Отправить статью по E-mail Генетическое типирование штаммов Vibrio cholerae биовара El Tor, выделенных на территории Кавказа в период 1970–1998 гг., с применением MLVA-5 и wgSNP
- Авторы: Ковалев Д.А.1, Шапаков Н.А.1, Писаренко С.В.1, Савельева И.В.1, Васильева О.В.1, Савельев В.Н.1, Сирица Ю.В.1, Жиров А.М.1, Ульшина Д.В.1, Кузнецова И.В.1, Бобрышева О.В.1, Куличенко А.Н.1
-
Учреждения:
- Ставропольский противочумный институт
- Выпуск: Том 98, № 1 (2021)
- Страницы: 46-58
- Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Дата подачи: 03.03.2021
- Дата принятия к публикации: 03.03.2021
- Дата публикации: 03.03.2021
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/987
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-29
- ID: 987
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Цель. Филогенетический анализ штаммов Vibrio cholerae O1 биовара El Tor, выделенных в разные годы на территории Кавказа, с использованием мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов (MLVA) и полногеномного анализа распределения единичных нуклеотидных полиморфизмов (wgSNP).
Материалы и методы. Объектами исследования служили геномные последовательности 16 клинических штаммов V. cholerae O1 биовара El Tor из коллекции Ставропольского противочумного института, выделенных на территории Кавказа с 1970 по 1998 г., а также 87 полногеномных последовательностей V. cholerae из базы данных NCBI. MLVA проводили по 5 VNTR-локусам. Полногеномное секвенирование осуществляли на платформе «Ion Torrent PGM».
Результаты. Исследуемые штаммы относятся к 15 MLVA-типам и делятся на 3 группы в составе одного кластера. Осуществлен анализ структуры основных островов вирулентности и патогенности, а также нуклеотидных полиморфизмов в генах ctxB, tcpA и RstR. Проведен филогенетический анализ штаммов на основе wgSNP-типирования, описаны SNP, специфичные для каждой филогенетической группы.
Заключение. Установлено поликлональное происхождение генетически измененных вариантов V. cholerae O1 биовара El Tor. Определено место штаммов V. cholerae биовара El Tor, выделенных с 1970 по 1998 г. на территории Кавказа, в глобальной популяции возбудителя. Показано, что в указанный период на территории Кавказа циркулировали штаммы, принадлежащие к 1-й и 2-й волнам 7-й пандемии холеры. Подтверждено, что случаи холеры на Кавказе являются завозными с территории эндемичных стран, определены наиболее вероятные источники инфекции.
Ключевые слова
Полный текст
Введение
Возбудитель холеры (V. cholerae O1, сtxA+) вызывает особо опасное острое инфекционное заболевание. Эпидемиологический надзор за холерой осуществляется в соответствии с Международными медико-санитарными правилами [1]. Согласно принятой классификации внутри вида V. cholerae выделяют 3 эпидемически опасных варианта: холерные вибрионы серогруппы О1 (биовары classical и El Tor) и О139.
Исторически выделяют 7 пандемий холеры: возбудителем первых шести считается V. cholerae классического биовара, но с 1961 г. произошла смена биовара на El Tor, явившийся причиной 7-й пандемии, продолжающейся до настоящего времени. Начиная с 1991 г. по всему миру распространились генетически измененные высокопатогенные геноварианты V. cholerae О1 биовара El Tor [2][3].
Вспышки холеры, вызванные заносом инфекции, неоднократно фиксировались на территории Кавказа. Так, с начала 1970-х гг. в данном регионе было зарегистрировано несколько вспышек и эпидемий холеры: в 1970 г. — в Республике Дагестан, в 1985–1989 гг. — в Азербайджане, в 1990 г. — в Ставрополе, в 1994–1998 гг. — в Республике Дагестан [4][5][6].
Современные молекулярно-генетические методы исследования позволяют ретроспективно охарактеризовать геном штаммов возбудителя инфекции, вызвавших случаи заболевания холерой на различных территориях.
В последние годы для определения степени родства групп или отдельных штаммов V. cholerae [7][8][9] и типирования изолятов, выделенных как от людей во время вспышек, так и из объектов окружающей среды [10][11][12], широко применяется метод мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов (MLVA).
Один из актуальных методов генотипирования V. cholerae — определение единичных нуклеотидных полиморфизмов (SNP). При этом максимальную разрешающую способность демонстрирует полногеномный анализ распределения единичных нуклеотидных полиморфизмов (wgSNP) [13][14][15][16][17].
Безусловный научный интерес представляет изучение филогенетической принадлежности вариантов V. cholerae О1 биовара El Tor с последующим эволюционным и филогеографическим анализом.
Цель исследования — определение филогенетической принадлежности штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor, выделенных в разные годы на территории Кавказа.
Материалы и методы
В работе исследованы геномные последовательности 16 штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor из коллекции Ставропольского противочумного института, которые были изолированы из клинического материала во время эпидемических вспышек холеры на территории Кавказа с 1970 по 1998 г. Из них 7 — типичные V. cholerae биовара El Tor, выделенные в Республике Дагестан — 180Д (1970 г.); Азербайджане — 123Аз (1977 г.), 353Аз (1985 г.), 4017Аз (1989 г.); Ставрополе — С-347 (1980 г.), 454 (1990 г.); Краснодарском крае — 2278 (1987 г.). Остальные 9 — генетически измененные варианты V. cholerae биовара El Tor — выделены на территории Республики Дагестан — 157Д (1993 г.), 169Д (1993 г.), 1270Д (1994 г.), 17332 (1994 г.), 10213Д (1994 г.), 16241Д (1994 г.), 41Д (1998 г.); Краснодарского края — 286 (1994 г.); Ставропольского края — 8048 (1994 г.).
MLVA-типирование. Для типирования исследуемых штаммов возбудителя холеры использовали предложенную ранее схему MLVA-5 [10]. Для экстракции ДНК применяли набор реагентов «GeneJET Genomic DNA Purification Kit» («Thermo Scientific»). С помощью специфических праймеров в ПЦР нарабатывали продукты амплификации по 5 локусам для каждого из 16 штаммов. ПЦР проводили с использованием амплификатора «Терцик» («ДНК-Технология»), анализ ампликонов — путем капиллярного электрофореза с помощью анализатора «ABI Prism 3500» («Applied Biosystems»). Для оценки вариабельности локусов исользовали индекс разнообразия Хантера–Гастона [18].
При проведении кластерного анализа в качестве группы сравнения использовали доступные MLVA-генотипы штаммов V. choleraе, выделенных в Индии, Бангладеш, на Гаити. Кластерный анализ на основе данных MLVA выполняли с использованием программного пакета «BioNumerics v7.6» («Applied Maths»). Минимальное остовное дерево было построено на основе количества тандемных повторов с использованием категориального коэффициента дистанции.
Полногеномное секвенирование. Подготовку геномных библиотек проводили с использованием набора «Ion Xpress Plus Fragment Library Kit» («Life Technologies»), моноклональную амплификацию выполняли на микросферах — набор «Ion OneTouch 400 Template Kit» («Life Technologies») в соответствии с протоколами производителя. Секвенирование геномов осуществляли на секвенаторе «Ion Torrent PGM» и чипах «Ion 316 Chips Kit v2» («Life Technologies»).
Анализ геномов штаммов V. cholerae. Оценку качества полученных прочтений проводили с помощью программы «FastQC v0.11.3» [19]. Прочтения, содержащие нуклеотиды с низким значением качества, были отфильтрованы в программе «Trimmomatic v0.33» [20]. Прочтения со средним значением качества Q <15 баллов, а также прочтения длиной <75 нуклеотидов были удалены. Сборку геномов проводили в программном обеспечении «Newbler v3.0» («Roche»). Качество сборки геномов оценивали с использованием программы «Quast 3.0» [21], геномную последовательность штамма V. cholerae O1 El Tor N16961 (GenBank: GCF_000006745.1) использовали для определения точности и эффективности сборки. Аннотацию геномов выполняли с помощью NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline.
Для описания филогенетического контекста исследуемых изолятов использовали 87 полногеномных последовательностей V. cholerae из общедоступной базы данных NCBI1.
Поиск SNP проводили в гомологичных регионах нуклеотидных последовательностей в онлайнверсии программы «REALPHY v1.10» [22]. Повторяющиеся и паралогичные последовательности были удалены в процессе множественного выравнивания с помощью алгоритма программы. Обнаруженные SNP были извлечены в файл VCF, после чего SNP, расположенные ближе чем 10 п.н. друг от друга, были отфильтрованы и удалены. Поиск SNP, отличающих близкородственные штаммы друг от друга, а также специфичных для отдельных групп штаммов, осуществляли среди SNP, прошедших фильтрацию с использованием собственных скриптов в программном обеспечении R.
Для филогенетической реконструкции на основе wgSNP-анализа штаммов V. cholerae применяли пакет программ «BEAST v2.3.0»2. Для определения параметров эволюционной модели тестировали 88 различных моделей замещения на матрице множественного выравнивания геномов (коровый геном) в программе «Jmodeltest2». Оптимальную модель нуклеотидных замен выбирали на основе значений байесовского информационного критерия.
Поиск генов, кодирующих факторы вирулентности, и генов устойчивости к антибактериальным препаратам, проводили при помощи программного обеспечения «ABRicate v.0.8.13»3.
Результаты
При анализе фенотипических свойств установлено, что исследуемые штаммы относятся к токсигенным и гемолизотрицательным. Штаммы, изолированные до 1993 г., способны лизироваться бактериофагами ХДФ 3, ХДФ 4, ХДФ 5 и El Tor. В то же время изоляты, выделенные позднее, не обладают указанным свойством.
Анализ полученных данных MLVA-5 позволил установить, что 16 штаммов V. choleraе биовара El Tor представлены 15 MLVA-типами (табл. 1). При этом 7 изученных типичных штаммов V. choleraе биовара El Tor принадлежат к 7 MLVA-типам, а 9 генетически измененных штаммов — к 8 различным MLVA-типам. Только 2 штамма геновариантов El Tor были отнесены к одному MLVA-типу (9-7-8- 15-20): штамм 157Д, выделенный в 1993 г., и штамм 7332, выделенный в 1994 г. Это свидетельствует о заносе холеры из очага, существующего за пределами Республики Дагестан, в течение 2 лет. В целом полученные данные свидетельствуют о значительной вариабельности геномов обеих групп.
Таблица 1. MLVA-профили штаммов V. сholerae O1 биовара El Tor
Table 1. MLVA profiles of V. сholerae strains O1 biovar El Tor
№ № | Штамм | Место и год выделения | Число повторов в MLVA-локусе | |||||
I хромосома / I chromosome | II хромосома / II chromosome | |||||||
VC147 (белок FtsY) | VC437 (межгенная область) (intergenic region) | VC1650 (коллагеназа) (collagenase) | VCA171 (гипотетический белок) (hypothetical protein) | VCA283 (гипотетический белок) (hypothetical protein) | ||||
1 | 180Д 180D | Типичные холерные вибрионы / Typical cholera vibrions
| Республика Дагестан, 1970 Republic of Dagestan, 1970 | 9 | 6 | 7 | 15 | 26 |
2 | 123АЗ 123Az | Республика Азербайджан, 1977 Republic of Azerbaijan, 1977 | 10 | 7 | 7 | 18 | 28 | |
3 | 353АЗ 353Az | Республика Азербайджан, 1985 Republic of Azerbaijan, 1985 | 10 | 7 | 7 | 20 | 31 | |
4 | 4017АЗ 4017Az | Республика Азербайджан, 1989 Republic of Azerbaijan, 1989 | 10 | 6 | 8 | 15 | 18 | |
5 | С-347 C-347 | Ставрополь, 1980 Stavropol, 1980 | 9 | 7 | 7 | 20 | 23 | |
6 | 454 | Ставрополь, 1990 Stavropol, 1990 | 10 | 6 | 8 | 24 | 20 | |
7 | 2278 | Краснодар, 1987 Krasnodar, 1987 | 11 | 7 | 8 | 20 | 16 | |
8 | 286 | Генетически измененные варианты / Genetically modified variants
| Краснодар, 1994 Krasnodar, 1994 | 9 | 7 | 8 | 15 | 21 |
9 | 1270Д 1270D | Республика Дагестан, 1994 Republic of Dagestan, 1994 | 10 | 7 | 8 | 15 | 22 | |
10 | 157Д 157D | Республика Дагестан, 1993 Republic of Dagestan, 1993 | 9 | 7 | 8 | 15 | 20 | |
11 | 169Д 169D | Республика Дагестан, 1993 Republic of Dagestan, 1993 | 9 | 7 | 7 | 15 | 20 | |
12 | 8048 | Кисловодск, 1994 Kislovodsk, 1994 | 10 | 7 | 8 | 28 | — | |
13 | 10213Д 10213D | Республика Дагестан, 1994 Republic of Dagestan, 1994 | 9 | 7 | 8 | 15 | 23 | |
14 | 16241Д 16241D | Республика Дагестан, 1994 Republic of Dagestan, 1994 | 9 | 7 | 7 | 17 | 21 | |
15 | 17332 | Республика Дагестан, 1994 Republic of Dagestan, 1994 | 9 | 7 | 8 | 15 | 20 | |
16 | 41Д 41D | Республика Дагестан, 1998 Republic of Dagestan, 1998 | 9 | 8 | 8 | 15 | 22 | |
17 | 569B | Индия, 1948 India, 1948 | 10 | 4 | 3 | 16 | 34 | |
18 | 868 | Индия, 1964 India, 1964 | 8 | 6 | 8 | 14 | 35 | |
19 | 178 | Индия, 2006 India, 2006 | 9 | 3 | 6 | 19 | 17 | |
20 | 200 | Индия, 2006 India, 2006 | 9 | 3 | 6 | 22 | 19 | |
21 | 236 | Индия, 2007 India, 2007 | 9 | 3 | 6 | 17 | 16 | |
22 | 350 | Индия, 2007 India, 2007 | 10 | 6 | 7 | 15 | 19 | |
23 | AR32732 | Бангладеш, 2004 Bangladesh, 2004 | 9 | 3 | 6 | 22 | 12 | |
24 | MQ1795 | Бангладеш, 2001 Bangladesh, 2001 | 9 | 3 | 6 | 16 | 11 | |
25 | MJ1236 | Бангладеш, 1994 Bangladesh, 1994 | 8 | 7 | 8 | 12 | 19 | |
26 | MG116926 | Бангладеш, 1991 Bangladesh, 1991 | 8 | 7 | 8 | 14 | 23 | |
27 | HC1037 | Гаити, 2014 Haiti, 2014 | 7 | 3 | 6 | 14 | 8 | |
В результате проведенного MLVA-типирования выявлены 3 аллели для локусов I хромосомы и 6–9 аллелей для II хромосомы. Индекс разнообразия Хантера–Гастона был >0,99. При этом для локусов I хромосомы он варьировал в диапазоне 0,65–0,68, для локусов II хромосомы — 0,88–0,95, что свидетельствует об относительно высоком уровне стабильности первых хромосомных локусов. Полученные данные подтверждают результаты, описанные ранее [23][24][25][26].
Анализ построенной дендрограммы на основе MLVA-типирования по 5 вышеназванным локусам выявил деление всех штаммов на 2 кластера (рис. 1).
Рис. 1. Кластерный анализ на основе MLVA-типирования штаммов V. choleraе с использованием категориального коэффициента дистанции (программный пакет «BioNumerics v7.6»).Римскими цифрами обозначены основные кластеры, арабскими — субкластеры в структуре кластера II.
Fig. 1. Cluster analysis based on MLVA typing of V. cholerae strains using the categorical distance coefficient (BioNumerics v7.6).Roman numerals indicate the main clusters, arabic numerals indicate the subclusters in the structure of cluster II.Первый кластер образован только генетически измененными штаммами, выделенными в Бангладеш в 2001 и 2004 гг. и в Индии в 2006 и 2007 гг. Сопоставление MLVA-генотипов указанных штаммов (табл. 1) показывает, что они различаются только по числу повторов 2 вариабельных локусов II хромосомы. При этом аллельные варианты VNTR I хромосомы были идентичны (9-3-6), что говорит об общем происхождении изолятов. Также в этом субкластере отдельно расположен штамм из Гаити с аллельным профилем 7-3-4-14-8, что соответствует установленному происхождению холеры в Гаити из региона Непала [27]. Эти данные позволяют отметить продолжающиеся эволюционные изменения генома новых вариантов возбудителя холеры.
Во втором кластере можно выделить 3 группы: в первую вошли штаммы, выделенные в Республике Дагестан в 1970, 1993, 1994, 1998 гг., а также штаммы, изолированные в Краснодаре в 1987 и 1994 гг.
Вторую группу составили изоляты, выделенные в Республике Дагестан, Ставропольском крае (Кисловодск), Республике Азербайджан в 1989– 1994 гг. Отдельное положение в группе занимает штамм 569B классического биотипа, выделенный в Индии в 1948 г. Штаммы, выделенные в Республике Азербайджан в 1989 г. и в Ставропольском крае (Ставрополь) в 1990 г., являются типичными холерными вибрионами биовара El Tor и имеют сходные MLVA-профили (10-6-8-15-18/10-6-8-24-20), что подтверждает клональное происхождение штаммов. Близкородственность генетически измененного штамма 350 из Индии, выделенного в 2007 г., и типичного штамма V. cholerae биовара El Tor, изолированного в Республике Азербайджан в 1989 г., свидетельствует о том, что вариабельность MLVA-генотипов не ассоциирована с изменениями генома, приводящими к формированию гибридных вариантов биовара El Tor.
Третья группа: штаммы, выделенные в Республике Дагестан в 1994 г., в Индии в 1964 г., в Бангладеш в 1991 и 1994 гг., а также в Ставропольском крае (Ставрополь, 1980 г.). Относительно генетически измененного штамма, выделенного в Республике Дагестан в 1994 г., можно предположить его происхождение из Бангладеш. Этот факт подтверждается тем, что MLVA-генотип штамма отличается 2 локусами от штамма MG1236, выделенного в Бангладеш в 1991 г. Штаммы, изолированные на территории Республики Азербайджан в 1977 и 1985 гг. в 3-й группе, различаются по количеству повторов в 2 вариабельных локусах II хромосомы. В то же время аллельный вариант локусов I хромосомы был идентичен (10-7-7/10-7-7), что позволило выделить их в отдельный кластерный комплекс.
В результате секвенирования de novo были получены незавершенные геномы со средним покрытием 76–105×, включающие от 91 до 169 контигов (>500 п.н.) Общий размер сборки геномов секвенированных штаммов составил от 3 877 025 до 4 103 351 п.н. (табл. 2).
Таблица 2. Результаты полногеномного анализа
Table 2. Results of genome-wide analysis
№ № | Штамм Strain | Число контигов | Длина генома, п.н. The length of genome, b.p. | GC, % | Всего генов | GenBankID |
1 | 180D | 130 | 3906916 | 47,5 | 3666 | GCA_004358215.1 |
2 | 123Az | 120 | 3919566 | 47,5 | 3690 | GCA_004358225.1 |
3 | 353Az | 128 | 3953109 | 47,5 | 3660 | GCA_009728505.1 |
4 | 4017Az | 124 | 3907443 | 47,5 | 3594 | GCA_009728295.1 |
5 | С-347 | 125 | 3945425 | 47,5 | 3652 | GCA_009728405.1 |
6 | 454 | 136 | 3893896 | 47,5 | 3572 | GCA_009728525.1 |
7 | 2278 | 167 | 3877025 | 47,5 | 3544 | GCA_009728225.1 |
8 | 157D | 138 | 4078639 | 47,5 | 3843 | GCA_004358245.1 |
9 | 169D | 119 | 4102946 | 47,4 | 3936 | GCA_003130485.1 |
10 | 1270D | 133 | 4016316 | 47,5 | 3794 | GCA_003130495.1 |
11 | 17332 | 144 | 4031067 | 47,4 | 3697 | GCA_009728345.1 |
12 | 10213D | 147 | 4020493 | 47,4 | 3487 | GCA_003327445.1 |
13 | 16241D | 141 | 4081404 | 47,5 | 3891 | GCA_003130465.1 |
14 | 41D | 140 | 4038688 | 47,5 | 3862 | GCA_003130475.1 |
15 | 286 | 169 | 4068702 | 47,5 | 3802 | GCA_004358285.1 |
16 | 8048 | 91 | 4103351 | 47,4 | 3823 | GCA_009728375.1 |
Примечание. GC — доля гуанина (G) и цитозина (C) среди всех нуклеотидных остатков. Note. GC — the proportion of guanine (G) and cytosine (C) among all nucleotide residues.
У каждого анализируемого штамма обнаружено 47 общих генов вирулентности, а также 2–7 гена устойчивости к антибактериальным препаратам (varG, dfrA1, catB9, aadA1, sul1, sul2, floR, tet(A), aph(6)-ld и aph(3’’)-ld): карбапенемам, триметоприму, хлорамфениколу, стрептомицину, сульфонамидам, тетрациклинам.
Данные wgSNP позволили определить, что острова вирулентности (VPI-I и VPI-II) и патогенности (VSP-I и VSP-II), а также профаговая область CTX присутствуют в геномах всех исследуемых штаммов. При этом в структуре и нуклеотидных последовательностях данных областей установлены различия при сравнении с референсной последовательностью V. cholerae N16961.
Остров патогенности VPI-I всех исследуемых штаммов возбудителя холеры содержал несинонимичную SNP в гене VC0817, кодирующем транспозазу, в позиции А937G.
При анализе структуры острова патогенности VSP-I показана его 100% гомология по всем локусам с референсным геномом, кроме SNP в гене VC0180 (гипотетический белок) в позиции С1003T у всех генетически измененных штаммов. Данная мутация характерна исключительно для штаммов, выделенных после 1990 г.
Анализ структурной организации VSP-II (локусы VC0490-516) позволил установить наличие у штаммов 41D, 169D и 1270D общей делеции, включающей ген VC513. При сравнении
исследуемых геномов с референсным идентичность нуклеотидной последовательности VSP-II для указанных 3 штаммов составила 97,1–97,2 и 99,9% — для остальных штаммов. При этом у всех генетически измененных вариантов V. cholerae биовар El Tor отмечена SNP в позиции С526Т в гене VC496 (гипотетический белок). Кроме того, в
геноме 7 штаммов из 10, выделенных в 1990-х гг., идентифицирована SNP в гене VC0513 в позиции Т71С (Helix-turn-helix transcriptional regulator — RstR). Следует отметить, что указанная мутация в гене VC0513 несинонимична и приводит к замене треонина на изолейцин.
Последовательность острова VSP-II в геноме штамма V. cholerae 2278 (Краснодар, 1987 г.) содержит 34 SNP, в том числе 12 в составе гена VC494 (гипотетический белок), 7 — VC496 (гипотетический белок), 7 — VC498 (рибонуклеаза Н), 8 — VC506 (гипотетический белок).
Дальнейший анализ показал, что аллель гена ctxB субъединицы холерного токсина штаммов, выделенных в период с 1970 по 1990 г., принадлежит к типу El Tor (ctxB3). Для других штаммов выборки характерно наличие ранее описанных SNP в позициях 115 и 203 гена ctxB, соответствующих аллелю ctxB1 [28].
Последовательность гена tcpA всех исследуемых штаммов была идентична и соответствовала референсному геному.
При сравнительном анализе структуры генов, кодирующих факторы патогенности, выявлен ряд несинонимичных замен; в частности, в геноме штамма 157D в гене VC0983 (регуляторный белок ToxS) в позиции А117G; 2278 — VC0984 (белок-активатор холерного токсина) в позиции G410Т; 454 — VC0984 (белок-активатор холерного токсина) в позиции G21Т. У всех изучаемых генетически изменённых штаммов и 2 типичных V. cholerae O1 El Tor (454, 2278) идентифицирован SNP в гене VC1318 (белок наружной мембраны OmpV) в позиции G242Т. Также ДНК штамма С-347 содержит SNP в кластере RTX гена VC1451, кодирующего RtxA, в позиции C1480Т.
Далее с целью определения филогенетических связей и регионов происхождения изолятов, выделенных на Кавказе, проведена филогенетическая реконструкция на основе wgSNP 103 геномов V. cholerae, изолированных в период 7-й пандемии (с 1937 по 2017 г.) на территории 23 стран (Аргентина, Бахрейн, Бангладеш, Боливия, Китай, Колумбия, Джибути, Германия, Гаити, Индия, Индонезия, Кения, Мексика, Мозамбик, Перу, Филиппины, Россия, Южная Корея, Таиланд, Украина, США, Вьетнам).
Филогенетический анализ на основе wgSNP-типирования выявил деление изучаемых штаммов V. cholerae на 11 филогенетических групп (клад) (рис. 2).
Рис. 2. Филогенетическое дерево на основе wgSNP-типирования штаммов V. cholerae, построенное с помощью «BEAST v2.3.0» с использованием строгих часов и модели замещения нуклеотидов GTR. Цветом и цифрами 1–11 обозначены филогенетические группы. Звездочкой отмечены штаммы, геномы которых были секвенированы в рамках данного исследования.
Fig. 2. Phylogenetic tree based on wgSNP typing of V. cholerae strains, constructed using BEAST v2.3.0 using strict clocks and the GTR nucleotide substitution model. The color and numbers 1–11 indicate phylogenetic groups. Asterisk indicates the strains whose genomes were sequenced in this study.К 1-й группе принадлежат штаммы классического V. cholerae, выделенные в постпериод 6-й пандемии холеры, содержащие на 2-й хромосоме 2 специфических SNP (921847 и 1024057). Данные штаммы по своим морфогенетическим свойствам соответствуют референсному штамму классического биотипа 0395 и выделены в США (1962, 1974, 2004, 2017 гг.), Южной Корее (2014, 2017 гг.), на Гаити (2012 г.), в Индии (1962, 1964, 1974 г), Индонезии (1937, 1957, 1961 г.), Китае (1962, 1964 гг.), Австралии (1977 г.).
Группа 2 включает штаммы V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, изолированные в Мозамбике (1991 г.), Германии (1975 г.), Индии (1979 г.), Аргентине (1992, 1993 гг.), Мексике (1991 г.), Перу (1991, 1992 гг.), США (1992 г.), Колумбии (1992 г.), Боливии (1992 г.), содержащие специфические SNP на I и II хромосомах в позициях 775458 и 111100 соответственно. В эти годы завозов или заносов холеры из указанных стран на территорию Кавказа не зафиксировано.
Группа 3 представлена штаммами V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, не содержащими специфические SNP и выделенными в Бангладеш (1971, 1979, 1987 гг.), Бахрейне (1978 г.), Кении (1985 г.). В эту же группу вошли штаммы, изолированные в Дагестане (1970 г.), Азербайджане (1977 г.), Ставропольском крае (1980 г.) и референсный штамм 16961, что свидетельствует о близком родстве данной группы штаммов, а также позволяет предполагать завоз холеры на Кавказ из перечисленных выше эндемичных по холере стран.
Группа 4 состоит из 2 штаммов V. cholerae El Tor — ctxA+, ctxB3, выделенных во Вьетнаме (1989 г.) и содержащих специфические полиморфизмы на I (4 SNP) и II (2 SNP) хромосомах. Штаммы V. cholerae, выделенные на территории Кавказа, с подобной характеристикой не обнаружены.
Группа 5 представлена 3 штаммами V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, не содержащими специфические SNP, выделенными в Бангладеш (1987 г.), Индии (1980 г.), и филогенетически родственным
им штаммом возбудителя холеры, обнаруженным в Сочи (Россия, 1987 г.), что было подтверждено при эпидемиологическом расследовании случая заражения туристки, прибывшей в Сочи из Бангладеш.
В группу 6 вошли штаммы V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, содержащие специфические SNP на I и II хромосомах, выделенные как в Бангладеш (2013, 2014 гг.) и Индии (1992 г.), так и в Азербайджане (1989 г.) и Ставрополе (1990 г.), что свидетельствует о близком генетическом родстве данных микроорганизмов. Эпидемиологически подтвержден завоз в Азербайджан в 1989 г. и в Ставрополь в 1990 г. холеры, возбудитель которой имел генетические свойства V. cholerae, обнаруженных в Бангладеш и Индии.
Группа 7 представлена штаммами V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB1, т.е. генетически измененными вариантами V. cholerae биовара El Tor, содержащими специфические SNP на I и II хромосомах, выделенными c 1995 по 2005 г. (2-я волна распространения 7-й пандемии холеры).
Группа 8 включает штаммы V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, выделенные в Бангладеш и Индии в 1989–1991 гг., что свидетельствует о близком родстве с группой 3 штаммов V. cholerae El Tor сtxA+, ctxB3.
В состав групп 9–11 входят штаммы, изолированные в период с 2001 по 2017 г. и являющиеся представителями 3-й волны 7-й пандемии. Для штаммов группы 9, выделенных на территории Африки и Индийского полуострова (Кения, Джибути, Индия и Бангладеш), найдено 3 специфичных SNP.
Примечательно, что штаммы из группы 10 были выделены в основном на территории Индии в 1992–2007 гг., а штамм TSY216 — в Таиланде в 2010 г., что может свидетельствовать о заносе V. cholerae на территорию этой страны из Индии. Для штаммов указанной группы специфичных SNP не обнаружено.
Группа 11 состоит из штаммов, выделенных на территории Гаити, Китая, Бангладеш и Украины. Штаммы данной группы содержат 2 специфичных SNP, локализованные на I хромосоме.
Анализ нуклеотидных замен в геномах штаммов V. сholerae выявил 1157 SNP, бóльшая часть которых относительно равномерно распределена на I хромосоме (табл. 3).
Таблица 3. Специфичные SNP в геноме различных групп V. cholerae, выделенных на Кавказе в период 6-й и 7-й пандемий
Table 3. Specific SNPs in the genome of various V. cholerae groups isolated in the Caucasus during the 6th and 7th pandemics
№ группы Group No. | Число специфичных SNP Number of specific SNPs | Хромосома, координаты SNP Chromosome, coordinates of the SNP | Ген/локус Gene/locus | Белок/локус Protein/locus |
1 | 2 | 2 (921847) | VCA0975
| АТФ-связывающий белок |
2 (1024057) | VCA1073(putA) | Бифункциональная пролиндегидрогеназа Bifunctional proline dehydrogenase | ||
2 | 2 | 1 (775458)
| VC0722(ppx) | Экзополифосфатаза Exopolyphosphatase |
2 (111100) | VCA0103 | Белок-переносчик неорганических анионов семейства SulP SulP family inorganic anion transporter
| ||
3 | 0 | — | — | — |
4 | 6 | 1 (1720436)
| VC1606
| Белок семейства TolC |
1 (2285964)
| VC2132(fliG)
| Белок переключателя жгутиков FliG | ||
1 (2695072)
| VC2506(rapA) | Связанный с РНК-полимеразой белок | ||
1 (2801737) | VC2630 | Белок семейства PilQ
| ||
2 (52695)
| VCA0044 | Псевдоген | ||
2 (118960) | VCA0109(tssE) | Субъединица системы секреции TssE | ||
5 | 0 | — | — | — |
6 | 2 | 1 (2766100)
| VC2599(rnr)
| Рибонуклеаза R |
2 (636413) | VCA0697 | Дигуанилатциклаза, сенсорный домен | ||
7 | 6 | 1 (1317870)
| Intergenic
| Межгенное пространство |
1 (1830897) | VC1697
| NAD(P)H-связывающий белок | ||
2 (58725) | VCA0051
| Гипотетический белок | ||
2 (62339) | VCA0055 | Белок, содержащий домен | ||
2 (487649) | VCA0550
| Белок семейства site-2 протеаз | ||
2 (796722) | VCA0849 | Белок, содержащий модуль сдерживания | ||
8 | 0 | — | — | — |
9 | 3 | 1 (89430)
| VC0091
| SAM-зависимая метилтрансфераза SAM-dependent methyltransferase |
1 (2336676) | VC2190(flgL)
| Белок FlgL, связанный с жгутиками | ||
1 (2690901) | VC2503 | Валин-тРНК лигаза | ||
10 | 0 | — | — | — |
11 | 2 | 1 (2424759)
| VC2270
| Рибофлавинсинтаза |
1 (2669927) | VC2489 | Регулятор транскрипции семейства TetR/AcrR |
Заключение
Проведенное MLVA-типирование 16 штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor — как типичных, так и генетически измененных вариантов, выделенных от больных людей в разные периоды 7-й пандемии холеры, показало, что исследуемые штаммы относятся к 15 MLVA-типам и делятся на 3 группы в составе одного кластера. В то же время другой кластер образован только генетически измененными штаммами, использованными в качестве группы сравнения и изолированными после 2000 г. в Бангладеш (2001, 2004 гг.), Индии (2006 и 2007 гг.) и на Гаити (2014 г.). Принадлежность исследуемых штаммов к 15 разным MLVA-типам свидетельствует о продолжающихся эволюционных изменениях генома возбудителя холеры, что согласуется с данными, полученными ранее [25][29].
Кроме того, данные MLVA-типирования подтвердили, что случаи холеры на Кавказе являются завозными с территории эндемичных стран и позволили определить наиболее вероятные источники инфекции, что важно для молекулярно-эпидемиологического мониторинга за возбудителем холеры.
Основываясь на полученных данных wgSNP и анализа структурных особенностей геномов, установлено место штаммов V. cholerae O1 биовара El Tor, выделенных в период с 1970 по 1998 г. на территории Кавказа, в глобальной популяции V. cholerae. Показано, что в указанный период на Кавказе циркулировали штаммы, принадлежащие 1-й и 2-й волнам 7-й пандемии холеры.
С использованием wgSNP выявлены ранее не описанные несинонимичные SNP в генах, ассоциированных с экспрессией факторов патогенности, которые могут в дальнейшем быть использованы в качестве дополнительных генетических маркеров для характеристики изолятов V. cholerae O1 биовара El Tor.
1. National Center for Biotechnology Information. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov
2. URL: https://www.beast2.org
3. URL: https://github.com/tseemann/abricate
Об авторах
Д. А. Ковалев
Ставропольский противочумный институт
Автор, ответственный за переписку.
Email: stavnipchi@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9366-5647
Ковалев Дмитрий Анатольевич — к.х.н., зав. лаб. биохимии
Ставрополь
РоссияН. А. Шапаков
Ставропольский противочумный институт
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9152-4026
Шапаков Николай Андреевич — м.н.с. лаб. биохимии
Ставрополь
РоссияС. В. Писаренко
Ставропольский противочумный институт
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6458-6790
Писаренко Сергей Владимирович — к.х.н., в.н.с. лаб. биохимии
Ставрополь
РоссияИ. В. Савельева
Ставропольский противочумный институт
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1254-2259
Савельева Ирина Вилорьевна — к.м.н., врач-бактериолог научно-производственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций
Ставрополь
РоссияО. В. Васильева
Ставропольский противочумный институт
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8882-6477
Васильева Оксана Васильевна — к.м.н., зав. лаб. диагностики бактериальных инфекций
Ставрополь
РоссияВ. Н. Савельев
Ставропольский противочумный институт
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6458-3725
Савельев Вилорий Николаевич — д.м.н., г.н.с. лаб. эпидемиологии
Ставрополь
РоссияЮ. В. Сирица
Ставропольский противочумный институт
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9442-6966
Сирица Юлия Владимировна — биолог лаб. диагностики бактериальных инфекций
Ставрополь
РоссияА. М. Жиров
Ставропольский противочумный институт
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7698-7361
Жиров Андрей Михайлович — м.н.с. лаб. биохимии
Ставрополь
РоссияД. В. Ульшина
Ставропольский противочумный институт
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7754-2201
Ульшина Диана Васильевна — н.с. лаб. биохимии
Ставрополь
РоссияИ. В. Кузнецова
Ставропольский противочумный институт
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9513-0761
Кузнецова Ирина Владимировна — врач-бактериолог лаб. биохимии
Ставрополь
РоссияО. В. Бобрышева
Ставропольский противочумный институт
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6338-4476
Бобрышева Ольга Викторовна — м.н.с. лаб. биохимии
Ставрополь
РоссияА. Н. Куличенко
Ставропольский противочумный институт
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9362-3949
Куличенко Александр Николаевич — д.м.н., проф., член-корр. РАН, директор
Ставрополь
РоссияСписок литературы
- ВОЗ. Международные медико-санитарные правила (2005 г.). Available at: https://www.who.int/ihr/IHR_2005_ru.pdf
- Ramamurthy T., Mutreja A., Weill F.X., Das B., Ghosh A., Nair G.B. Revisiting the global epidemiology of cholera in conjuction with the genomics of Vibrio cholerae. Front. Public Health. 2019; 7: 203. https://doi.org/10.3389/fpubh.2019.00203
- Greig D.R., Schaefer U., Octavia S., Hunter E., Chattaway M.A., Dallman T.J., et al. Evaluation of whole-genome sequencing for identification and typing of Vibrio cholerae. J. Clin. Microbiol. 2018; 56(11): e00831–18. https://doi.org/10.1128/JCM.00831-18
- Москвитина Э.А., Тюленева Е.Г., Кругликов В.Д., Титова С.В., Водопьянов А.С., Куриленко М.Л. и др. Холера: оценка эпидемиологической обстановки в мире и России в 2008–2017 гг. Прогноз на 2018 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; (1): 36–43. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2018-1-36-43
- Харченко Г.А., Кимирилова О.Г., Буркин В.С. Эпидемиология и клиника холеры 1970 года в Астраханской области. Детские инфекции. 2019; 18(1): 51–5. https://doi.org/10.22627/2072-8107-2019-18-1-51-55
- Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А., Водопьянов А.С., Монахова Е.В., Писанов Р.В., Водопьянов С.О. и др. Ретроспективный молекулярно-эпидемиологический анализ эпидемии холеры в Республике Дагестан в 1994 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; (4): 33–41. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-4-33-41
- Челдышова Н.Б., Крицкий А.А., Лозовский Ю.В., Гусева Н.П. Сравнительный MLVA-анализ штаммов Vibrio cholerae классического биовара, выделенных в России и за рубежом. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; (4): 88–92. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-4-88-92
- George C.M., Rashid M., Almeida M., Saif-Ur-Rahman K.M., Monira S., Bhuyian M.S.I., et al. Genetic relatedness of Vibrio cholerae isolates within and between households during outbreaks in Dhaka, Bangladesh. BMC Genomics. 2017; 18(1): 903. https://doi.org/10.1186/s12864-017-4254-9
- Kachwamba Y., Mohammed A.A., Lukupulo H., Urio L., Majigo M., Mosha F., et al. Genetic characterization of Vibrio cholerae O1 isolates from outbreaks between 2011 and 2015 in Tanzania. BMC Infect. Dis. 2017; 17(1): 157. https://doi.org/10.1186/s12879-017-2252-9
- Garrine M., Mandomando I., Vubil D., et al. Minimal genetic change in Vibrio cholerae in Mozambique over time: multilocus variable number tandem repeat analysis and whole genome sequencing. PLoS Negl. Trop. Dis. 2017; 11(6): e0005671. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005671
- Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишанькин Б.Н. INDEL-типирование штаммов Vibrio cholerae. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2017; 22(4): 195–200. https://doi.org/10.18821/1560-9529-2017-22-4-195-200
- Водопьянов А.С., Мазрухо А.Б., Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. и др. VNTR-генотипирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных из объектов внешней среды на территории Российской Федерации в 2012 году. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014; 91(2): 46–51.
- Селянская Н.А., Архангельская И.В., Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Кругликов В.Д., Водяницкая С.Ю. и др. Типирование штаммов Vibrio cholerae не О1/не О139, изолированных в Ростовской области в 2014 году. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016; 93(1): 3–9. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2016-1-3-9
- Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишанькин Б.Н., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. и др. INDEL- и VNTR-типирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных в 2013 году из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации. Здоровье населения и среда обитания. 2015; (5): 41–4.
- Van Boeckel T.P., Brower C., Gilbert M., Grenfell B.T., Levin S.A., Robinson T.P., et al. Global trends in antimicrobial use in food animals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015; 112(18): 5649–54. https://doi.org/10.1073/pnas.1503141112
- Сизова Ю.В., Писанов Р.В., Водопьянов А.С., Черепахина И.Я., Бурлакова О.С. Фенотипический и генотипический анализ токсинопродукции типичных и атипичных штаммов холерных вибрионов в стрессовых условиях окружающей среды. Современные проблемы науки и образования. 2017; (3): 141.
- Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И., Заднова С.П., Краснов Я.М., Крицкий А.А., Буаро М.И. и др. Молекулярно-генетические свойства штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, циркулирующих на Африканском континенте. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 35(1): 12–9. https://doi.org/10.18821/0208-0613-201735-1-12-1
- Buroni S., Pollini S., Rossolini G.M., Perrin E. Editorial: evolution of genetic mechanisms of antibiotic resistance. Front. Genet. 2019; 10: 983. https://doi.org/10.3389/fgene.2019.00983
- Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data; 2010. Available at: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc
- Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014; 30(15): 2114–20. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170
- Gurevich A., Saveliev V., Vyahhi N., Tesler G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 2013; 29(8): 1072–5. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt086
- Bertels F., Silander O.K., Pachkov M., Rainey P.B., van Nimwegen E. Automated reconstruction of whole-genome phylogenies from short-sequence reads. Mol. Biol. Evol. 2014; 31(5): 1077–88. https://doi.org/10.1093/molbev/msu088
- Dash H.R., Shrivastava P., Mohapatra B.K., Das S., eds. DNA Fingerprinting: Advancements and Future Endeavors. Singapore: Springer; 2018. https://doi.org/10.1007/978-98113-1583-1
- Савельева И.В., Куличенко А.Н., Савельев В.Н., Ковалев Д.А., Васильева О.В., Жиров А.М. и др. MLVA-типирование клинических штаммов генетически измененных Vibrio cholerae biotype El tor, изолированных в России и Украине в период седьмой пандемии холеры. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95(6): 37–43. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-6-37-43
- Смирнова Н.И., Кульшань Т.А., Краснов Я.М. MLVA-типирование клинических штаммов Vibrio cholerae, изолированных в разные периоды текущей пандемии холеры. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015; 33(1): 15–22.
- Nguyen D.T., Ngo T.C., Le T.H., Nguyen H.T., Morita M., Arakawa E., et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae O1 in Northern Vietnam (2007–2009), using multilocus variable-number tandem repeat analysis. J. Med. Microbiol. 2016; 65(9): 1007–12. https://doi.org/10.1099/jmm.0.000317
- Bwire G., Sack D.A., Almeida M., Li S., Voeglein J.B., Debes A.K., et al. Molecular characterization of Vibrio cholerae responsible for cholera epidemics in Uganda by PCR, MLVA and WGS. PLoS Negl. Trop. Dis. 2018; 12(6): e0006492. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006492
- Mironova L.V., Gladkikh A.S., Ponomareva A.S., Feranchuk S.I., Bochalgin N.О., Basov E.A., et al. Comparative genomics of Vibrio cholerae El Tor strains isolated at epidemic complications in Siberia and at the Far East. Infect. Genet. Evol. 2018; 60: 80–8. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2018.02.023
- Hossain Z.Z., Leekitcharoenphon P., Dalsgaard A., Sultana R., Begum A., Jensen P.K.M., et al. Comparative genomics of Vibrio cholerae O1 isolated from cholera patients in Bangladesh. Lett. Appl. Microbiol. 2018; 67(4): 329–36. https://doi.org/10.1111/lam.13046
Дополнительные файлы
