Особенности изменений спектров жирных кислот бактерий семейства Enterobacteriaceae в процессе формирования устойчивых (дормантных) клеточных форм

Полный текст

Введение

Для сохранения жизнеспособности в условиях длительного воздействия низких температур, недостатка кислорода и питательных веществ патогенные бактерии формируют фенотипическую генерацию дормантных (устойчивых) клеточных форм. Они характеризуются резким замедлением (прекращением) метаболизма и отсутствием репродукции на обычных питательных средах. Однако при наступлении благоприятных для них условий обитания они способны вновь прорастать и вызывать инфекционные заболевания [1][2].

Внимание к дормантным (от англ. «dormant» — спящие) клеткам возросло в последние десятилетия в связи с активным изучением сообществ микроорганизмов мерзлотных почв Арктики. По современным представлениям, эти анабиотические клеточные фенотипы патогенных бактерий обладают высокой резистентностью ко всем антимикробным средствам и являются одной из причин возникновения госпитальных и хронических форм инфекций, в том числе ассоциированных с патогенными бактериями семейства Enterobacteriaceae.

Данная таксономическая группа включает в себя важные с медицинской точки зрения виды энтеробактерий, в числе которых Salmonella spp., Escherichia coli и Yersinia spp., имеющие отличительные особенности и высокую клиническую значимость. Они представляют собой грамотрицательные, не образующие спор, факультативно анаэробные микроорганизмы, местом обитания которых являются внешняя среда и желудочно-кишечный тракт человека [1][3].

В ходе исследований стратегий адаптации энтеробактерий к экстремальным условиям среды обитания выявлена ведущая роль изменений внутриклеточного спектра насыщенных (нЖК), моноеновых (моноЖК), полиненасыщенных (полиЖК) жирных кислот и их циклических изомеров (цисЖК) в жизнеобеспечении бактерий [2][5][6][7]. Возможно, эти же механизмы лежат в основе формирования дормантного клеточного фенотипа в результате трансформации макромолекулярного состава и вязкоупругих характеристик энтеробактерий в процессе обратимого перехода в устойчивое и некультивируемое состояние.

Данные литературы свидетельствуют о сложности исследования дормантных фенотипов бактерий из-за трудностей создания лабораторных моделей этих анабиотических клеточных генераций в условиях длительного низкотемпературного культивирования, а также многолетнего трофического и кислородного истощения [2][3][8].

Цель настоящего исследования заключалась в выявлении специфических особенностей изменения жирнокислотного состава грамотрицательных бактерий из семейства Enterobacteriaceae в процессе их многолетнего хранения в экстремальных условиях и формирования дормантных (некультивируемых) субпопуляций клеточных форм.

Материалы и методы

Для исследования использовали статистические культуры эталонных штаммов бактерий из коллекции НИИЭМ имени Г.П. Сомова: Yersinia pseudotuberculosis 512 серовара I-b, Salmonella enterica серовара Typhimurium 25902 и Escherichia coli, ATCC M17. Высев бактерий проводили уколом в столбик с полужидким агаром. Посевы инкубировали 24 ч при 37^оС. При наличии роста пробирки заливали стерильным вазелиновым маслом, закрывали резиновыми пробками и хранили при 4-8^оС в соответствии с МУ 2.1.4.1057-01¹. В таком состоянии культуры находились в течение 5-10 лет (с 2010 г.). Дормантные клеточные формы получали путем удаления масляного слоя и сбора микробной массы. Клетки промывали стерильным физиологическим раствором с последующим центрифугированием.

Ультраструктурные признаки дормантных клеточных форм были подтверждены при трансмиссионной электронной микроскопии [8][9][10][11]. Образцы бактерий для электронной микроскопии отбирали путем центрифугирования культуральных сред в течение 20 мин при 1800 об/мин. Полученные бактериальные суспензии фиксировали при 20-22.С в течение 1 ч фиксатором Ито [12].

Отмытые от фиксатора суспензии дополнительно фиксировали 1% раствором OsO₄ в течение 18 ч. Далее клетки обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и последовательно проводили через смесь абсолютного этанола с акриловой смолой («Sigma Aldrich») в соотношении 2:1, 1:1. Заливку проводили чистой акриловой смолой с катализатором при 60^оС в течение 48 ч.

Серийные ультратонкие срезы изготавливали на ультрамикротоме «LKB-V», контрастировали насыщенным раствором уранилацетата на 8% забуференном формалине и щелочным 0,02 М раствором цитрата свинца («Serva»). Срезы толщиной около 80 нм изучали при помощи трансмиссивного электронного микроскопа «JEM-100 S» («Jeol») при ускоряющем напряжении 80 кВ. Микрофотосъемку проводили на фотопластинки ПФП-01 Т (ОАО «Компания Славт»). Фотопластинки обрабатывали в проявителе Д-19 в течение 5 мин при 20^оС и фиксировали в водном растворе тиосульфата натрия 20 мин.

Анализ жизнеспособности персистирующих бактерий в исследованных изолятах проводили с помощью современной модификации метода ПЦР — viability PCR [11]. Метод основан на предварительной обработке исследуемых биообразцов специальными интеркалирующими нуклеиновые кислоты красителями, которые проникают через поврежденные мембраны клеток, связываются с ДНК и разрушают ее при последующей фотоактивации, а амплифицируется только ДНК из клеток с неповрежденными мембранами. В качестве интеркалирующего агента использовали бромистый этидий («Serva») [11][12].

Амплификации ДНК Salmonella и E. coli проводили с использованием набора реагентов АмплиСенс® ОКИ скрин-FL (ООО «Компания Хеликон») с гибридизационно-флюоресцентной детекцией («Интерлабсервис»). Для выявления ДНК Y. pseudotuberculosis применяли «ScreenMix-HS» («Евроген») с идентификацией специфического гена цитотоксического некротизирующего фактора cnfY, который был амплифицирован в присутствии Taq-полимеразы с помощью праймеров 5-GCAGGTGGGAGCAACAAAGAT-3’ и 3’-ACGGCGAACTTGATAATTGCTT-5’.

Тестирование проводили в соответствии с прилагаемыми инструкциями на биомассах персистирующих изолятов соответствующих микроорганизмов, полученных, как указано выше. ПЦР проводили в термоциклере «Терцик» («ДНК-технология») по следующей программе: денатурация 1 цикл 95^оС — 2 мин 30 с, затем отжиг 25 циклов: 95^оС — 40 с, 56^оС — 30 с, 72^оС — 2 мин и синтез 1 цикл 72^оС — 7 мин 40 с. Полученные ампликоны анализировали методом горизонтального электрофореза в 1% геле агарозы, содержащем бромистый этидий. Электрофорез продуктов ПЦР вели в 1% агарозном геле («Serva Electrophoresis GmbH») и в трис-боратном буфере. Гели окрашивали в бромистом этидии и фотографировали в ультрафиолетовом свете в системе гель-документирования «Bio-Rad XR» («Bio-Rad Laboratories Inc.»). В качестве маркера молекулярного веса использовали «PCR Markers» («Promega Corp.»).

Отсутствие репродуктивной активности дормантов проверяли путем многократных посевов на LB-бульон, среды Эндо и Серова и инкубации при 4-6, 22-24 и 37^оС.

Вегетативные клетки исследованных штаммов энтеробактерий получали при периодическом культивировании в жидкой питательной среде (LB-бульон, ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия) после 3-4 пассажей и инкубации в течение 7 сут при 37^оС. Тестовые свойства культур проверяли в соответствии с МУ 2.1.4.1057-01. Перед дальнейшим этапом — гомогенизацией и экстракцией липидов — исследуемые культуры бактерий выдерживали в течение 48 ч при 4-6^оС. Образцы 2-суточных культур обрабатывали сразу после отбора, клетки смывали стерильным физиологическим раствором с последующим центрифугированием.

Получение метиловых эфиров общих ЖК проводили по методике, утвержденной Европейским комитетом по стандартизации (CEN, 2003 г.) и рекомендованной Sherlock MIS-протоколом (редакция 2012 г.) [10]. Анализ метиловых эфиров ЖК осуществляли методом газовой хроматографии (ISO 5508:1990) в сочетании с масс-спектрометрией [9][10]. При невозможности немедленного анализа их консервировали в органических растворителях или замораживали при -5^оС [10]. Пробы промывали, центрифугировали, супернатант сливали, а осадок высушивали и подвергали кислотному метанолизу в 2,5 М HCl в метаноле. Безводный раствор HCl в метаноле готовили по методу [9]. Метанолиз проводили в 0,5 мл реактива на 2-10 мг сухого остатка в течение 2 ч при 70^оС [9][10].

Исследовали по 6 проб каждого изолята изучаемых бактерий. После предварительной гомогенизации микробные пробы подвергались стандартной методике экстракции по Фолчу в модификации [13] с последующей переэтерификацией извлеченных ЖК в метиловые эфиры. В соответствии с описанной методикой каждый образец трижды экстрагировали смесью хлороформа и метанола (1:1) двукратным объемом экстрагирующей смеси по отношению к объему пробы. ЖК анализировали на хроматографе «Shimadzu GC-2010» с использованием капиллярной кварцевой колонки (30 м х 0,25 мм) с фазой «Supelcowax 10»; идентифицировали по данным газо-жидкостной масс-спектрометрии на приборе «Shimadzu GCMS QP5050A», используя два типа колонок: «Supelcowax 10» (при 210^оС) и «MDN-5S» (в градиенте температуры 200-300^оС со скоростью 2°С/мин). Все спектры получали методом электронного удара при 70 эВ. Все исследуемые изоляты бактерий были экстрагированы шестикратно для оценки воспроизводимости.

Для статистического анализа количественных данных был применен пакет программ «Statistica 6.1» («StatSoft Inc.») c использованием методов описательной статистики и непараметрических критериев (ANOVA). Количественные данные представлены в виде среднего арифметического значения и среднего квадратического отклонения при оценке данных естественного разброса. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез был равен 0,05. Для изучения колебаний относительных значений мажорных фракций ЖК вычисляли коэффициент вариации (CV).

Результаты

При проведении электронной трансмиссионной микроскопии в клеточных субпопуляциях энтеробактерий в условиях длительного низкотемпературного культивирования, а также многолетнего трофического и кислородного истощения выявлены признаки субтотального замещения вегетативных клеток дормантными клеточными формами. Это подтверждает выявление специфических ультраструктурных признаков бактерий, находящихся в покоящемся (некультивируемом) состоянии: клетки протопластного или сферопластного типов с пустым цитозолем, увеличенным периплазматическим пространством, нарушенной слоистостью клеточной стенки и целостностью цитоплазматической мембраны. Полученные признаки соответствовали ранее описанной ультраструктурной организации покоящихся (некультивируемых) клеток [8][9][10]. Аналогичные электронно-микроскопические исследования вегетативных культур выявили типичные морфологические признаки энтеробактерий (рис. 1).

Сравнительный анализ полученных спектров ЖК у вегетативных и дормантных клеточных форм выявил достаточно стабильные липидные профили у всех исследуемых энтеробактерий. Оценка относительных значений CV мажорных фракций ЖК вегетативных культур и дормантных клеточных форм исследуемых штаммов энтеробактерий (в сумме составлявших более 90%) показала, что они не превышают 10%. Эти показатели свидетельствуют о слабой колеблемости признака, а средние линейные отклонения в совокупности варьировали от 8,80 ± 1,63% до 9,33 ± 0,66% для Y. pseudotuberculosis, от 8,24 ± 1,54% до 8,51 ± 1,26% для S. Typhimurium и от 8,26 ± 1,49% до 8,53 ± 1,37% для E. coli.

В экстрактах вегетативных и дормантных бактерий выявлены и идентифицированы метиловые эфиры ЖК, содержащие 12-18 атомов углерода. Полученные спектры содержали до 20 фракций кислот, которые анализировали и сравнивали по 11 мажорным пикам (типичная хроматограмма показана на рис. 2). Большинство минорных пиков не были идентифицированы как метиловые эфиры ЖК и не анализировались.

ЖК, элюирующие ранее, чем С12, а также гидроксикислоты в исследование не включали из-за плохой воспроизводимости относительных площадей пиков.

Мажорные фракции выявленных ЖК у вегетативных клеток исследуемых штаммов (табл. 1) были представлены длинноцепочечными кислотами (С14-С18) с преобладанием С16:0 (пальмитиновой), С16:1w7 (пальмитолеиновой), С17:1 (маргаринолеиновой), С18:1w9 (олеиновой) и С18:1w7 (цис-вакценовой). Вклад этих фракций в общий спектр у разных штаммов исследованных бактерий был разным, однако их суммарное содержание было статистически значимо выше совокупности других ЖК (p < 0,05).

Ранее в ряде работ [5][6][7] проводили анализ спектров ЖК из бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae, профили основных кислот которых были аналогичны полученным в настоящем исследовании. Преобладание в спектрах указанных ЖК является стабильным и патогномоничным признаком для энтеробактерий [14][15].

Установлено статистически значимое (р < 0,01) преобладание в спектрах ЖК у исследованных штаммов насыщенной гексадекановой кислоты (С16:0), содержание которой варьировало в пределах 28-33%, что, по данным литераторы, является патогномоничным признаком энтеробактерий [14][15][16][17]. Расчетный индекс насыщенности ЖК [14][16] вегетативных клеток составил от 0,53 (S. Typhimurium) до 0,97 (Y. pseudotuberculosis), что соответствует данным литературы [14][15][16][17]. Общая совокупность фракций нЖК (С12:0, С14:0, С15:0, С16:0, С17:0, С18:0) в спектрах вегетативных клеток составила более 50% (табл. 1).

Таблица 1. Мажорные фракции ЖК вегетативных клеточных форм исследованных грамотрицательных бактерий

Table 1. Major fractions of fatty acids of vegetative cell forms of the studied gram-negative bacteria

 

Полученные результаты соответствуют выводам отечественных и зарубежных исследователей о высокой консервативности спектра ЖК у бактерий, который является их таксономической харак-теристикой [15][16][17]. Анализ ЖК-состава вегетативных популяций показал отсутствие статистически значимых различий в содержании отдельных фракций ЖК.

Качественный и количественный составы ЖК дормантных клеточных форм энтеробактерий, находящихся при 6-8^оС в стационарном режиме, претерпевают существенные изменения. В исследованных изолятах, по сравнению с исходными значениями, существенно выросло относительное содержание среднецепочечных ЖК с числом атомов углерода 8-12 (р < 0,05) и сохранилось значительное количество насыщенных длинноцепочечных кислот (С14-С18). При этом ИН ЖК (отношение ненасыщенных жирных кислот к насыщенным) у дормантных форм снизился по сравнению с вегетативными клетками этих же бактерий (табл. 2).

При анализе изменений качественного состава ЖК в процессе обратимого перехода вегетативных клеток в дормантные клеточные формы исследуемых грамотрицательных бактерий была выявлена статистически значимая тенденция снижения относительного количества моноЖК у некультивируемых клеток. Кроме того, у дормантных форм по сравнению с вегетативными клетками было выявлено существенное снижение полиЖК, особенно выраженное у S. Typhimurium (р < 0,02), а также цисЖК (табл. 3).

 

Таблица 2. Мажорные фракции ЖК дормантных клеточных форм исследованных грамотрицательных бактерий

Table 2. Major fractions of fatty acids of dormant cell forms of the studied gram-negative bacteria

 

Таблица 3. Изменения качественного состава ЖК в процессе обратимого перехода вегетативных клеток в дормантныеклеточные формы грамотрицательных бактерий (%)

Table 3. Changes in the qualitative composition of fatty acids during the reversible transition of vegetative cells to dormant cell forms of gram-negative bacteria (%)

 

Обсуждение

ЖК являются важными компонентами клеточных мембран бактерий, а их профили уникальны и предоставляют важную информацию для систематики микроорганизмов. Активность ферментов, участвующих в синтезе ЖК, определяется изменяющимися факторами окружающей среды. В связи с этим в различных условиях существования бактерий меняются относительное содержание ЖК, длина их цепей и насыщенность.

Газовая хроматография уже более полувека служит одним из наиболее стандартизированных методов анализа ЖК, являясь чувствительным, точным и воспроизводимым методом [13][14][15][17][18][19]. С помощью этого аналитического инструмента изучен ЖК-спектр у большинства микроорганизмов, определены маркеры отдельных родов и видов бактерий [14][17].

Это относится к представителям семейства Enterobacteriaceae, используемым в настоящем исследовании, у которых состав ЖК, по данным ранее проведенных исследований, отличается высокой однородностью (средний коэффициент Bousfield составляет от 0,89 у Y. pseudotuberculosis до 0,78 у E. coli) [16][19].

Однако ряд исследователей справедливо отмечают зависимость полученных результатов газохроматографических спектров от условий экспериментов [14][15][16][18]. Поэтому для оптимизации стабильности и получения воспроизводимых результатов мы проводили экстракцию в стандартных условиях, насколько это позволяли условия исследования. Известно, что спектр ЖК у бактерий зависит от фазы роста, возраста культур и температуры культивирования, влияющей на физическое состояние и текучесть мембраны [13][14][15][17][18]. Поэтому для нивелирования воздействия влияющих факторов перед экстракцией метиловых эфиров ЖК авторы инкубировали вегетативные пробы в течение 2 сут при 6-8^оС в стационарной фазе роста.

Это исследование представляет собой первый анализ спектра ЖК у дормантных клеточных форм бактерий, полученных на лабораторной модели в условиях длительного воздействия экстремальных факторов. Бактериальное восприятие различных сигналов окружающей среды приводит к фенотипическим трансформациям метаболизма и репродукции, а также переключает транскрипционный аппарат многочисленных регуляторных систем [20][21]. Аналогичные процессы также протекают в энтеробактериях, которые содержат значительный набор регуляторов транскрипции, хорошо известных как сигма-факторы, реагирующие на стрессы [21], в том числе на гипоксию, дефицит питательных веществ и низкую температуру [22][23].

В ходе эксперимента одновременно решались несколько задач, связанных с исследованием жизнеспособности некультивируемых клеточных форм, оценкой методов их реверсии и сохранением вирулентных свойств патогенных бактерий. Кроме того, в ходе эксперимента анализировали микромеханические свойства клеточной мембраны и макромолекулярной структуры одиночных дормантных клеток с использованием методов молекулярной микробиологии (неопубликованные данные).

Одна из задач этого исследования — проверка гипотезы о значении ЖК при адаптационных трансформациях патогенных бактерий в условиях длительного и экстремального по значениям воздействия неблагоприятных условий существования (низкая температура, дефицит питательных веществ и гипоксия). Моделируя условия эксперимента, авторы исходили из того, что некультивируемые бактерии в состоянии покоя используют механизмы сохранения жизнеспособности, сталкиваясь с низкой температурой природных экосистем, а также неблагоприятными условиями микроокружения внутри организма-хозяина, включая гипоксию и недостаток питательных веществ [21][22][23].

Во время исследования было сосредоточено внимание на ЖК как на критическом и потенциально ограниченном ресурсе, который является гидрофобным структурным компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий и их важнейшим энергетическим субстратом [20][24][25].

Поскольку синтез липидов у бактерий обычно зависит от внешних источников [26][27], которые в настоящем эксперименте при формировании дормантных форм были перекрыты, основное внимание было сосредоточено на спектре ЖК.

В последние годы на моделях E. coli были установлены молекулярно-генетические механизмы формирования дормантных клеточных форм [28]. Выявлено, что большинство из них нацелены на ингибирование ключевых внутриклеточных звеньев метаболизма и репродукции — синтеза белков и репликации нуклеиновых кислот при активном участии вторичных мессенджеров-индукторов [26][28].

К последним относят внутриклеточные нуклеотидные молекулы-алармоны (p)ppGpp (гуанозин пентафосфат и гуанозин тетрафосфат). Они играют ключевую роль в ответе бактериальной клетки на внешние раздражители, выполняют функцию одного из основных медиаторов «строгого контроля» и регулятора активности метаболизма [28].

Вероятно, неповрежденный липидный метаболизм у некультивируемых бактерий является важным фактором, который необходимо учитывать при изучении не только дормантного клеточного фенотипа бактерий, но и механизмов их последующей реверсии в вегетативные формы. Сравнительный анализ спектров ЖК показал, что у некультивируемого клеточного фенотипа доминировали длинноцепочечные кислоты, которые в условиях ингибирования белкового синтеза индуцировали формирование дормантных генераций бактерий и их свойства (повышение лекарственной толерантности и низкую метаболическую активность). Отчасти это предположение подтверждают результаты исследований зарубежных авторов [23][26][27].

Например, в недавней работе Р. Del Portillo и соавт. (2019) установили изменение липидного метаболизма Mycobacterium tuberculosis при адаптации к условиям гипоксии. Основным источником углеводов бактерий в условиях недостатка кислорода становятся длинноцепочечные ЖК. Тем самым авторы подтвердили ключевую роль гипоксии в формировании персистирующих клеточных форм М. tuberculosis. Установлено, что в экстремальных условиях длинноцепочечные ЖК используются бактериями в качестве основного источника углеводов [24]. Этот же алармический путь метаболизма важен не только при гипоксии, но и при низкотемпературной адаптации, в условиях дефицита питательных веществ [25][26].

Токсин-антитоксиновые системы М. tuberculosis, экспрессия которых регулируется сигналами из окружающей среды, являются актуальными для формирования персистенции бактерий и их выживания в условиях гипоксии. В частности, промоторы sigE и sigB выступали как факторы транскрипции, избирательно стимулируя экспрессию целевых генов, кодирующих длинноцепочечные ЖК [24].

А. Battesti (2006) на модели E. coli было показано, что при реакции бактерий на стресс, связанный с длительным голоданием, при участии длинноцепочечных нЖК происходит активация синтеза (p)ppGpp. В качестве кофактора при этом выступает ацильный белок-носитель (АСР), который может ингибировать рост клеток и индуцировать их переход в дремлющее (некультивируемое) состояние [27].

В ходе аналогичных исследований J.E. Cronan с соавт. (2009) установили, что структурная пластичность АСР и его ацитилированной формы проявляется в инициации синтеза ЖК у бактерий при стрессе как в отношении их насыщенности (снижение относительного количества моноЖК и полиЖК), так и длины ацильной цепи (укорочение) в условиях ингибирования активности ферментов при голодании бактерий [28].

Проведенный нами сравнительный анализ спектров ЖК при обратимом формировании дормантных клеточных форм и у вегетативных клеток энтеробактерий показал, что выводы о связи регуляции синтеза ЖК с формированием некультивируемого фенотипа у бактерий, сделанные на модели E. coli [27], справедливы и для других представителей семейства Enterobacteriaceae. При этом мы сделали предположение об исключительной важности роли длинноцепочечных нЖК как основного источника углеводов не только в формировании дормантных клеток, но и при их реверсии в вегетативные клетки при наступлении благоприятных условий.

Таким образом, в результате длительного хранения (до 10 лет) E. coli, Y. pseudotuberculosis и S. Typhimurium в экстремальных условиях (низкая температура, недостаток питательных веществ, гипоксия) в популяции формируется фенотипическая некультивируемая генерация дормантных клеток [25][29][30]. Сравнительный анализ изменений ЖК-спектра в дормантном фенотипе выявил определенные особенности по сравнению с вегетативными клетками, связанные со снижением ИН и доминированием длинноцепочечных нЖК (С14-С18). Биологическое значение выявленных трансформаций у дормантных бактерий связано, по-видимому, с усилением роли этих фракций ЖК в обратимом формировании дремлющего (некультивируемого) клеточного фенотипа при появлении неблагоприятных условий обитания, а также в создании источника углеводов в метаболически неактивном состоянии и в процессе их последующей реверсии в вегетативные клетки при наступлении благоприятных условий существования.

Об авторах

Борис Георгиевич Андрюков

ФГБНУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова

Автор, ответственный за переписку.
Email: andrukov_bg@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4456-808X

Андрюков Борис Георгиеви— доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаб. молекулярной микробиологии.

690087, Владивосток

Россия

Лариса Михайловна Сомова

ФГБНУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова

Email: fake@neicon.ru

Сомова Лариса Михайловна — доктор медицинских наук, главный научный сотрудник лаб. клеточной биологии и гистопатологии.

690087, Владивосток

Россия

Ирина Николаевна Ляпун

ФГБНУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова

Email: irina-lyapun@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-5290-3864

Ляпун Ирина Николаевна — кандидат биологических наук, научный сотрудник лаб. молекулярной микробиологии.

690087, Владивосток

Россия

Марина Павловна Бынина

ФГБНУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова

Email: marina.bynina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8255-328X

Бынина Марина Павловна — младший научный сотрудник лаб. молекулярной микробиологии.

690087, Владивосток

Россия

Екатерина Владимировна Матосова

ФГБНУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова

Email: e_matosova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9968-3347

Матосова Екатерина Владимировна — младший научный сотрудник лаб. молекулярной микробиологии.

690087, Владивосток Россия

Список литературы

Дополнительные файлы