергена как с иммуноглобулинами, так и с В-клетками [42][43]. Такой препарат не вызывает IgE-опосредованных аллергических реакций [42][44], но успешно захватывается антигенпрезентирующими клетками. Он содержит полный набор Т-эпитопов аллергена и, следовательно, может вызывать при иммунотерапии изменение характера иммунного ответа [44][45].

Примером таких вакцин является капсулированный рекомбинантный клещевой аллерген, созданный в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Рекомбинантные белки домашних пылевых клещей Dermatophagoides farinae (Der f 1 и Der f 2) погружали в хитозановый матрикс и затем формировали полимерную оболочку. Полученные наночастицы типа ядро–оболочка позволяли экранировать от распознавания специфичными антителами содержащиеся в них рекомбинантные белки [43][44]. С помощью сывороток больных с клещевой сенсибилизацией доказано, что полученная вакцина не связывает аллергенспецифические IgE-антитела [44]. Удобный размер наночастиц 90–140 нм обеспечивает их быстрый и полный фагоцитоз, что является необходимым условием как для иммуногенности аллергена, так и для его безопасности [44]. Клеточный ответ на данный капсулированный аллерген, оцениваемый по пролиферации спленоцитов иммунизированных мышей [43][44], и IgG-ответ сопоставимы с ответами на рекомбинантный белок [44]. По окончании экспериментального и клинического изучения разрабатываемый препарат может быть в дальнейшем использован для АСИТ в более высоких концентрациях, чем нативные аллергены, что приведет к сокращению срока лечения [44]. Вероятно, капсулированный аллерген сохраняет часть антигенных детерминант, необходимых для связывания с В-клеткой, о чем свидетельствуют модельные эксперименты по формированию IgG-ответа.

ДНК-вакцины

Вакцинация ДНК имеет большой потенциал как эффективное профилактическое и терапевтическое решение для АСИТ [2]. ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами, включая низкую стоимость, простоту разработки и производства, удобство введения. Они эффективны в индукции CD4⁺- и CD8⁺-Т-клеточного иммунитета и гуморальных иммунных реакций на многих животных моделях [46–49]. Для получения ДНК-вакцины требуется встроить ген, кодирующий интересующий белок, в специальный плазмидный вектор [46]. Длительное время плазмида существует в ядре клетки в виде эписомы, не встраиваясь в геном, и поддерживает синтез кодируемых ею белков в течение недель или месяцев [46]. Синтезированные антигены обрабатываются в протеасомах и подвергаются презентации цитотоксическим Т-лимфоцитам (CD8⁺), что формирует соответствующий характер цитокиновой регуляции иммунного ответа [38]. Благодаря доминирующему цитокиновому окружению и характеру презентации антигена МНСI происходит клональная экспансия цитотоксических Т-лимфоцитов, Тh0-клетки трансформируются в Тh1-клетки, продуцирующие γ-интерферон и ИЛ-2 [2][46]. При существующем сниженном соотношении Тh1/Тh2 у пациентов с IgE-опосредованными аллергическими реакциями это должно способствовать изменению иммунологического реагирования на аллерген и синтезу специфических IgG [47]. Однако в многочисленных исследованиях после ДНК-вакцинации часто обнаруживают низкую выработку антител у людей и крупных животных [48].

Для усиления иммуногенности ДНК-вакцин используются различные способы [48–50]. Рассмотрим основное решение данной проблемы на примере разработки препарата из ДНК иммунодоминантных эпитопов аллергенов пыльцы японского кедра CryJ1 или CryJ2 в конструкции с лизосомально-ассоциированным мембранным протеином (LAMP-1), который является резидентным белком лизосомы. Включение лизосомальных векторных последовательностей LAMP-1 в плазмиды ДНК направляет синтезированный в антигенпрезентирующих клетках антиген из протеасомного пути в лизосомный путь, в результате чего аллерген в комплексе с МНСII представляется на их мембране CD4⁺-лимфоциту, что значительно усиливает иммуногенность данных антигенов. Целевое направление белков на деградацию в лизосомы уменьшает секрецию клетками аллергена в межклеточное пространство и тем самым снижает вероятность аллергических реакций. Для проверки иммунологического эффекта вакцин CryJ-LAMP ими иммунизировали мышей, что привело к высоким уровням анти-CryJ1- или анти-CryJ2-IgG2a-антител и умеренным уровням IgG1-антител, а также к низким уровням IgE-антител. Экспериментальные результаты также доказали, что вакцинация CryJ2-LAMP может подавлять активацию и/или функцию базофилов и индуцировать CD4⁺-T-клеточную память. При этом ДНК-вакцина сохраняет эффективность в стимуляции сильного ответа CD8⁺ -T-клеток, что связано, скорее всего, с возможностью обработки части аллергена в протеасомах и последующего представления его MHCI. Данный факт способствует выработке высоких уровней γ-интерферона и, соответственно, искажению иммунного ответа в сторону Тh1. Интересно, что на экспериментальных моделях в этом исследовании доказано, что иммунологические эффекты данных ДНК-вакцин не связаны с классическим механизмом действия АСИТ, а именно с Тreg-клетками и интерлейкином-10 [51]. Хотя существуют исследования, где ДНК-вакцина, в которой также использовали лизосомально-ассоциированный мембранный протеин, индуцировала Тreg-клетки [52]. Изучение ДНК-вакцин при атопических состояниях проводят как для решения вопроса о возможности лечения уже сформировавшихся аллергических реакций, так и для профилактики сенсибилизации пациентов с атопией к новым аллергенам [52][53].

Заключение

Подводя итог анализируемым исследованиям, представленным в литературе, необходимо отметить высокую гетерогенность дизайнов создания новых современных аллергенсодержащих вакцин. При этом все же нам удалось выявить основные сильные и слабые стороны трёх основных направлений в модификации рекомбинантных аллергенов. Все представленные в обзоре аллергенсодержащие вакцины решают поставленные исследователями задачи: в экспериментальных моделях на животных они формируют иммуногенность или толерантность, в клинических испытаниях снижают симптомы аллергических реакций. Оценка эффективности предлагаемых лечебных препаратов довольно высока, но требует дальнейших длительных доклинических и клинических испытаний для подтверждения безопасности и безвредности созданных аллергенсодержащих вакцин. Что же касается ДНК-вакцин, то даже при новых подходах к вакцинации, описанных нами ранее, для подтверждения их иммунотерапевтической значимости необходимы доклинические испытания на приматах.

Таким образом, современные препараты аллергенов, находящиеся на доклинических и клинических стадиях разработки и исследований, в большинстве случаев резко снижают системные побочные реакции и обладают эффективностью, а также позволяют победить ещё одну из самых непростых проблем АСИТ — длительность и многократность курсов лечения [31][32][44][54]. 

About the authors

S. Yu. Petrova

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: laball@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3034-0148

Stanislava Yu. Petrova — Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Laboratory of allergens

Moscow

Russian Federation

S. V. Khlgatian

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8354-7682

Svetlana V. Khlgatian — D. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of allergens

Moscow

Russian Federation

V. M. Berzhets

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5055-7593

Valentina M. Berzhets — D. Sci. (Biol.), Prof., Head, Laboratory of allergens

Moscow

Russian Federation

A. V. Vasileva

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7703-2698

Anna V. Vasilyeva — researcher, Laboratory of allergens

Moscow

Russian Federation

References

Supplementary files