Отправить статью по E-mail Доклинические исследования безопасности, иммуногенности и защитной активности аттенуированных бактерий Bordetella pertussis на экспериментальной модели Macaca mulatta
- Авторы: Медкова А.Ю.1,2, Синяшина Л.Н.1, Амичба А.А.3, Cемин Е.Г.1, Шевцова З.В.3,4, Матуа А.З.3,4, Джидарян А.А.3, Кубрава Д.Т.3, Конджария И.Г.3,4, Баркая В.С.3, Миквабия З.Я.3, Каратаев Г.И.1
-
Учреждения:
- ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»
- ФГБУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента РФ
- НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии
- Абхазский государственный университет
- Выпуск: Том 97, № 4 (2020)
- Страницы: 312-323
- Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Дата подачи: 02.09.2020
- Дата принятия к публикации: 02.09.2020
- Дата публикации: 02.09.2020
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/868
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-4-3
- ID: 868
Цитировать
Аннотация
Введение. Рост заболеваемости коклюшем среди разных групп населения и несовершенство существующих профилактических препаратов требуют разработки новых безопасных вакцин, удобных для иммунизации детей раннего младенческого возраста, реиммунизации подростков и взрослых.
Целью настоящей работы является характеристика безопасности, иммуногенности и защитной активности сконструированных нами аттенуированных бактерий Bordetella pertussis 4МКS в тесте интраназального заражения иммунизированных обезьян Macaca mulatta вирулентными бактериями возбудителя коклюша.
Материалы и методы. Для иммунизации и экспериментальной инфекции использованы 5 половозрелых, клинически здоровых обезьян Macaca mulatta в возрасте 3–4 лет. Реиммунизацию проводили через 6 мес. В качестве контроля использовали 3 неиммунизированных животных того же возраста.
Результаты. Интраназальная однократная и повторная инокуляции аттенуированных бактерий B. pertussis не вызывали воспалительных процессов в носоглотке обезьян Macaca mulatta и изменений лабораторных показателей крови, наблюдаемых после экспериментальной инфекции нечеловекообразных приматов вирулентными бактериями. Не зарегистрировано увеличения количества общих IgE в сыворотке крови обезьян Macaca mulatta после однократной и двукратной иммунизации. Интраназальная иммунизация обезьян Macaca mulatta аттенуированными и вирулентными бактериями B. pertussis приводит к формированию защитной реакции организма на повторную инфекцию, проявляющейся в подавлении размножения бактерий, ускорении темпов их элиминации из носоглотки животных и развитии гуморального иммунного ответа на инфекцию. Развитие иммунитета к повторной коклюшной инфекции сопровождается выраженным бустерным эффектом.
Обсуждение. Представленные результаты указывают на общие механизмы формирования поствакцинального иммунитета в результате интраназальной вакцинации животных и постинфекционного противококлюшного иммунитета, обеспечивающих защиту от повторного инфицирования бактериями B. pertussis и развития клинических симптомов коклюша.
Полный текст
Введение
Несмотря на массовую противококлюшную вакцинацию, проводимую в разных странах с начала 1950-х гг., элиминации возбудителя коклюша среди населения не происходит. На фоне гиподиагностики коклюша ежегодно в мире регистрируется более 16 млн случаев заболевания разной степени тяжести, из которых около 200 тыс. заканчиваются летальным исходом [1]. В последнее десятилетие отмечается значительный рост числа лабораторно подтвержденных случаев коклюша среди подростков и взрослых [2][3], распространение стертых форм заболевания, выявлены бессимптомные носительства бактерий Bordetella pertussis (ВР) [2][4][5].
В США, где охват детей прививками с коклюшной вакциной (КВ) составляет 95%, с начала 2000-х гг. отмечен значительный рост заболеваемости коклюшем, приближающейся к довакцинному периоду [6][7]. Растет заболеваемость в Италии и Англии [8][9]. В России в 2018 г. зарегистрировано более чем 2-кратное увеличение числа случаев коклюша по сравнению с 2017 г. Тенденция роста заболеваемости сохранялась как в 2019 г., так и в начале 2000 г. [10]. В предыдущие годы рост заболеваемости регистрировали главным образом в Москве и Санкт-Петербурге, что связано, вероятно, с качеством диагностики [11].
Для профилактики коклюша в настоящее время используют вакцины, содержащие корпускулярный коклюшный компонент (цельноклеточные КВ — ЦКВ) или бесклеточный коклюшный компонент (бесклеточные КВ — БКВ) в сочетании с инактивированными дифтерийным и столбнячным анатоксинами. Иногда ЦКВ или БКВ используют как моновакцины. Считается, что БКВ менее реактогенна, но прямые исследования на приматах показали, что она не обеспечивает антибактерийного иммунитета и не защищает животных от экспериментальной коклюшной инфекции [12]. На невысокую эффективность ревакцинации подростков и взрослых БКВ указывает ее сравнительное определение заболеваемости вакцинированной и невакцинированной популяций [13][14].
Другим важным недостатком современных КВ является невысокая длительность сформированного иммунитета. Изучение эффективности КВ разного типа показало, что длительность поствак- цинального иммунитета не превышает 5 лет. После перенесенного заболевания иммунитет сохраняется до 10-15 лет [15].
Все современные КВ вводятся детям старше 2 мес не менее 3 раз. Таким образом, полный цикл вакцинации завершается не раньше чем к 6-месячному возрасту ребенка, что сохраняет высокий риск в первые, самые опасные в отношении заболевания коклюшем, месяцы его жизни.
Рост заболеваемости коклюшем, в том числе среди старших детей и взрослого населения, привел к пониманию необходимости ревакцинации подростков и взрослых. Рассматривается необходимость вакцинации матерей и формирования «семейного иммунитета» [3][4][16][17]. Для этих целей рекомендована только БКВ [4], которая, как упомянуто выше, не обеспечивает защиту детей и взрослых от заражения и распространения инфекции. Таким образом, приходится констатировать, что, несмотря на целесообразность ревакцинации подростков и взрослых, формирования семейного иммунитета, в настоящее время отсутствует вакцина для этих целей. ЦКВ не рекомендована ВОЗ к применению у взрослых, а современная БКВ, скорее всего, неэффективна. БКВ продемонстрировала свою эффективность и безопасность в качестве альтернативы ЦКВ для вакцинации младенцев. Такая вакцинация контролирует смертность и тяжесть заболевания детей младенческого, наиболее уязвимого для коклюша возраста. Однако, как и ЦКВ, она требует 3-4-кратной вакцинации и плохо защищает детей от инфицирования и заболевания при незавершенном цикле вакцинации.
В рамках доклинических исследований нами показаны безопасность интраназального введения аттенуированных бактерий BP 4МКS лабораторным животным и защитный эффект вакцинации мышей в отношении их внутримозгового и интраназального заражения вирулентными бактериями BP [18]. Исследования последних лет продемонстрировали перспективность экспериментальной модели нечеловекообразных обезьян для изучения иммунобиологических характеристик возбудителя коклюша и иммуногенности КВ [19][20][21][22][23]. Показано, что экспериментальная инфекция обезьян приводит к развитию лабораторных показателей коклюшной инфекции, гиперемии носоглотки, длительной персистенции BP и нарастанию титра специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови животных. Исследования на павианах гамадрилах продемонстрировали возможность передачи инфекции от человека к обезьяне и между обезьянами [23].
Целью настоящей работы является характеристика безопасности, иммуногенности и защитной активности сконструированных нами аттенуированных бактерий BP 4MKS в тесте интраназального заражения иммунизированных обезьян Macaca mulatta (макака резус; МР) вирулентными бактериями возбудителя коклюша.
Материалы и методы
BP культивировали на твердых питательных средах КУА с добавлением 10% дефибринированной крови барана при 36оС. Аттенуированные BP 4MKS из назофарингеальных смывов высевали на КУА, содержавшую 200 мкг/мл стрептомицина.
Для определения серотипового состава культуры использовали сыворотки диагностические коклюшные к агглютиногенам бактерий BP 1, 2, 3 адсорбированные, для реакции агглютинации, сухие (ФГБУ НИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи) в соответствии с рекомендациями производителя.
Иммунизацию и экспериментальное инфицирование проводили у 5 половозрелых, клинически здоровых МР в возрасте 3-4 лет. Реиммунизацию проводили через 6 мес. В качестве контроля использовали 3 неиммунизированных МР того же возраста. Работа с животными осуществлялась на базе Сухумского питомника обезьян (НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии). Использование животных соответствовало принципам Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей, а также требованиям отечественных нормативных документов.
Защитную активность аттенуированных бактерий определяли по сравнению динамики выведения вирулентных бактерий BP 475 из носоглотки вакцинированных и контрольных — неиммунизированных МР, развитию иммунологических реакций, а также клинических симптомов и лабораторных признаков коклюша.
Перед манипуляциями (иммунизацией, экспериментальной инфекцией, взятием назофарингеальных мазков) МР подвергали наркозу внутримышечным введением 0,03-0,04 мл золетила («Virbac», Франция) в концентрации 100 мг/мл (с премедикацией ксилазингидрохлоридом, 20 мг/мл). Экспериментальную инфекцию и вакцинацию (1071010 бактерий) осуществляли путем введения 0,5 мл суспензии вирулентных или аттенуированных бактерий в каждую ноздрю животного в положении лежа на спине.
Кровь на анализ у МР брали без наркоза с использованием «прижимных клеток».
Для выявления ДНК бактерий BP использован смыв назофарингеальных тампонов в 500 мкл физиологического раствора. После центрифугирования ДНК выделяли с помощью стандартной обработки раствором гуанидинтиоцианата с последующей сорбцией на магнитном сорбенте («Promega»). Идентификацию ДНК бактерий BP проводили с помощью разработанной нами тест-системы ПЦР в реальном времени [24][25].
Определение специфических к коклюшному токсину и филаментозному гемагглютинину IgG, IgM и неспецифических IgE в сыворотках крови МР после одно- и двукратной интраназальной вакцинации проводили с применением тест-систем «Ridascreen». Неспецифические IgE определяли с помощью тест-системы «Вектор-Бест».
Результаты проанализированы по тесту Стьюдента. Различия значимы при р ≤ 0,05.
Результаты
Общее состояние МР и анализ крови после иммунизации и заражения вирулентными BP 475
Первая и повторная интраназальные иммунизации МР не привели к отклонениям от нормы в поведении, общем состоянии животных, формуле крови, количестве лейкоцитов и глюкозы, активности аспартат- и аланинаминотрансферазы, к возникновению воспалительных или других реакций в носоглотке (табл. 1).
Таблица 1. Биохимический анализ крови МР после интраназальной иммунизации аттенуированными бактериями BP и экспериментальной инфекции вирулентными бактериями BP 475
Table 1. RMs' blood biochemistry after their intranasal immunization with attenuated BP bacteria and experimental infection with virulent BP 475 bacteria
Интраназальная инокуляция Intranasal inoculation | Дни Days | Аланинамино- трансфераза, Ед/мл Alanine aminotransferase, U/ml | Аспартатамино- трансфераза, Ед/мл Aspartate aminotransferase, U/ml | Глюкоза, Мм/л Glucose, Mm/l | Лейкоциты, ×103 White blood cells, ×103 |
|---|---|---|---|---|---|
Первая иммунизация First immunization | Фон Background | 34,5 ± 4,4 | 36,5 ± 12,5 | 5,4 ± 1,1 | 10,1 ± 2,8 |
| 3 | 38,8 ± 10,2 | 36,2 ± 10,4 | 4,7 ± 0,3 | 8,2 ± 1,9 |
| 7 | 42,1 ± 6,1 | 33,1 ± 2,6 | 5,5 ± 0,5 | 9,8 ± 2,7 |
| 14 | 46,1 ± 6,7 | 41,1 ± 10,6 | 4,7 ± 0,7 | 8,8 ± 2,3 |
Повторная иммунизация Re-immunization | Фон Background | 39,1 ± 4,6 | 43,5 ± 11,5 | 4,4 ± 0,6 | 9,1 ± 2,6 |
| 3 | 37,2 ± 3,9 | 38,2 ± 8,4 | 4,7 ± 0,4 | 7,2 ± 1,9 |
| 7 | 40,0 ± 3,1 | 34,1 ± 5,6 | 5,3 ± 0,5 | 8,0 ± 3,1 |
| 14 | 41,8 ± 4,0 | 39,1 ± 7,1 | 4,7 ± 0,4 | 8,3 ± 2,5 |
Инфекция бактериями BP 475 нативных обезьян Infection of native monkeys with BP 475 bacteria | Фон Background | 42,2 ± 6,4 | 42,0 ± 6,5 | 6,2 ± 0,3 | 12,1 ± 1,4 |
| 3 | 44,2 ± 4,9 | 39,2 ± 7,4 | 5,7 ± 0,7 | 17,8 ± 2,9 |
| 7 | 40,4 ± 4,1 | 41,1 ± 5,5 | 4,4 ± 0,6* | 19,3 ± 2,9* |
| 14 | 39,8 ± 3,8 | 40,1 ± 5,1 | 4,7 ± 0,4* | 19,3 ± 2,9* |
Примечание. *р < 0,05 по сравнению с фоном.
Note. *p < 0.05 as compared to the background.
Экспериментальная инфекция иммунизированных обезьян вирулентными бактериями ВР через 12 мес после реиммунизации также не выявила отклонений измеренных параметров от нормы (табл. 1). При этом в контрольном эксперименте, при заражении нативных обезьян вирулентными бактериями, зарегистрированы достоверное увеличение количества лейкоцитов и снижение содержания глюкозы (табл. 1), наличие слизи и воспаления носоглотки на 3-10-е сутки инфекции. Кашля у контрольных и опытных обезьян не зарегистрировано.
Результаты измерений неспецифических IgE в сыворотке крови иммунизированных и инфицированных животных представлены в табл. 2.
Таблица 2. Значения IgE в сыворотке крови МР, вакцинированных и ревакцинированных аттенуированными бактериями BP
Table 2. Values of IgE in blood sera of RMs vaccinated and re-vaccinated with attenuated BP bacteria
День после инфекции Day after infection | Номер обезьяны Monkey identification number | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
31881 | 31882 | 31883 | 31901 | 31908 | 31926 | 31927 | 31843 | 31870 | 31888 | |
Первая иммунизация First immunization | ||||||||||
Фон | 320 | 250 | 66 | 680 | 678 |
|
|
|
|
|
Background |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
7 | 290 | 190 | 73 | - | - |
|
|
|
|
|
14 | 285 | 220 | 56 | 845 | 693 |
|
|
|
|
|
24 | 427 | 350 | 48 | 690 | 578 |
|
|
|
|
|
64 | 469 | 191 | 53 | 662 | 750 |
|
|
|
|
|
180 | 668 | 117 | 63 | 609 | 555 |
|
|
|
|
|
Реиммунизация через 6 мес Re-immunization in 6 months | ||||||||||
Фон | 668 | 117 | 63 | 609 | 555 |
|
|
|
|
|
Background |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
7 | 720 | 141 | 31 | 745 | 449 |
|
|
|
|
|
14 | 518 | 187 | 43 | 722 | 458 |
|
|
|
|
|
24 | 562 | 203 | 62 | 648 | - |
|
|
|
|
|
64 | 669 | 177 | 47 | 393 | 524 |
|
|
|
|
|
180 | 580 | 258 | - | - | 180 |
|
|
|
|
|
Заражение вирулентными бактериями BP Infection with virulent BP bacteria | ||||||||||
Фон | 219 | 22 | 45 | 58 | 55 | 656 | 48 | 559 | 376 | 257 |
Background |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
7 | 73 | 13 | 15 | 45 | 32 | 732 | 37 | 635 | 281 | 201 |
14 | 48 | 13 | 17 | 10 | 14 | 651 | 25 | 759 | 351 | 224 |
28 | 43 | 7 | 9 | 23 | 9 | 515 | 52 | 569 | 390 | 356 |
Из табл. 2 видно, что из иммунизированных животных только у обезьяны 31883, а из контрольных — 31927 содержатся IgE в количестве, близком к значениям отрицательного контроля у человека (20-30 МЕ/мл). У всех обезьяны 31882 значения IgE варьируют от 117 до 350 ед., у остальных — 200-850 ед.
Не зарегистрировано регулярного увеличения количества IgE после их иммунизации и реиммунизации. Напротив, у обезьяны 31882 наблюдается тенденция к снижению количества IgE уже после реиммунизации, и у всех животных регистрируется значительное уменьшение числа IgE после заражения вирулентными бактериями BP 475.
Бактериальная нагрузка BP в носоглотке обезьян после иммунизации и заражения вирулентными BP 475
Золотым стандартом для диагностики коклюша является бактериологический метод. Мы производили высев материала смывов назофарингеальных тампонов, собранного с задней стенки носоглотки обезьян, на среду КУА с кровью, содержащую или не содержащую стрептомицин. Мазки брали через 1 ч после иммунизации или экспериментальной инфекции и далее в динамике через 3, 7, 10, 14 сут и т.д. Рост бактерий на среде КУА оценивали на 4-5-е сутки после посева. Выросшие колонии типировали с помощью специфических сывороток к агглютиногенам 1, 2 и Рост бактерий BP на чашках удавалось регистрировать в течение первых 2 нед, в редких случаях — 3-4 нед после инокуляции. Дополнительную сложность представляло наличие посторонней микрофлоры, особенно при анализе материала на среде КУА без антибиотика. Поэтому, а также учитывая низкую эффективность метода бактериального посева, для диагностики коклюша и характеристики количества бактерий в ротоносоглотке животных использован разработанный нами метод ПЦР в реальном времени.
На рис. 1 и 2 представлена динамика изменения количества геном-эквивалентов бактерий в условном миллилитре смыва назофарингеального тампона (аспирата) обезьян, однократно и двукратно инфицированных вирулентными и аттенуированными бактериями BP.
Рис. 1. Динамика изменения количества геном-эквивалентов бактерий BP в носоглотке МР после первого и повторного интраназального введения бактерий BP.N — количество геном-эквивалентов бактерий BP в 1 мл назофарингеального аспирата. 1 — первое введение вирулентных бактерий BP; 2 — повторное введение вирулентных бактерий BP; 3 — первое введение аттенуированных бактерий BP; 4 — повторное введение аттенуированных бактерий BP; 5 — инфицирование вирулентными BP через 12 мес после введения аттенуированных бактерий BP.
Fig. 1. Changes in the number of BP genome-equivalents in the RMs' nasopharynx after the first and repeated intranasal vaccination with BP bacteria. N — the number of BP genome-equivalents in 1 ml of the nasopharyngeal aspirate. 1 — the first vaccination with virulent BP bacteria; 2 — the repeated vaccination with virulent BP bacteria; 3 — the first vaccination with attenuated BP bacteria; 4 — the repeated vaccination with attenuated BP bacteria; 5 — the infection with virulent BP bacteria 12 months after the vaccination with attenuated BP bacteria.
Рис. 2. Динамика изменения количества геном-эквивалентов бактерий BP 18323 после 1-й и 2-й экспериментальной интраназальной инфекции МР.1 — 1-я экспериментальная интраназальная инфекция в дозе 107 КОЕ; 2 — 1-я экспериментальная интраназальная инфекция в дозе 109 КОЕ; 3 — повторная экспериментальная инфекция BP 18323 в дозе 109-1010 КОЕ.
Fig. 2. Changes in the number of BP 18323 genome-equivalents after the 1st and 2nd experimental intranasal infection of RMs. 1 — the 1st experimental intranasal infection at a dose of 107 CFU; 2 — the 1st experimental intranasal infection at a dose of 109 CFU; 3 — repeated experimental infection with BP 18323 at a dose of 109-1010 CFU.
Повторную инокуляцию аттенуированных бактерий BP проводили через 6 мес после 1-го введения, а экспериментальную инфекцию вирулентными бактериями BP — через 12 мес после реиммунизации.
Для прояснения зависимости картины элиминации от штамма бактерий и инфицирующей дозы проведено заражение половозрелых МР двумя дозами (107 КОЕ и 109-1010 КОЕ) вирулентных бактерий BP 18323. Каждой из доз интраназально инфицировали по 3 МР. Повторно всех МР инфицировали одной дозой 109-1010 бактерий. Повторную экспериментальную инфекцию вирулентными BP 475 или BP 18323 проводили через 4-6 мес после 1-й инокуляции. На рис. 1 и 2 видно, что число бактерий в носоглотке МР достигает максимума через 7-14 дней после экспериментальной инфекции аттенуированными бактериями BP 4МКS (tmax = 7-14 дней), через 14-21 день после инфекции изогенными вирулентными бактериями BP 475 и через 7-10 дней после интраназальной инокуляции вирулентных бактерий BP 18323.
При посеве и ПЦР-анализе смывов назофарингеальных тампонов контрольных животных роста колоний и регистрации ДНК возбудителя коклюша не наблюдали.
Титр специфических IgG в сыворотке крови вакцинированных обезьян МР после интраназального инфицирования BP
Все эксперименты, описанные в предыдущем разделе, сопровождались изучением динамики изменения уровня специфических IgG к BP в сыворотке крови инфицированных животных. При 1-й экспериментальной инфекции количество специфических IgG в сыворотке крови животных нарастало (рис. 3, 4) начиная с 10-14-го дня и достигало максимума к 28-му дню у обезьян, инфицированных вирулентными и атенуированными бактериями BP 475, и к 35-48-му дню после инфекции BP 18323. После повторной инфекции бактериями BP 18323 IgG достигал максимального значения к 14-му дню после инокуляции бактерий любого штамма.
Рис. 3. Динамика изменения количества IgG в сыворотке крови МР после 1-го и повторного интраназального введения им бактерий BP.По оси ординат — относительное значение количества IgG (в %): оПк+/ОД, где ОПК+ — значение оптической плотности положительного контроля, Oni — оптическая плотность в лунке с исследуемой сывороткой. 1 — 1-е введение аттенуированных бактерий BP; 2 — 1-е введение вирулентных бактерий BP; 3 — инфицирование вирулентными бактериями BP через 12 мес после введения аттенуированных бактерий BP; 4 — повторное введение вирулентных бактерий BP; 5 — повторное введение аттенуированных бактерий BР.
Fig. 3. Changes in the IgG level in the RMs' blood serum after the 1st and repeated intranasal vaccination with BP bacteria. On the vertical axis — the relative value of IgG levels (%): ODC+/ODi, where ODC+ — optical density of the positive control, ODi — optical density in the well with the studied serum. 1 — the 1st vaccination with attenuated BP bacteria; 2 — the 1st vaccination with virulent BP bacteria; 3 — the infection with virulent BP bacteria 12 months after the vaccination with attenuated BP bacteria; 4 — the repeated vaccination with virulent BP bacteria; 5 — the repeated vaccination with attenuated BP bacteria.
Рис. 4. Динамика изменения относительного количества IgG в сыворотке крови МР после 1-й и повторной интраназальной инфекции животных бактериями BP 18323.1 — 1-я экспериментальная интраназальная инфекция в дозе 107 КОЕ; 2 — 1-я экспериментальная интраназальная инфекция в дозе 109 КОЕ; 3 — повторная экспериментальная инфекция BP 18323 в дозе 109 КОЕ.
Fig. 4. Changes in the IgG relative levels in the RMs' blood serum after the 1st and repeated intranasal infection of the animals with Bp 18323 bacteria. 1 — the 1st experimental intranasal infection at a dose of 107 CFU; 2 — the 1st experimental intranasal infection at a dose of 109 CFU; 3 — the repeated experimental infection with BP 18323 at a dose of 109 CFU.
Обсуждение
Доклинические исследования острой токсичности на крысятах и мышатах, лейкоцитоз- и гиста- минсенсибилизирующей активности коклюшного токсина и весовой токсичности суспензии аттенуированных бактерий BP в классических экспериментах на линейных мышах, активности дермонекротического эндотоксина и гипоаллергенности в экспериментах на кроликах и морских свинках продемонстрировали безопасность интраназаль- ного применения сконструированной нами живой рекомбинантной коклюшной вакцины (ЖКВ) [18].
Исследования, проведенные нами на половозрелых нечеловекообразных приматах, показали, что экспериментальная интраназальная инфекция обезьян вирулентными бактериями BP приводит к развитию лабораторных признаков коклюшной инфекции у обезьян МР, павиан гамадрил, макак яванский и макак японский [22]. У неполовозрелых павианов анубисов развивался характерный для коклюша кашель [19]. Иммунизация павианов анубис ЖКВ на основе аттенуированных бактерий BP BPZE1 продемонстрировала ее безопасность и иммуногеность [21]. Эти результаты указывали на перспективность экспериментальной модели нечеловекообразных обезьян для изучения иммунобиологических характеристик возбудителя коклюша и иммуногенности коклюшных вакцин.
Представленные в настоящем исследовании результаты продемонстрировали отсутствие изменения показателей анализа крови и местных реакций у МР после интраназальной инокуляции аттенуированных бактерий BP в полном соответствии с экспериментами на мелких лабораторных животных. После первой и повторной вакцинации не зарегистрировано воспалительных процессов в носоглотке животных, наблюдаемых нами после экспериментальной инфекции вирулентными бактериями. Не отмечено увеличения количества общих IgE в сыворотке крови обезьян после вакцинации и ревакцинации. У всех иммунизированных животных регистрировалось снижение IgE после заражения вирулентными бактериями BP 475. Эти наблюдения хорошо согласуются с результатами R. Li с соавт. [26], показавших, что интраназальная вакцинация мышей аттенуированными бактериями BP BPZE1 не только не вызывает аллергических реакций, но и защищает животных от экспериментального аллергического воспаления и снижает уровень IgE в сыворотке крови.
Следует отметить, что тест-система «IgE Ridascreen», предназначенная для работы с сыворотками крови человека, не выявляла IgE в сыворотке обезьян. Для регистрации IgE в сыворотке крови обезьян была использована тест-система «IgE Век- тор-Бест». Эта система не применялась ранее для оценки IgE обезьян, поэтому полученные цифры не могут быть использованы для количественного определения, но пригодны для качественной оценки изменения содержания IgE после иммунизации животных.
Размножение вирулентных бактерий BP в носоглотке и их персистенция в организме человека являются важными характеристиками коклюшной инфекции. Согласно имеющимся в настоящее время данным иммунизация обезьян ЦКВ и аттенуированными бактериями, в отличие от БКВ, приводит к формированию мукозального иммунитета, препятствующего размножению вирулентных бактерий BP при их проникновении в организм человека и обезьяны. Представленные на рис. 1 и 2 графики демонстрируют схожую динамику размножения/эрадикации аттенуированных и вирулентных бактерий разных штаммов в рото-носоглотке МР. Отдельные геном-эквиваленты BP регистрируются в назофарингеальных изолятах с помощью ПЦР в реальном времени вплоть до 6 мес. Аналогичные результаты получены нами при обследовании выздоравливающих от коклюша детей разного возраста, у 15-20% которых возбудитель коклюша регистрировали с помощью ПЦР в реальном времени спустя 6 мес после постановки диагноза [27].
Схожая картина наблюдалась после повторной инокуляции аттенуированных и вирулентных бактерий обезьянам и после экспериментальной инфекции иммунизированных животных вирулентными бактериями. Кривые размножения/эрадикации после повторной инокуляции бактерий (рис. 1 и 2) не имеют качественных отличий, но принципиально отличаются от картины после 1-й инокуляции отсутствием накопления и значительно более быстрой эрадикацией бактерий. Например, к 28-му дню после повторной инфекции (иммунизации) бактерии не выявлялись или их удавалось регистрировать только в единичных копиях, тогда как в эти же сроки после 1-й инфекции число геном-эквивалентов бактерий BP могло составлять несколько десятков. Необходимо отметить, что чувствительность использованной нами тест-системы составляет 0,01-0,1 геном-эквивалента в 5 мкл раствора и определяется применением многокопийной последовательности IS481 в качестве мишени амплификации [24][25].
Для изучения зависимости динамики размножения бактерий и развития иммунного ответа от инфицирующей дозы и штамма бактерий наряду с изогенными вирулентными и аттенуированными бактериями BP 475 и 4МKS использованы вирулентные бактерии BP 18323, применяемые для определения защитной активности ЦКВ. Бактерии вводили 3 МР по 109-1010 КОЕ, 3 МР — по 107 КОЕ. Количество бактерий и динамика размножения/эрадикации после экспериментальной инфекции МР, получивших 109 бактерий, не имели статистически значимых отличий от динамики при инфицировании животных другими штаммами BP. Измеренные нами значения t для BP 475, 18323 и 4МKS близки друг к другу и совпадают со значениями, приведенными в работе J.M. Warfel и соавт. [19] для бактерий BP D420, полученных при инфицировании детенышей павиана анубиса.
При инфицировании обезьян дозой 107 КОЕ бактерий BP на протяжении всего времени развития 1-й инфекции наблюдали достоверно меньшее количество геном-эквивалентов бактерий BP в носоглотке животных (рис. 2). Это обстоятельство было учтено нами при определении вакцинирующей дозы для клинических исследований ЖКВ на здоровых добровольцах, продолжающихся в настоящее время.
Следует отметить, что проведенные нами ранее исследования показали, что в процессе перси- стенции бактерий BP в организме обезьяны происходит изменение фазового состава популяции. Если в первые часы после инфекции подавляющее большинство бактерий BP находятся в вирулентном состоянии, характеризующемся нативной структурой оперона bvgAS, то в процессе развития инфекции гетерогенность популяции бактерий BP возрастает за счет увеличения доли авирулентных мутантов возбудителя коклюша, несущих инсерцию IS481 в опероне bvgAS BP. В наибольшей степени процесс выражен после повторных инокуляций, когда количество инсерционных мутантов бактерий BP в персистирующей популяции может достигать 50% от числа зарегистрированных бактерий [28]. Это наблюдение указывает на возможный механизм формирования длительно персистирующих бактерий, обеспечивающих выживание патогена и его передачу новому хозяину.
На рис. 3 и 4 видно, что динамика изменения титра специфических IgG в сыворотке крови вакцинированных обезьян, экспериментально инфицированных вирулентными бактериями BP, близка к соответствующей кривой, полученной после повторного инфицирования МР, и значительно отличается от динамики IgG после 1-й экспериментальной инфекции вирулентными и аттенуированными бактериями. У всех реиммунизированных и инфицированных после иммунизации вирулентными бактериями BP животных количество антител быстро нарастало и достигало максимума к 10-14-му дню. Эти результаты полностью соответствуют результатам определения IgG после повторного заражения вирулентными бактериями BP 475 и хорошо согласуются с приведенными выше результатами изучения динамики накопления бактерий в носоглотке инфицированных животных. Быстрое нарастание специфических антител после повторного контакта с инфекцией способствует подавлению размножения бактерий и их элиминации из носоглотки животных.
Схожая динамика выявлена нами при 2- и 3-кратных экспериментальных заражениях разных видов обезьян Старого Света вирулентными бактериями BP, в том числе в дозах 1010-1011 КОЕ. Во всех случаях зарегистрированы выраженный бустер гуморального иммунного ответа и ускоренная элиминация возбудителя после повторного заражения [22]. Наличие бустерного эффекта повторной вакцинации при низких значениях и даже при отсутствии IgG у некоторых животных после 1-й вакцинации, а также ускоренная элиминация бактерий у всех животных после повторной вакцинации указывают на то, что даже однократная интраназальная вакцинация аттенуированными бактериями может оказаться достаточной для обеспечения защиты от экспериментальной инфекции.
Таким образом, экспериментальная интраназальная инфекция МР аттенуированными и вирулентными бактериями BP приводит к формированию защитной реакции организма, проявляющейся в подавлении размножения бактерий, ускорении темпов их элиминации из носоглотки животных и развитии гуморального иммунного ответа. Развитие гуморального, антительного ответа после повторной инфекции носит бустерный характер, независимо от штамма бактерий. Представленные результаты указывают на общие механизмы формирования поствакцинального иммунитета после интраназальной иммунизации животных ЖКВ и постинфекционного противококлюшного иммунитета, обеспечивающих защиту от повторного инфицирования бактериями BP и развития клинических симптомов коклюша. Представленные данные не противоречат результатам C. Locht и соавт. [21], продемонстрировавшим наличие выраженного защитного эффекта в отношении экспериментальной инфекции вирулентными бактериями BP D420 у павианов анубисов, иммунизированных живыми аттенуированными бактериями BP. Менее выраженным защитным эффектом обладают инактивированные бактерии возбудителя (ЦКВ), в то время как БКВ не обеспечивала защиты от размножения бактерий после повторной инфекции [20][21].
Отсутствие специфичных для обезьян тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА) значительно осложняет регистрацию коклюшных антител у этих животных. Если использованная нами тест-система ИФА IgG человека «Ridascreen» оказалась пригодной для регистрации IgG у МР, павианов гамадрилов, макак яванских и макак японских, то тест-система той же фирмы для IgA человека была совершенно не чувствительна к IgA обезьян. Нам удалось определить значения IgМ на разных сроках экспериментальной коклюшной инфекции обезьян с помощью тест-системы ИФА IgМ человека BP «Ridascreen», однако низкие абсолютные значения величин и большой разброс делают непродуктивным их обсуждение. Скорее всего, наблюдаемая картина объясняется недостаточной эффективностью коммерческой тест-системы на сыворотке обезьян. Полученные результаты указывают на необходимость конструирования тест-систем ИФА, специфичных для иммуноглобулинов нечеловекообразных обезьян, в процессе дальнейшего использования этих животных в качестве экспериментальной модели.
Заключение
Интраназальная однократная и повторная инокуляции аттенуированных бактерий BP не вызывали воспалительных процессов в носоглотке МР и изменения лабораторных показателей крови, наблюдаемых после экспериментальной инфекции нечеловекообразных приматов вирулентными бактериями.
Не зарегистрировано повышения уровня общего IgE в сыворотке крови обезьян после и одно- и двукратной иммунизации.
Экспериментальная интраназальная инфекция МР аттенуированными и вирулентными бактериями BP приводит к формированию защитной реакции организма, проявляющейся в подавлении размножения бактерий, ускорении темпов их элиминации из носоглотки животных и развитии гуморального иммунного ответа. Развитие гуморального, антительного ответа после повторной инфекции носит бустерный характер, независимо от штамма бактерий.
Представленные результаты указывают на общие механизмы формирования поствакцинального иммунитета после интраназальной вакцинации животных и постинфекционного противококлюшного иммунитета, обеспечивающих защиту от повторного инфицирования бактериями BP и развития клинических симптомов коклюша.
Об авторах
Алиса Юрьевна Медкова
ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»;ФГБУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента РФ
Email: fake@neicon.ru
к.м.н., с.н.с. лаб. генетики бактерий
зав. инфекционным детским отделением
РоссияЛюдмила Николаевна Синяшина
ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1708-5453
д.м.н., в.н.с. лаб. генетики бактерий Россия
Астанда Арнольдовна Амичба
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-4986-1392
м.н.с. лаб. иммунологии и вирусологии
Евгений Григорьевич Cемин
ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6696-8362
н.с. лаб. генетики бактерий Россия
Зинаида Всеволодовна Шевцова
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии;Абхазский государственный университет
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6471-1608
д.м.н., г.н.с. лаб. вирусологии и иммунологии
проф. каф. экспериментальной биологии и медицины
Алиса Зауровна Матуа
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии;Абхазский государственный университет
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3275-0941
к.б.н., зам. директора по научной работе, зав. лаб. иммунологии и вирусологии
доц. каф. экспериментальной биологии и медицины
Ануш Ашотовна Джидарян
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8792-5289
ст. лаборант лаб. иммунологии и вирусологии
Дженни Тамазовна Кубрава
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9104-4014
м.н.с. лаб. иммунологии и вирусологии
Ирина Георгиевна Конджария
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии;Абхазский государственный университет
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3707-4874
к.б.н., с.н.с. лаб. иммунологии и вирусологии
доц. каф. экспериментальной биологии и медицины
В. С. Баркая
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии
Email: fake@neicon.ru
Зураб Ясонович Миквабия
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0729-6516
д.м.н., проф., директор
Геннадий Иванович Каратаев
ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»
Автор, ответственный за переписку.
Email: karataevgi@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-8771-6092
д.б.н., в.н.с., рук. лаб. генетики бактерий Россия
Список литературы
- Pertussis vaccines: WHO position paper – September 2015. Wkly. Epidemiol. Rec. 2015; 90(35): 433-60.
- Wood N., McIntyre P. Pertussis: review of epidemiology, diagnosis, management and prevention. Paediatr. Respir Rev. 2008; 9(3): 201-11. DOI: http://doi.org/10.1016/j.prrv.2008.05.010
- Wiley K.E., Zuo Y., Macartney K.K., McIntyre P. Sources of pertussis infection in young infants: a review of key evidence informing targeting of the cocoon strategy. Vaccine. 2013; 31(4): 618-25. DOI: http://doi.org/10.1016/j.vaccine.2012.11.052
- Pinto M.V., Merkel T.J. Pertussis disease and transmission and host responses: insights from the baboon model of pertussis. J. Infect. 2017; 74(Suppl. 1): S114-9. DOI: http://doi.org/10.1016/S0163-4453(17)30201-3
- Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н., Амелина И.П., Алексеев Я.И., Каратаев Г.И. и др. Распространенность стертых форм коклюша и анализ фазовых состояний бактерий Bordetella pertussis. Детские инфекции. 2010; 9(4): 19-22.
- CDC. Pertussis epidemic – Washington, 2012. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. 2012; 61(28): 517-22.
- Rosewell A., Spokes P., Gilmour R.E. NSW Annual vaccinepreventable disease report, 2011. NSW Public Health Bull. 2012; 23(9-10): 171-8. DOI: http://doi.org/10.1071/NB12086
- Gonfiantini M.V., Carloni E., Gesualdo F., Pandolfi E., Agricola E., Rizzuto E., et al. Epidemiology of pertussis in Italy: disease trends over the last century. Euro Surveill. 2014; 19(40): 20921. DOI: http://doi.org/10.2807/1560-7917.es2014.19.40.20921
- Health Protection report. Confirmed pertussis in England and Wales: data to end – November 2012. Available at: http://webarchive.nationalarchives.gov.uk/20140505162355/http://www.hpa.org.uk/hpr/archives/2012/news5112.htm
- Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь–октябрь 2018 г. М.; 2018.
- Лобзин Ю.В., Харит С.М. Проблемы вакцинопрофилактики: краткая история, современное состояние и пути решения. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2014; (6): 30-7.
- Warfel J.M., Zimmerman L.I., Merkel T.J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014; 111(2): 787-92. DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.1314688110
- Kilgore P.E., Salim A.M., Zervos M.J., Schmitt H.J. Pertussis: microbiology, disease, treatment, and prevention. Clin. Microbiol. Rev. 2016; 29(3): 449-86. DOI: http://doi.org/10.1128/CMR.00083-15
- Chen Z., He Q. Immune persistence after pertussis vaccination. Hum. Vaccin. Immunother. 2017; 13(4): 744-56. DOI: http://doi.org/10.1080/21645515.2016.1259780
- Guiso N., Njamkepo E., Vié le Sage F., Zepp F., Meyer C.U., Abitbol V., et al. Long-term humoral and cell-mediated immunity after acellular pertussis vaccination compares favourably with whole-cell vaccines 6 years after booster vaccination in the second year of life. Vaccine. 2007; 25(8): 1390-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.vaccine.2006.10.048
- Amirthalingam G., Andrews N., Campbell H., Ribeiro S., Kara E., Donegan K., et al. Effectiveness of maternal pertussis vaccination in England: an observational study. Lancet. 2014; 384(9953): 1521-8. DOI: http://doi.org/10.1016/S0140-6736(14)60686-3
- Сёмин Е.Г., Синяшина Л.Н., Медкова А.Ю. и др. Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий Bordetella pertussis генотипа ptxP3. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; (4): 33-41. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-4-33-4118.
- Синяшина Л.Н., Семин Е.Г., Медкова А.Ю., Сюндюкова Р.А., Каратаев Г.И. Доклиническое исследование токсичности и безопасности кандидатной живой коклюшной вакцины интраназального применения. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2018; 17(6): 98-108. DOI: http://doi.org/10.31631/2073-3046-2018-17-98-108
- Warfel J.M., Beren J., Kelly V.K., Lee G., Merkel T.J. Nonhuman primate model of pertussis. Infect. Immun. 2012; 80(4): 1530-6. DOI: http://doi.org/10.1128/IAI.06310-11
- Warfel J.M., Zimmerman L.I., Merkel T.J. Comparison of three whole-cell pertussis vaccines in the baboon model of pertussis. Clin. Vaccine Immunol. 2015; 23(1): 47-54. DOI: http://doi.org/10.1128/CVI.00449-15
- Locht C., Papin J.F., Lecher S., Debrie A.S., Thalen M., Solovay K., et al. Live attenuated pertussis vaccine BPZE1 protects baboons against B. pertussis. J. Infect. Dis. 2017; 216(1): 117-24. DOI: http://doi.org/10.1093/infdis/jix254
- Кубрава Д.Т., Медкова А.Ю., Синяшина Л.Н., Шевцова З.В., Матуа А.З., Конджария И.Г. и др. Экспериментальный коклюш у обезьян. Вестник Российской академии медицинских наук. 2013; 68(8): 28-33.
- Медкова А.Ю., Каратаев Г.И., Шевцова З.В., Матуа А.З., Семин Е.Г., Амичба А.А. и др. Эпизоотический очаг коклюша у обезьян вида Papio gamadryas. Журнал инфектологии. 2015; 7(3): 103-11. DOI: http://doi.org/10.22625/2072-6732-2015-7-3-103-111
- Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н., Амелина И.П., Алексеев Г.И., Боковой Я.И. и др. Выявление инсерционных мутантов авирулентных bvg-мутантов Bordetella pertussis у больных коклюшем, острой респираторной вирусной инфекцией и практически здоровых людей. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010; (4): 27-31.
- Bidet P., Liguori S., De Lauzanne A., Caro V., Lorrot M., Carol A., et al. Real-time PCR measurement of persistence of Bordetella pertussis DNA in nasopharyngeal secretions during antibiotic treatment of young children with pertussis. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(11): 3636-8. DOI: http://doi.org/10.1128/JCM.01308-08
- Li R., Cheng C., Chong S.Z., Lim A.R., Goh Y.F., Locht C., et al. Attenuated Bordetella pertussis BPZE1 protects against allergic airway inflammation and contact dermatitis in mouse models. Allergy. 2012; 67(10): 1250-8. DOI: http://doi.org/10.1111/j.1398-9995.2012.02884.x
- Нестерова Ю.В., Медкова А.Ю., Бабаченко И.В., Сёмин Е.Г., Калисникова Е.Л., Синяшина Л.Н. и др. Клинико-диагностическое значение генетических маркеров Bordetella pertussis у контактных лиц в семейных очагах. Журнал инфектологии. 2019; 11(1): 17-24. DOI: http://doi.org/10.22625/2072-6732-2019-11-1-17-24
- Каратаев Г.И., Синяшина Л.Н., Медкова А.Ю., Семин Е.Г., Шевцова З.В., Матуа А.З. и др. Инсерционная инактивация оперона вирулентности в популяции персистирующих бактерий Bordetella pertussis. Генетика. 2016; 52(4): 422-30. DOI: http://doi.org/10.7868/S0016675816030085
Дополнительные файлы
