Генетическое типирование штаммов Vibrio cholerae биовара El Tor, выделенных на территории Кавказа в период 1970–1998 гг., с применением MLVA-5 и wgSNP

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Филогенетический анализ штаммов Vibrio cholerae O1 биовара El Tor, выделенных в разные годы на территории Кавказа, с использованием мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов (MLVA) и полногеномного анализа распределения единичных нуклеотидных полиморфизмов (wgSNP).
Материалы и методы. Объектами исследования служили геномные последовательности 16 клинических штаммов V. cholerae O1 биовара El Tor из коллекции Ставропольского противочумного института, выделенных на территории Кавказа с 1970 по 1998 г., а также 87 полногеномных последовательностей V. cholerae из базы данных NCBI. MLVA проводили по 5 VNTR-локусам. Полногеномное секвенирование осуществляли на платформе «Ion Torrent PGM».
Результаты. Исследуемые штаммы относятся к 15 MLVA-типам и делятся на 3 группы в составе одного кластера. Осуществлен анализ структуры основных островов вирулентности и патогенности, а также нуклеотидных полиморфизмов в генах ctxB, tcpA и RstR. Проведен филогенетический анализ штаммов на основе wgSNP-типирования, описаны SNP, специфичные для каждой филогенетической группы.
Заключение. Установлено поликлональное происхождение генетически измененных вариантов V. cholerae O1 биовара El Tor. Определено место штаммов V. cholerae биовара El Tor, выделенных с 1970 по 1998 г. на территории Кавказа, в глобальной популяции возбудителя. Показано, что в указанный период на территории Кавказа циркулировали штаммы, принадлежащие к 1-й и 2-й волнам 7-й пандемии холеры. Подтверждено, что случаи холеры на Кавказе являются завозными с территории эндемичных стран, определены наиболее вероятные источники инфекции.

Полный текст

Введение

Возбудитель холеры (V. cholerae O1, сtxA+) вызывает особо опасное острое инфекционное заболевание. Эпидемиологический надзор за холерой осуществляется в соответствии с Международными медико-санитарными правилами [1]. Согласно принятой классификации внутри вида V. cholerae выделяют 3 эпидемически опасных варианта: холерные вибрионы серогруппы О1 (биовары classical и El Tor) и О139.

Исторически выделяют 7 пандемий холеры: возбудителем первых шести считается V. cholerae классического биовара, но с 1961 г. произошла смена биовара на El Tor, явившийся причиной 7-й пандемии, продолжающейся до настоящего времени. Начиная с 1991 г. по всему миру распространились генетически измененные высокопатогенные геноварианты V. cholerae О1 биовара El Tor [2][3].

Вспышки холеры, вызванные заносом инфекции, неоднократно фиксировались на территории Кавказа. Так, с начала 1970-х гг. в данном регионе было зарегистрировано несколько вспышек и эпидемий холеры: в 1970 г. — в Республике Дагестан, в 1985–1989 гг. — в Азербайджане, в 1990 г. — в Ставрополе, в 1994–1998 гг. — в Республике Дагестан [4][5][6].

Современные молекулярно-генетические методы исследования позволяют ретроспективно охарактеризовать геном штаммов возбудителя инфекции, вызвавших случаи заболевания холерой на различных территориях.

В последние годы для определения степени родства групп или отдельных штаммов V. cholerae [7][8][9] и типирования изолятов, выделенных как от людей во время вспышек, так и из объектов окружающей среды [10][11][12], широко применяется метод мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов (MLVA).

Один из актуальных методов генотипирования V. cholerae — определение единичных нуклеотидных полиморфизмов (SNP). При этом максимальную разрешающую способность демонстрирует полногеномный анализ распределения единичных нуклеотидных полиморфизмов (wgSNP) [13][14][15][16][17].

Безусловный научный интерес представляет изучение филогенетической принадлежности вариантов V. cholerae О1 биовара El Tor с последующим эволюционным и филогеографическим анализом.

Цель исследования — определение филогенетической принадлежности штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor, выделенных в разные годы на территории Кавказа.

Материалы и методы

В работе исследованы геномные последовательности 16 штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor из коллекции Ставропольского противочумного института, которые были изолированы из клинического материала во время эпидемических вспышек холеры на территории Кавказа с 1970 по 1998 г. Из них 7 — типичные V. cholerae биовара El Tor, выделенные в Республике Дагестан — 180Д (1970 г.); Азербайджане — 123Аз (1977 г.), 353Аз (1985 г.), 4017Аз (1989 г.); Ставрополе — С-347 (1980 г.), 454 (1990 г.); Краснодарском крае — 2278 (1987 г.). Остальные 9 — генетически измененные варианты V. cholerae биовара El Tor — выделены на территории Республики Дагестан — 157Д (1993 г.), 169Д (1993 г.), 1270Д (1994 г.), 17332 (1994 г.), 10213Д (1994 г.), 16241Д (1994 г.), 41Д (1998 г.); Краснодарского края — 286 (1994 г.); Ставропольского края — 8048 (1994 г.).

MLVA-типирование. Для типирования исследуемых штаммов возбудителя холеры использовали предложенную ранее схему MLVA-5 [10]. Для экстракции ДНК применяли набор реагентов «GeneJET Genomic DNA Purification Kit» («Thermo Scientific»). С помощью специфических праймеров в ПЦР нарабатывали продукты амплификации по 5 локусам для каждого из 16 штаммов. ПЦР проводили с использованием амплификатора «Терцик» («ДНК-Технология»), анализ ампликонов — путем капиллярного электрофореза с помощью анализатора «ABI Prism 3500» («Applied Biosystems»). Для оценки вариабельности локусов исользовали индекс разнообразия Хантера–Гастона [18].

При проведении кластерного анализа в качестве группы сравнения использовали доступные MLVA-генотипы штаммов V. choleraе, выделенных в Индии, Бангладеш, на Гаити. Кластерный анализ на основе данных MLVA выполняли с использованием программного пакета «BioNumerics v7.6» («Applied Maths»). Минимальное остовное дерево было построено на основе количества тандемных повторов с использованием категориального коэффициента дистанции.

Полногеномное секвенирование. Подготовку геномных библиотек проводили с использованием набора «Ion Xpress Plus Fragment Library Kit» («Life Technologies»), моноклональную амплификацию выполняли на микросферах — набор «Ion OneTouch 400 Template Kit» («Life Technologies») в соответствии с протоколами производителя. Секвенирование геномов осуществляли на секвенаторе «Ion Torrent PGM» и чипах «Ion 316 Chips Kit v2» («Life Technologies»).

Анализ геномов штаммов V. cholerae. Оценку качества полученных прочтений проводили с помощью программы «FastQC v0.11.3» [19]. Прочтения, содержащие нуклеотиды с низким значением качества, были отфильтрованы в программе «Trimmomatic v0.33» [20]. Прочтения со средним значением качества Q <15 баллов, а также прочтения длиной <75 нуклеотидов были удалены. Сборку геномов проводили в программном обеспечении «Newbler v3.0» («Roche»). Качество сборки геномов оценивали с использованием программы «Quast 3.0» [21], геномную последовательность штамма V. cholerae O1 El Tor N16961 (GenBank: GCF_000006745.1) использовали для определения точности и эффективности сборки. Аннотацию геномов выполняли с помощью NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline.

Для описания филогенетического контекста исследуемых изолятов использовали 87 полногеномных последовательностей V. cholerae из общедоступной базы данных NCBI1.

Поиск SNP проводили в гомологичных регионах нуклеотидных последовательностей в онлайнверсии программы «REALPHY v1.10» [22]. Повторяющиеся и паралогичные последовательности были удалены в процессе множественного выравнивания с помощью алгоритма программы. Обнаруженные SNP были извлечены в файл VCF, после чего SNP, расположенные ближе чем 10 п.н. друг от друга, были отфильтрованы и удалены. Поиск SNP, отличающих близкородственные штаммы друг от друга, а также специфичных для отдельных групп штаммов, осуществляли среди SNP, прошедших фильтрацию с использованием собственных скриптов в программном обеспечении R.

Для филогенетической реконструкции на основе wgSNP-анализа штаммов V. cholerae применяли пакет программ «BEAST v2.3.0»2. Для определения параметров эволюционной модели тестировали 88 различных моделей замещения на матрице множественного выравнивания геномов (коровый геном) в программе «Jmodeltest2». Оптимальную модель нуклеотидных замен выбирали на основе значений байесовского информационного критерия.

Поиск генов, кодирующих факторы вирулентности, и генов устойчивости к антибактериальным препаратам, проводили при помощи программного обеспечения «ABRicate v.0.8.13»3.

Результаты

При анализе фенотипических свойств установлено, что исследуемые штаммы относятся к токсигенным и гемолизотрицательным. Штаммы, изолированные до 1993 г., способны лизироваться бактериофагами ХДФ 3, ХДФ 4, ХДФ 5 и El Tor. В то же время изоляты, выделенные позднее, не обладают указанным свойством.

Анализ полученных данных MLVA-5 позволил установить, что 16 штаммов V. choleraе биовара El Tor представлены 15 MLVA-типами (табл. 1). При этом 7 изученных типичных штаммов V. choleraе биовара El Tor принадлежат к 7 MLVA-типам, а 9 генетически измененных штаммов — к 8 различным MLVA-типам. Только 2 штамма геновариантов El Tor были отнесены к одному MLVA-типу (9-7-8- 15-20): штамм 157Д, выделенный в 1993 г., и штамм 7332, выделенный в 1994 г. Это свидетельствует о заносе холеры из очага, существующего за пределами Республики Дагестан, в течение 2 лет. В целом полученные данные свидетельствуют о значительной вариабельности геномов обеих групп.

 
 

Таблица 1. MLVA-профили штаммов V. сholerae O1 биовара El Tor

Table 1. MLVA profiles of V. сholerae strains O1 biovar El Tor

Штамм
Strain

Место и год выделения
Location and year of isolation

Число повторов в MLVA-локусе
Number of repeats in the MLVA locus

I хромосома / I chromosome

II хромосома / II chromosome

VC147 (белок FtsY)
(protein FtsY)

VC437 (межгенная область) (intergenic region)

VC1650 (коллагеназа) (collagenase)

VCA171 (гипотетический белок) (hypothetical protein)

VCA283 (гипотетический белок) (hypothetical protein)

1

180Д

180D

Типичные холерные вибрионы / Typical cholera vibrions

 

Республика Дагестан, 1970 Republic of Dagestan, 1970

9

6

7

15

26

2

123АЗ

123Az

Республика Азербайджан, 1977 Republic of Azerbaijan, 1977

10

7

7

18

28

3

353АЗ

353Az

Республика Азербайджан, 1985 Republic of Azerbaijan, 1985

10

7

7

20

31

4

4017АЗ

4017Az

Республика Азербайджан, 1989 Republic of Azerbaijan, 1989

10

6

8

15

18

5

С-347

C-347

Ставрополь, 1980

Stavropol, 1980

9

7

7

20

23

6

454

Ставрополь, 1990

Stavropol, 1990

10

6

8

24

20

7

2278

Краснодар, 1987

Krasnodar, 1987

11

7

8

20

16

8

286

Генетически измененные варианты / Genetically modified variants

 

Краснодар, 1994

Krasnodar, 1994

9

7

8

15

21

9

1270Д

1270D

Республика Дагестан, 1994 Republic of Dagestan, 1994

10

7

8

15

22

10

157Д

157D

Республика Дагестан, 1993 Republic of Dagestan, 1993

9

7

8

15

20

11

169Д

169D

Республика Дагестан, 1993 Republic of Dagestan, 1993

9

7

7

15

20

12

8048

Кисловодск, 1994 Kislovodsk, 1994

10

7

8

28

13

10213Д

10213D

Республика Дагестан, 1994 Republic of Dagestan, 1994

9

7

8

15

23

14

16241Д

16241D

Республика Дагестан, 1994 Republic of Dagestan, 1994

9

7

7

17

21

15

17332

Республика Дагестан, 1994 Republic of Dagestan, 1994

9

7

8

15

20

16

41Д

41D

Республика Дагестан, 1998 Republic of Dagestan, 1998

9

8

8

15

22

17

569B

Индия, 1948

India, 1948

10

4

3

16

34

18

868

Индия, 1964

India, 1964

8

6

8

14

35

19

178

Индия, 2006

India, 2006

9

3

6

19

17

20

200

Индия, 2006

India, 2006

9

3

6

22

19

21

236

Индия, 2007

India, 2007

9

3

6

17

16

22

350

Индия, 2007

India, 2007

10

6

7

15

19

23

AR32732

Бангладеш, 2004

Bangladesh, 2004

9

3

6

22

12

24

MQ1795

Бангладеш, 2001

Bangladesh, 2001

9

3

6

16

11

25

MJ1236

Бангладеш, 1994

Bangladesh, 1994

8

7

8

12

19

26

MG116926

Бангладеш, 1991

Bangladesh, 1991

8

7

8

14

23

27

HC1037

Гаити, 2014 Haiti, 2014

7

3

6

14

8

 

В результате проведенного MLVA-типирования выявлены 3 аллели для локусов I хромосомы и 6–9 аллелей для II хромосомы. Индекс разнообразия Хантера–Гастона был >0,99. При этом для локусов I хромосомы он варьировал в диапазоне 0,65–0,68, для локусов II хромосомы — 0,88–0,95, что свидетельствует об относительно высоком уровне стабильности первых хромосомных локусов. Полученные данные подтверждают результаты, описанные ранее [23][24][25][26].

Анализ построенной дендрограммы на основе MLVA-типирования по 5 вышеназванным локусам выявил деление всех штаммов на 2 кластера (рис. 1).

 

Рис. 1. Кластерный анализ на основе MLVA-типирования штаммов V. choleraе с использованием категориального коэффициента дистанции (программный пакет «BioNumerics v7.6»).Римскими цифрами обозначены основные кластеры, арабскими — субкластеры в структуре кластера II.

Fig. 1. Cluster analysis based on MLVA typing of V. cholerae strains using the categorical distance coefficient (BioNumerics v7.6).Roman numerals indicate the main clusters, arabic numerals indicate the subclusters in the structure of cluster II.
 

Первый кластер образован только генетически измененными штаммами, выделенными в Бангладеш в 2001 и 2004 гг. и в Индии в 2006 и 2007 гг. Сопоставление MLVA-генотипов указанных штаммов (табл. 1) показывает, что они различаются только по числу повторов 2 вариабельных локусов II хромосомы. При этом аллельные варианты VNTR I хромосомы были идентичны (9-3-6), что говорит об общем происхождении изолятов. Также в этом субкластере отдельно расположен штамм из Гаити с аллельным профилем 7-3-4-14-8, что соответствует установленному происхождению холеры в Гаити из региона Непала [27]. Эти данные позволяют отметить продолжающиеся эволюционные изменения генома новых вариантов возбудителя холеры.

Во втором кластере можно выделить 3 группы: в первую вошли штаммы, выделенные в Республике Дагестан в 1970, 1993, 1994, 1998 гг., а также штаммы, изолированные в Краснодаре в 1987 и 1994 гг.

Вторую группу составили изоляты, выделенные в Республике Дагестан, Ставропольском крае (Кисловодск), Республике Азербайджан в 1989– 1994 гг. Отдельное положение в группе занимает штамм 569B классического биотипа, выделенный в Индии в 1948 г. Штаммы, выделенные в Республике Азербайджан в 1989 г. и в Ставропольском крае (Ставрополь) в 1990 г., являются типичными холерными вибрионами биовара El Tor и имеют сходные MLVA-профили (10-6-8-15-18/10-6-8-24-20), что подтверждает клональное происхождение штаммов. Близкородственность генетически измененного штамма 350 из Индии, выделенного в 2007 г., и типичного штамма V. cholerae биовара El Tor, изолированного в Республике Азербайджан в 1989 г., свидетельствует о том, что вариабельность MLVA-генотипов не ассоциирована с изменениями генома, приводящими к формированию гибридных вариантов биовара El Tor.

Третья группа: штаммы, выделенные в Республике Дагестан в 1994 г., в Индии в 1964 г., в Бангладеш в 1991 и 1994 гг., а также в Ставропольском крае (Ставрополь, 1980 г.). Относительно генетически измененного штамма, выделенного в Республике Дагестан в 1994 г., можно предположить его происхождение из Бангладеш. Этот факт подтверждается тем, что MLVA-генотип штамма отличается 2 локусами от штамма MG1236, выделенного в Бангладеш в 1991 г. Штаммы, изолированные на территории Республики Азербайджан в 1977 и 1985 гг. в 3-й группе, различаются по количеству повторов в 2 вариабельных локусах II хромосомы. В то же время аллельный вариант локусов I хромосомы был идентичен (10-7-7/10-7-7), что позволило выделить их в отдельный кластерный комплекс.

В результате секвенирования de novo были получены незавершенные геномы со средним покрытием 76–105×, включающие от 91 до 169 контигов (>500 п.н.) Общий размер сборки геномов секвенированных штаммов составил от 3 877 025 до 4 103 351 п.н. (табл. 2).

 

Таблица 2. Результаты полногеномного анализа

Table 2. Results of genome-wide analysis

Штамм Strain

Число контигов
The number of contigs

Длина генома, п.н.

The length of genome, b.p.

GC, %

Всего генов
Total number of genes

GenBankID

1

180D

130

3906916

47,5

3666

GCA_004358215.1

2

123Az

120

3919566

47,5

3690

GCA_004358225.1

3

353Az

128

3953109

47,5

3660

GCA_009728505.1

4

4017Az

124

3907443

47,5

3594

GCA_009728295.1

5

С-347

125

3945425

47,5

3652

GCA_009728405.1

6

454

136

3893896

47,5

3572

GCA_009728525.1

7

2278

167

3877025

47,5

3544

GCA_009728225.1

8

157D

138

4078639

47,5

3843

GCA_004358245.1

9

169D

119

4102946

47,4

3936

GCA_003130485.1

10

1270D

133

4016316

47,5

3794

GCA_003130495.1

11

17332

144

4031067

47,4

3697

GCA_009728345.1

12

10213D

147

4020493

47,4

3487

GCA_003327445.1

13

16241D

141

4081404

47,5

3891

GCA_003130465.1

14

41D

140

4038688

47,5

3862

GCA_003130475.1

15

286

169

4068702

47,5

3802

GCA_004358285.1

16

8048

91

4103351

47,4

3823

GCA_009728375.1

Примечание. GC — доля гуанина (G) и цитозина (C) среди всех нуклеотидных остатков. Note. GC — the proportion of guanine (G) and cytosine (C) among all nucleotide residues.

 

У каждого анализируемого штамма обнаружено 47 общих генов вирулентности, а также 2–7 гена устойчивости к антибактериальным препаратам (varG, dfrA1, catB9, aadA1, sul1, sul2, floR, tet(A), aph(6)-ld и aph(3’’)-ld): карбапенемам, триметоприму, хлорамфениколу, стрептомицину, сульфонамидам, тетрациклинам.

Данные wgSNP позволили определить, что острова вирулентности (VPI-I и VPI-II) и патогенности (VSP-I и VSP-II), а также профаговая область CTX присутствуют в геномах всех исследуемых штаммов. При этом в структуре и нуклеотидных последовательностях данных областей установлены различия при сравнении с референсной последовательностью V. cholerae N16961.

Остров патогенности VPI-I всех исследуемых штаммов возбудителя холеры содержал несинонимичную SNP в гене VC0817, кодирующем транспозазу, в позиции А937G.

При анализе структуры острова патогенности VSP-I показана его 100% гомология по всем локусам с референсным геномом, кроме SNP в гене VC0180 (гипотетический белок) в позиции С1003T у всех генетически измененных штаммов. Данная мутация характерна исключительно для штаммов, выделенных после 1990 г.

Анализ структурной организации VSP-II (локусы VC0490-516) позволил установить наличие у штаммов 41D, 169D и 1270D общей делеции, включающей ген VC513. При сравнении
исследуемых геномов с референсным идентичность нуклеотидной последовательности VSP-II для указанных 3 штаммов составила 97,1–97,2 и 99,9% — для остальных штаммов. При этом у всех генетически измененных вариантов V. cholerae биовар El Tor отмечена SNP в позиции С526Т в гене VC496 (гипотетический белок). Кроме того, в
геноме 7 штаммов из 10, выделенных в 1990-х гг., идентифицирована SNP в гене VC0513 в позиции Т71С (Helix-turn-helix transcriptional regulator — RstR). Следует отметить, что указанная мутация в гене VC0513 несинонимична и приводит к замене треонина на изолейцин.

Последовательность острова VSP-II в геноме штамма V. cholerae 2278 (Краснодар, 1987 г.) содержит 34 SNP, в том числе 12 в составе гена VC494 (гипотетический белок), 7 — VC496 (гипотетический белок), 7 — VC498 (рибонуклеаза Н), 8 — VC506 (гипотетический белок).

Дальнейший анализ показал, что аллель гена ctxB субъединицы холерного токсина штаммов, выделенных в период с 1970 по 1990 г., принадлежит к типу El Tor (ctxB3). Для других штаммов выборки характерно наличие ранее описанных SNP в позициях 115 и 203 гена ctxB, соответствующих аллелю ctxB1 [28].

Последовательность гена tcpA всех исследуемых штаммов была идентична и соответствовала референсному геному.

При сравнительном анализе структуры генов, кодирующих факторы патогенности, выявлен ряд несинонимичных замен; в частности, в геноме штамма 157D в гене VC0983 (регуляторный белок ToxS) в позиции А117G; 2278 — VC0984 (белок-активатор холерного токсина) в позиции G410Т; 454 — VC0984 (белок-активатор холерного токсина) в позиции G21Т. У всех изучаемых генетически изменённых штаммов и 2 типичных V. cholerae O1 El Tor (454, 2278) идентифицирован SNP в гене VC1318 (белок наружной мембраны OmpV) в позиции G242Т. Также ДНК штамма С-347 содержит SNP в кластере RTX гена VC1451, кодирующего RtxA, в позиции C1480Т.

Далее с целью определения филогенетических связей и регионов происхождения изолятов, выделенных на Кавказе, проведена филогенетическая реконструкция на основе wgSNP 103 геномов V. cholerae, изолированных в период 7-й пандемии (с 1937 по 2017 г.) на территории 23 стран (Аргентина, Бахрейн, Бангладеш, Боливия, Китай, Колумбия, Джибути, Германия, Гаити, Индия, Индонезия, Кения, Мексика, Мозамбик, Перу, Филиппины, Россия, Южная Корея, Таиланд, Украина, США, Вьетнам).

Филогенетический анализ на основе wgSNP-типирования выявил деление изучаемых штаммов V. cholerae на 11 филогенетических групп (клад) (рис. 2).

 

Рис. 2. Филогенетическое дерево на основе wgSNP-типирования штаммов V. cholerae, построенное с помощью «BEAST v2.3.0» с использованием строгих часов и модели замещения нуклеотидов GTR. Цветом и цифрами 1–11 обозначены филогенетические группы. Звездочкой отмечены штаммы, геномы которых были секвенированы в рамках данного исследования.

Fig. 2. Phylogenetic tree based on wgSNP typing of V. cholerae strains, constructed using BEAST v2.3.0 using strict clocks and the GTR nucleotide substitution model. The color and numbers 1–11 indicate phylogenetic groups. Asterisk indicates the strains whose genomes were sequenced in this study.
 

К 1-й группе принадлежат штаммы классического V. cholerae, выделенные в постпериод 6-й пандемии холеры, содержащие на 2-й хромосоме 2 специфических SNP (921847 и 1024057). Данные штаммы по своим морфогенетическим свойствам соответствуют референсному штамму классического биотипа 0395 и выделены в США (1962, 1974, 2004, 2017 гг.), Южной Корее (2014, 2017 гг.), на Гаити (2012 г.), в Индии (1962, 1964, 1974 г), Индонезии (1937, 1957, 1961 г.), Китае (1962, 1964 гг.), Австралии (1977 г.).

Группа 2 включает штаммы V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, изолированные в Мозамбике (1991 г.), Германии (1975 г.), Индии (1979 г.), Аргентине (1992, 1993 гг.), Мексике (1991 г.), Перу (1991, 1992 гг.), США (1992 г.), Колумбии (1992 г.), Боливии (1992 г.), содержащие специфические SNP на I и II хромосомах в позициях 775458 и 111100 соответственно. В эти годы завозов или заносов холеры из указанных стран на территорию Кавказа не зафиксировано.

Группа 3 представлена штаммами V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, не содержащими специфические SNP и выделенными в Бангладеш (1971, 1979, 1987 гг.), Бахрейне (1978 г.), Кении (1985 г.). В эту же группу вошли штаммы, изолированные в Дагестане (1970 г.), Азербайджане (1977 г.), Ставропольском крае (1980 г.) и референсный штамм 16961, что свидетельствует о близком родстве данной группы штаммов, а также позволяет предполагать завоз холеры на Кавказ из перечисленных выше эндемичных по холере стран.

Группа 4 состоит из 2 штаммов V. cholerae El Tor — ctxA+, ctxB3, выделенных во Вьетнаме (1989 г.) и содержащих специфические полиморфизмы на I (4 SNP) и II (2 SNP) хромосомах. Штаммы V. cholerae, выделенные на территории Кавказа, с подобной характеристикой не обнаружены.

Группа 5 представлена 3 штаммами V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, не содержащими специфические SNP, выделенными в Бангладеш (1987 г.), Индии (1980 г.), и филогенетически родственным
им штаммом возбудителя холеры, обнаруженным в Сочи (Россия, 1987 г.), что было подтверждено при эпидемиологическом расследовании случая заражения туристки, прибывшей в Сочи из Бангладеш.

В группу 6 вошли штаммы V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, содержащие специфические SNP на I и II хромосомах, выделенные как в Бангладеш (2013, 2014 гг.) и Индии (1992 г.), так и в Азербайджане (1989 г.) и Ставрополе (1990 г.), что свидетельствует о близком генетическом родстве данных микроорганизмов. Эпидемиологически подтвержден завоз в Азербайджан в 1989 г. и в Ставрополь в 1990 г. холеры, возбудитель которой имел генетические свойства V. cholerae, обнаруженных в Бангладеш и Индии.

Группа 7 представлена штаммами V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB1, т.е. генетически измененными вариантами V. cholerae биовара El Tor, содержащими специфические SNP на I и II хромосомах, выделенными c 1995 по 2005 г. (2-я волна распространения 7-й пандемии холеры).

Группа 8 включает штаммы V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, выделенные в Бангладеш и Индии в 1989–1991 гг., что свидетельствует о близком родстве с группой 3 штаммов V. cholerae El Tor сtxA+, ctxB3.

В состав групп 9–11 входят штаммы, изолированные в период с 2001 по 2017 г. и являющиеся представителями 3-й волны 7-й пандемии. Для штаммов группы 9, выделенных на территории Африки и Индийского полуострова (Кения, Джибути, Индия и Бангладеш), найдено 3 специфичных SNP.

Примечательно, что штаммы из группы 10 были выделены в основном на территории Индии в 1992–2007 гг., а штамм TSY216 — в Таиланде в 2010 г., что может свидетельствовать о заносе V. cholerae на территорию этой страны из Индии. Для штаммов указанной группы специфичных SNP не обнаружено.

Группа 11 состоит из штаммов, выделенных на территории Гаити, Китая, Бангладеш и Украины. Штаммы данной группы содержат 2 специфичных SNP, локализованные на I хромосоме.

Анализ нуклеотидных замен в геномах штаммов V. сholerae выявил 1157 SNP, бóльшая часть которых относительно равномерно распределена на I хромосоме (табл. 3).

 

Таблица 3. Специфичные SNP в геноме различных групп V. cholerae, выделенных на Кавказе в период 6-й и 7-й пандемий

Table 3. Specific SNPs in the genome of various V. cholerae groups isolated in the Caucasus during the 6th and 7th pandemics

№ группы Group No.

Число специфичных SNP Number of specific SNPs

Хромосома, координаты SNP Chromosome, coordinates of the SNP

Ген/локус Gene/locus

Белок/локус

Protein/locus

1

2

2 (921847)

VCA0975

 

АТФ-связывающий белок
ATP-binding protein

2 (1024057)

VCA1073(putA)

Бифункциональная пролиндегидрогеназа Bifunctional proline dehydrogenase

2

2

1 (775458)

 

VC0722(ppx)

Экзополифосфатаза

Exopolyphosphatase

2 (111100)

VCA0103

Белок-переносчик неорганических анионов семейства SulP

SulP family inorganic anion transporter

 

3

0

4

6

1 (1720436)

 

VC1606

 

 

Белок семейства TolC
TolC family protein

1 (2285964)

 

VC2132(fliG)

 

Белок переключателя жгутиков FliG
Flagellar motor switch protein FliG

1 (2695072)

 

VC2506(rapA)

Связанный с РНК-полимеразой белок
RNA polymerase-associated protein

1 (2801737)

VC2630

Белок семейства PilQ
Type IV pilus secretin PilQ family protein

 

2 (52695)

 

VCA0044

Псевдоген
Pseudogen

2 (118960)

VCA0109(tssE)

Субъединица системы секреции TssE
Secretion system baseplate subunit TssE

5

0

6

2

1 (2766100)

 

VC2599(rnr)

 

Рибонуклеаза R
Ribonuclease R

2 (636413)

VCA0697

Дигуанилатциклаза, сенсорный домен
Sensor domain-containing diguanylate cyclase

7

6

1 (1317870)

 

Intergenic

 

Межгенное пространство
Intergenic space

1 (1830897)

VC1697

 

NAD(P)H-связывающий белок
NAD(P)H-binding protein

2 (58725)

VCA0051

 

Гипотетический белок
Hypothetical protein

2 (62339)

VCA0055

Белок, содержащий домен
Domain-containing protein

2 (487649)

VCA0550

 

Белок семейства site-2 протеаз
Site-2 protease family protein

2 (796722)

VCA0849

Белок, содержащий модуль сдерживания
Retention module-containing protein

8

0

9

3

1 (89430)

 

VC0091

 

SAM-зависимая метилтрансфераза SAM-dependent methyltransferase

1 (2336676)

VC2190(flgL)

 

Белок FlgL, связанный с жгутиками
Flagellar hook-associated protein FlgL

1 (2690901)

VC2503

Валин-тРНК лигаза
Valine-tRNA ligase

10

0

11

2

1 (2424759)

 

VC2270

 

Рибофлавинсинтаза
Riboflavin synthase

1 (2669927)

VC2489

Регулятор транскрипции семейства TetR/AcrR
TetR/AcrR family transcriptional regulator

 

Заключение

Проведенное MLVA-типирование 16 штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor — как типичных, так и генетически измененных вариантов, выделенных от больных людей в разные периоды 7-й пандемии холеры, показало, что исследуемые штаммы относятся к 15 MLVA-типам и делятся на 3 группы в составе одного кластера. В то же время другой кластер образован только генетически измененными штаммами, использованными в качестве группы сравнения и изолированными после 2000 г. в Бангладеш (2001, 2004 гг.), Индии (2006 и 2007 гг.) и на Гаити (2014 г.). Принадлежность исследуемых штаммов к 15 разным MLVA-типам свидетельствует о продолжающихся эволюционных изменениях генома возбудителя холеры, что согласуется с данными, полученными ранее [25][29].

Кроме того, данные MLVA-типирования подтвердили, что случаи холеры на Кавказе являются завозными с территории эндемичных стран и позволили определить наиболее вероятные источники инфекции, что важно для молекулярно-эпидемиологического мониторинга за возбудителем холеры.

Основываясь на полученных данных wgSNP и анализа структурных особенностей геномов, установлено место штаммов V. cholerae O1 биовара El Tor, выделенных в период с 1970 по 1998 г. на территории Кавказа, в глобальной популяции V. cholerae. Показано, что в указанный период на Кавказе циркулировали штаммы, принадлежащие 1-й и 2-й волнам 7-й пандемии холеры.

С использованием wgSNP выявлены ранее не описанные несинонимичные SNP в генах, ассоциированных с экспрессией факторов патогенности, которые могут в дальнейшем быть использованы в качестве дополнительных генетических маркеров для характеристики изолятов V. cholerae O1 биовара El Tor.

 

1. National Center for Biotechnology Information. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov

2. URL: https://www.beast2.org

3. URL: https://github.com/tseemann/abricate

×

Об авторах

Д. А. Ковалев

Ставропольский противочумный институт

Автор, ответственный за переписку.
Email: stavnipchi@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9366-5647

Ковалев Дмитрий Анатольевич — к.х.н., зав. лаб. биохимии

Ставрополь

Россия

Н. А. Шапаков

Ставропольский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9152-4026

Шапаков Николай Андреевич — м.н.с. лаб. биохимии

Ставрополь

Россия

С. В. Писаренко

Ставропольский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6458-6790

Писаренко Сергей Владимирович — к.х.н., в.н.с. лаб. биохимии

Ставрополь

Россия

И. В. Савельева

Ставропольский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1254-2259

Савельева Ирина Вилорьевна — к.м.н., врач-бактериолог научно-производственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций

Ставрополь

Россия

О. В. Васильева

Ставропольский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8882-6477

Васильева Оксана Васильевна — к.м.н., зав. лаб. диагностики бактериальных инфекций

Ставрополь

Россия

В. Н. Савельев

Ставропольский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6458-3725

Савельев Вилорий Николаевич — д.м.н., г.н.с. лаб. эпидемиологии

Ставрополь

Россия

Ю. В. Сирица

Ставропольский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9442-6966

Сирица Юлия Владимировна — биолог лаб. диагностики бактериальных инфекций

Ставрополь

Россия

А. М. Жиров

Ставропольский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7698-7361

Жиров Андрей Михайлович — м.н.с. лаб. биохимии

Ставрополь

Россия

Д. В. Ульшина

Ставропольский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7754-2201

Ульшина Диана Васильевна — н.с. лаб. биохимии

Ставрополь

Россия

И. В. Кузнецова

Ставропольский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9513-0761

Кузнецова Ирина Владимировна — врач-бактериолог лаб. биохимии

Ставрополь

Россия

О. В. Бобрышева

Ставропольский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6338-4476

Бобрышева Ольга Викторовна — м.н.с. лаб. биохимии

Ставрополь

Россия

А. Н. Куличенко

Ставропольский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9362-3949

Куличенко Александр Николаевич — д.м.н., проф., член-корр. РАН, директор

Ставрополь

Россия

Список литературы

  1. ВОЗ. Международные медико-санитарные правила (2005 г.). Available at: https://www.who.int/ihr/IHR_2005_ru.pdf
  2. Ramamurthy T., Mutreja A., Weill F.X., Das B., Ghosh A., Nair G.B. Revisiting the global epidemiology of cholera in conjuction with the genomics of Vibrio cholerae. Front. Public Health. 2019; 7: 203. https://doi.org/10.3389/fpubh.2019.00203
  3. Greig D.R., Schaefer U., Octavia S., Hunter E., Chattaway M.A., Dallman T.J., et al. Evaluation of whole-genome sequencing for identification and typing of Vibrio cholerae. J. Clin. Microbiol. 2018; 56(11): e00831–18. https://doi.org/10.1128/JCM.00831-18
  4. Москвитина Э.А., Тюленева Е.Г., Кругликов В.Д., Титова С.В., Водопьянов А.С., Куриленко М.Л. и др. Холера: оценка эпидемиологической обстановки в мире и России в 2008–2017 гг. Прогноз на 2018 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; (1): 36–43. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2018-1-36-43
  5. Харченко Г.А., Кимирилова О.Г., Буркин В.С. Эпидемиология и клиника холеры 1970 года в Астраханской области. Детские инфекции. 2019; 18(1): 51–5. https://doi.org/10.22627/2072-8107-2019-18-1-51-55
  6. Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А., Водопьянов А.С., Монахова Е.В., Писанов Р.В., Водопьянов С.О. и др. Ретроспективный молекулярно-эпидемиологический анализ эпидемии холеры в Республике Дагестан в 1994 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; (4): 33–41. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-4-33-41
  7. Челдышова Н.Б., Крицкий А.А., Лозовский Ю.В., Гусева Н.П. Сравнительный MLVA-анализ штаммов Vibrio cholerae классического биовара, выделенных в России и за рубежом. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; (4): 88–92. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-4-88-92
  8. George C.M., Rashid M., Almeida M., Saif-Ur-Rahman K.M., Monira S., Bhuyian M.S.I., et al. Genetic relatedness of Vibrio cholerae isolates within and between households during outbreaks in Dhaka, Bangladesh. BMC Genomics. 2017; 18(1): 903. https://doi.org/10.1186/s12864-017-4254-9
  9. Kachwamba Y., Mohammed A.A., Lukupulo H., Urio L., Majigo M., Mosha F., et al. Genetic characterization of Vibrio cholerae O1 isolates from outbreaks between 2011 and 2015 in Tanzania. BMC Infect. Dis. 2017; 17(1): 157. https://doi.org/10.1186/s12879-017-2252-9
  10. Garrine M., Mandomando I., Vubil D., et al. Minimal genetic change in Vibrio cholerae in Mozambique over time: multilocus variable number tandem repeat analysis and whole genome sequencing. PLoS Negl. Trop. Dis. 2017; 11(6): e0005671. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005671
  11. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишанькин Б.Н. INDEL-типирование штаммов Vibrio cholerae. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2017; 22(4): 195–200. https://doi.org/10.18821/1560-9529-2017-22-4-195-200
  12. Водопьянов А.С., Мазрухо А.Б., Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. и др. VNTR-генотипирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных из объектов внешней среды на территории Российской Федерации в 2012 году. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014; 91(2): 46–51.
  13. Селянская Н.А., Архангельская И.В., Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Кругликов В.Д., Водяницкая С.Ю. и др. Типирование штаммов Vibrio cholerae не О1/не О139, изолированных в Ростовской области в 2014 году. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016; 93(1): 3–9. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2016-1-3-9
  14. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишанькин Б.Н., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. и др. INDEL- и VNTR-типирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных в 2013 году из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации. Здоровье населения и среда обитания. 2015; (5): 41–4.
  15. Van Boeckel T.P., Brower C., Gilbert M., Grenfell B.T., Levin S.A., Robinson T.P., et al. Global trends in antimicrobial use in food animals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015; 112(18): 5649–54. https://doi.org/10.1073/pnas.1503141112
  16. Сизова Ю.В., Писанов Р.В., Водопьянов А.С., Черепахина И.Я., Бурлакова О.С. Фенотипический и генотипический анализ токсинопродукции типичных и атипичных штаммов холерных вибрионов в стрессовых условиях окружающей среды. Современные проблемы науки и образования. 2017; (3): 141.
  17. Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И., Заднова С.П., Краснов Я.М., Крицкий А.А., Буаро М.И. и др. Молекулярно-генетические свойства штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, циркулирующих на Африканском континенте. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 35(1): 12–9. https://doi.org/10.18821/0208-0613-201735-1-12-1
  18. Buroni S., Pollini S., Rossolini G.M., Perrin E. Editorial: evolution of genetic mechanisms of antibiotic resistance. Front. Genet. 2019; 10: 983. https://doi.org/10.3389/fgene.2019.00983
  19. Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data; 2010. Available at: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc
  20. Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014; 30(15): 2114–20. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170
  21. Gurevich A., Saveliev V., Vyahhi N., Tesler G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 2013; 29(8): 1072–5. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt086
  22. Bertels F., Silander O.K., Pachkov M., Rainey P.B., van Nimwegen E. Automated reconstruction of whole-genome phylogenies from short-sequence reads. Mol. Biol. Evol. 2014; 31(5): 1077–88. https://doi.org/10.1093/molbev/msu088
  23. Dash H.R., Shrivastava P., Mohapatra B.K., Das S., eds. DNA Fingerprinting: Advancements and Future Endeavors. Singapore: Springer; 2018. https://doi.org/10.1007/978-98113-1583-1
  24. Савельева И.В., Куличенко А.Н., Савельев В.Н., Ковалев Д.А., Васильева О.В., Жиров А.М. и др. MLVA-типирование клинических штаммов генетически измененных Vibrio cholerae biotype El tor, изолированных в России и Украине в период седьмой пандемии холеры. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95(6): 37–43. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-6-37-43
  25. Смирнова Н.И., Кульшань Т.А., Краснов Я.М. MLVA-типирование клинических штаммов Vibrio cholerae, изолированных в разные периоды текущей пандемии холеры. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015; 33(1): 15–22.
  26. Nguyen D.T., Ngo T.C., Le T.H., Nguyen H.T., Morita M., Arakawa E., et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae O1 in Northern Vietnam (2007–2009), using multilocus variable-number tandem repeat analysis. J. Med. Microbiol. 2016; 65(9): 1007–12. https://doi.org/10.1099/jmm.0.000317
  27. Bwire G., Sack D.A., Almeida M., Li S., Voeglein J.B., Debes A.K., et al. Molecular characterization of Vibrio cholerae responsible for cholera epidemics in Uganda by PCR, MLVA and WGS. PLoS Negl. Trop. Dis. 2018; 12(6): e0006492. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006492
  28. Mironova L.V., Gladkikh A.S., Ponomareva A.S., Feranchuk S.I., Bochalgin N.О., Basov E.A., et al. Comparative genomics of Vibrio cholerae El Tor strains isolated at epidemic complications in Siberia and at the Far East. Infect. Genet. Evol. 2018; 60: 80–8. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2018.02.023
  29. Hossain Z.Z., Leekitcharoenphon P., Dalsgaard A., Sultana R., Begum A., Jensen P.K.M., et al. Comparative genomics of Vibrio cholerae O1 isolated from cholera patients in Bangladesh. Lett. Appl. Microbiol. 2018; 67(4): 329–36. https://doi.org/10.1111/lam.13046

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
2. Рис. 1. Кластерный анализ на основе MLVA-типирования штаммов V. choleraе с использованием категориального коэффициента дистанции (программный пакет «BioNumerics v7.6»).Римскими цифрами обозначены основные кластеры, арабскими — субкластеры в структуре кластера II.

Скачать (35KB)
3. Рис. 2. Филогенетическое дерево на основе wgSNP-типирования штаммов V. cholerae, построенное с помощью «BEAST v2.3.0» с использованием строгих часов и модели замещения нуклеотидов GTR. Цветом и цифрами 1–11 обозначены филогенетические группы. Звездочкой отмечены штаммы, геномы которых были секвенированы в рамках данного исследования.

Скачать (53KB)

© Ковалев Д.А., Шапаков Н.А., Писаренко С.В., Савельева И.В., Васильева О.В., Савельев В.Н., Сирица Ю.В., Жиров А.М., Ульшина Д.В., Кузнецова И.В., Бобрышева О.В., Куличенко А.Н., 2021

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах