Отправить статью по E-mail Выявление штаммов Vibrio cholerae «гаитянской» группы с помощью полимеразной цепной реакции на основе INDEL-типирования
- Авторы: Водопьянов А.С.1, Водопьянов С.О.1, Олейников И.П.1, Писанов Р.В.1
-
Учреждения:
- ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора
- Выпуск: Том 97, № 3 (2020)
- Страницы: 265-270
- Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Дата подачи: 25.06.2020
- Дата принятия к публикации: 25.06.2020
- Дата публикации: 25.06.2020
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/831
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-3-9
- ID: 831
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Цель работы состояла в целенаправленном поиске генетического INDEL-маркера «гаитянской» группы штаммов холерных вибрионов, позволяющего проводить их идентификацию методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Материалы и методы. Для поиска INDEL-маркеров использованы полученные из системы GenBank данные полногеномного секвенирования штаммов Vibrio cholerae El Tor, изолированных на разных континентах в различные годы. Для анализа применяли авторское программное обеспечение, написанное на языке программирования Java. Для картографирования использована система NextGIS.
Результаты и обсуждение. Установлено, что делеция 8 нуклеотидов в гене VCA1095, расположенном на малой хромосоме и кодирующем chemotaxis protein СheA, является характерным генетическим признаком «гаитянской» группы штаммов. Разработаны праймеры для выявления данной делеции в ПЦР.
Заключение. Разработана методика выявления штаммов холерных вибрионов «гаитянской» группы на основе анализа INDEL-маркеров и показано распределение таких штаммов в мире до и после 2010 г.
Ключевые слова
Полный текст
Расследование вспышек опасных инфекционных заболеваний требует разработки эффективных методик внутривидовой дифференцировки возбудителей и поиска генетических маркеров групп штаммов, имеющих большое эпидемиологическое значение. Так, полногеномное секвенирование штаммов Vibrio cholerae, вызвавших масштабную вспышку холеры на о. Гаити в 2010 г., позволило выявить единичные нуклеотидные замены (SNP) в гене ctxB, что привело к появлению штаммов с уникальным генотипом B7, характеризующихся повышенной вирулентностью [1, 2]. Впоследствии для выявления штаммов, несущих холерный токсин «гаитянского» типа (B7), была разработана аллель-специфичная полимеразная цепная реакция (ПЦР) [3]. Однако использование для дифференциации штаммов лишь нескольких SNP в гене ctxB, на наш взгляд, является ненадежным методом ввиду возможности появления новых нуклеотидных замен в гене холерного токсина.
Одним из простых и удобных методов при учете результатов генотипирования с помощью ПЦР является изучение полиморфизма INDEL-маркеров. Так, разработаны схемы INDEL-генотипирования возбудителя туляремии [4] и холеры [5, 6]. Недавно предложена схема генотипирования штаммов Y. pestis на основе INDEL-маркеров, позволяющая быстро определять биовар с помощью ПЦР [7]. В связи с этим цель настоящего исследования состояла в целенаправленном поиске INDEL-маркера «гаитянской» группы штаммов, позволяющего проводить надежную идентификацию этих штаммов в биологическом материале методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов.
Материалы и методы
Для поиска INDEL-маркеров использованы геномы «гаитянских» штаммов V. cholerae El Tor HC-38A1, HC-06A1, HC-23A1, HC-28A1, HC-43A1, HC-61A1, HC-48B2 и геномы штаммов, изолированных на разных континентах ранее (V. cholerae El Tor N16961, O395, A186, A60, A217, CRC1106, E506, E1162, M2140, E9120, 16241D, 41D, 169D, 1270D). Наименования генов и позицию INDEL-маркера указывали по референсному геному штамма V. cholerae N16961 (GenBank Accession Number NC002505.1 и NC002506.1). Сборку геномов, представленных в виде ридов, проводили с использованием программы «Spades» [8]. Для анализа применяли авторское программное обеспечение GeneExpert, PrimerM и VirtualPCR, написанное на языке программирования Java, для картографирования — систему NextGIS. Встречаемость маркера в популяции V. cholerae оценивали по локальной базе данных, содержащей 900 геномов.
ДНК выделяли с использованием коммерческих наборов реагентов «Проба НК» («ДНК-технология») и «ДНК-Сорб-В» («АмплиСенс»).
ПЦР проводили в объеме 15 мкл в полистироловых микроцентрифужных пробирках на программируемом многоканальном термоциклере «Терцик» («ДНК-технология»). Инкубационная смесь (15 мкл) для ПЦР содержала 20 мМ трис-НО, рН 8,6; 7 мМ MgCI2, 10 мМ (NH4)2SO4, 0,5 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, по 250 мкМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 0,1-1,0 мкМ соответствующего праймера, 2 ед. Taq-полимеразы и 1-10 нг хромосомальной ДНК исследуемого штамма. Режим амплификации после внесения минерального масла: денатурация — 94°С, 35 с, отжиг — 60°С, 25 с, синтез — 72°С, 35 с (всего 40 циклов).
Валидацию размера ампликонов INDEL-маркера «1095» проводили с помощью автоматической электрофорезной станции «Experion™» («Bio- Rad») с применением набора «Experion DNA 1K reagent and Supplies for 10 chips» согласно инструкции производителя.
Детекцию ампликонов и разделение аллелей по заданному локусу осуществляли в неденатурирующем 11% полиакриламидном геле (ПААГ) (2 мкл постреакционной смеси на дорожку геля, длина геля 15 см, 15-20 В/см). В качестве аллельного ладдера использовали смесь всех выявленных аллелей анализируемого локуса. Генотип штамма определяли путем сопоставления длины пробега полученных ампликонов аллелей с ладдерной ДНК после окрашивания геля бромистым этидием (1 мкг/мл) и визуализации в проходящем ультрафиолете (220 нм) трансиллюминатора «ViberLaurmat» («LKB»).
Результаты и обсуждение
Первый этап работы выполняли в программе «GeneExpert», сравнивая попарно все INDEL-маркеры в открытых рамках считывания в геномах штаммов, обусловивших эпидемические осложнения по холере на о. Гаити и имеющих «гаитянский» вариант (B7) гена ctxB [2]. Это позволило оставить для дальнейшего анализа только стабильные INDEL-полиморфизмы, которые были одинаковы у всех изученных «гаитянских» штаммов.
Второй этап работы заключался в сравнительном анализе INDEL-маркеров, отобранных на первом этапе, и аналогичных маркеров токсигенных штаммов V cholerae, выделенных до 2010 г. Это позволило установить, что делеция 8 нуклеотидов в гене VCA1095 (в позиции 422-429), расположенном на малой хромосоме и кодирующем chemotaxis protein CheA, присутствует у всех «гаитянских» и отсутствует у других токсигенных (ctxAB+) штаммов.
На третьем этапе работы с помощью авторской программы «PrimerM» нами были сконструированы праймеры (прямой 5'-ccatcagtctgcctctgacac-3', обратный 5'-ttcgacaatcgtcagtagcg-3'), фланкирующие INDEL-маркер «1095», что дало возможность выявлять его в ПЦР in silico. Для этой цели нами были получены данные полногеномного секвенирования из базы данных GenBank. Обращает на себя внимание, что геномы некоторых штаммов, выделенных в последние годы, представлены только в виде первичных данных секвенирования (ридов), что побудило нас самостоятельно провести их сборку в контиги. В локальной базе полных геномов, использованных на этом этапе работы, была информация о 900 геномах штаммов V cholerae, 520 из которых содержали профаг CTX (гены ctxAB).
Анализ локальной базы данных с помощью программы «VirtualPCR» позволил выявить делецию 8 п.о. (INDEL-маркер «1095») в гене VCA1095 («гаитянский вариант») у 184 штаммов, причем ее наличие четко коррелировало с генотипом B7 гена холерного токсина ctxB. При этом нетоксигенные (ctxAB-) штаммы V. cholerae и штаммы nonО1/ попО139 серогруппы имели «дикий» аллель гена VCA1095 (не содержащий делецию 8 п.о.). На наш взгляд, использование сконструированных нами праймеров является более простым и надежным методом выявления штаммов «гаитянской» группы по сравнению с известными приемами секвенирования или аллель-специфичной ПЦР [2, 3].
Большой интерес вызвало происхождение штаммов с «гаитянским вариантом» INDEL-маркера «1095». Изучение геномов штаммов V. cholerae, представленных в базе GenBank, с помощью программы «VirtualPCR» позволило выявить его присутствие у 9 штаммов, изолированных до возникновения вспышки на о. Гаити в 2010 г. (табл. 1). Примечательно, что у всех штаммов (кроме 2011EL-1137 и MBN17) обнаружен ген ctxB именно «гаитянского генотипа» (B7). Важно отметить, что ранее уже описано обнаружение штаммов, выделенных до 2010 г. и имеющих аллель B7 гена ctxB [3], что косвенно подтверждает наши данные. Полученные нами результаты позволяют рассматривать штаммы 2011EL-1137 и MBN17 как своего рода «прегаитянские».
Таблица 1. Штаммы V. cholerae, выделенные до 2010 г и содержащие «гаитянский вариант» INDEL-маркера «1095»
Table 1. Vibrio cholerae strains, isolated before 2010 year, which contain «Haitian» variant of INDEL-marker «1095»
Штамм Strain | Год Year | Место выделения штамма Place of strain isolation | Тип ctxB [2] Type of ctxB [2] |
|---|---|---|---|
2009V-1085 | 2009 | США, завоз из Шри-Ланка USA, import from Sri Lanka | B7 |
2009V-1096 | 2009 | США, завоз из Индии USA, import from India | B7 |
2009V-1131 | 2009 | США, завоз из Индии USA, import from India | B7 |
2011EL-1137 | 2009 | Южная Африка South Africa | B1 |
3554-08 | 2008 | США, завоз из Непала USA, import from Nepal | B7 |
IDHO1_726 | 2009 | Индия India | B7 |
4519 | 2005 | Индия India | B7 |
MBN17 | 2004 | Индия India | B1 |
4538 | 2007 | Индия India | B7 |
Не менее интересным является анализ штаммов V. cholerae, выделенных после 2010 г. на о. Гаити. Использование программы «VirtualPCR» позволило выявить 74 штамма V. cholerae, несущих «гаитянский вариант» гена VCA1095 с наличием INDEL-маркера «1095» (примеры приведены в табл. 2). Обращает на себя внимание, что именно эти штаммы были занесены в города Мариуполь (2011 г.) и Москва (2012 г.). Именно в этот период в Ростове-на-Дону были выделены токсигенные штаммы, не содержащие INDEL-маркер «1095» в локусе VCA1095 и имеющие ctxB генотипа B3, что подтверждает циркуляцию в настоящее время штаммов «гаитянского» и других генотипов. Также необходимо отметить, что штаммы, ежегодно выделяемые от людей в округе Дели (Индия) и полученные при вспышке холеры в Республике Йемен, тоже несут «гаитянский вариант» гена VCA1095 с наличием INDEL-маркера «1095» и ctxB, несущих аллель B7 [9].
Таблица 2. Штаммы V. cholerae, выделенные после 2010 г., содержащие «гаитянский» аллель INDEL-маркера «1095»
Table 2. V. choleraе strains, isolated after 2010 year, which contain «Haitian» variant of INDEL-marker «1095»
Год выделения Isolation year | Место выделения, по данным GenBank Place of strain isolation based on GenBank data |
|---|---|
2011 | Доминиканская Республика Dominican Republic |
2011 | Бангладеш / Bangladesh |
2011 | Украина, Донецкая область, Мариуполь Ukraine, Donetsk region, Mariupol |
2011 | Камерун / Cameroon |
2012 | Гаити / Haiti |
2012 | Россия, Москва / Russia, Moscow |
2013 | Индия, штат Керала India, Kerala |
2014 | Гаити, Юго-Восточный департамент Haiti, South-Eastern Department |
2014 | Уганда / Uganda |
2015 | Танзания, Сингида Tanzania, Singida |
2015 | Танзания, Maрa / Tanzania, Mara |
2015 | Танзания, Дар-эс-Салам Tanzania, Dar es Salaam |
2015 | Танзания, Морогоро Tanzania, Morogoro |
2015 | Индия, штат Западная Бенгалия, Калькутта India, West Bengal state, Calcutta |
2016 | Уганда, Истерн-Уганда, Мбале Uganda, Eastern Uganda, Mbale |
2016 | Йемен / Yemen |
2016 | Индия, Дели / India, New Delhi |
2017 | Йемен / Yemen |
2017 | Индия, Дели / India, New Delhi |
Размер описываемой делеции в гене VCA1095 составляет 8 нуклеотидов, что не кратно стандартному кодирующему триплету, ее появление в геноме «гаитянских» штаммов приводит к сдвигу рамки считывания и формированию стоп-кодона (рис. 1). Таким образом, согласно данным биоинформационного анализа, делеция 8 п.о. приводит к синтезу трункированного протеина размером 626 аминокислот против 720 аминокислот у штаммов «дикого» варианта. Судя по широкому распространению данной делеции, в популяции она, возможно, способствует выживанию вибрионов.
Рис. 1. Фрагмент выравнивания аминокислотных последовательностей белка, кодируемого геном VCA1095, у штамма V. cholerae HC1037, содержащего «гаитянский вариант» INDEL-маркера «1095» (вверху), и штамма V. cholerae N16961, не имеющего делеции 8 п.о. (внизу).Звездочками указан отсутствующий фрагмент гена.
Fig. 1. Fragment of alignment of amino acid sequences of the protein encoded by the VCA1095 gene in the V. cholerae HC1037 strain containing the «Haitian variant» of the INDEL-marker «1095» (top) and the V. cholerae N16961 strain, which does not have a deletion of 8 nucleotides (bottom).
Asterisks indicate the missing gene fragment.
Следующим этапом работы было проведение ПЦР in vitro со сконструированными праймерами, фланкирующими делецию 8 п.о. в гене VCA1095. Проведение электрофореза на ДНК-чипах системы «Experion™» позволило подтвердить соответствие размера полученных ампликонов данным биоинформационного анализа: наличие INDEL-маркера «1095» — 87 п.о. и отсутствие INDEL-маркера «1095» — 95 п.о. (нижний и верхний фрагменты на электрофореграмме соответственно).
Для дальнейшей работы нами был составлен аллельный ладдер («аллельная лестница»), содержащий амплифицированные фрагменты обоих аллелей гена VCA1095, что дало возможность проводить учет результатов ПЦР с помощью электрофореза в 11% ПААГ (рис. 2). На наш взгляд, это позволяет рекомендовать разработанную пару праймеров для быстрой идентификации штаммов «гаитянского» типа методом ПЦР.
Рис. 2. Результат электрофореза в 11% ПААГ продуктов амплификации образцов ДНК V. cholerae со специфическими праймерами, фланкирующими INDEL-маркер «1095».3 и 7 — маркеры молекулярного веса, содержащие смесь ампликонов размером 95 и 87 п.о.; 2 и 6 — результат амплификации гена VCA1095, не содержащего INDEL-маркер «1095» (95 п.о.); 1, 4 и 5 — результат амплификации гена VCA1095 «гаитянского» типа (87 п.о.) с наличием INDEL-маркера «1095».
Fig. 2. Results of electrophoresis in 11% PAAG of fragments of V. cholerae DNA amplified with specific primers flanking the INDEL-marker «1095».
3 and 7 — markers of molecular weight, containing a mixture of amplicons of size alleles 95 and 87 nucleotides; 2 and 6 — the result of amplification of gene VCA1095 not containing the INDEL-marker «1095» (95 nucleotides); 1, 4 and 5 — the result of amplification of gene VCA1095 «Haitian» type (87 nucleotides) with the presence of the INDEL-marker «1095».
Нам представлялось интересным изучить штаммы V. cholerae, для которых ранее были получены противоречивые результаты при проведении исследования разными группами авторов. Так, ранее анализ данных полногеномного секвенирования позволил выявить, что изоляты V. cholerae O1 № 19187 и 19188, выделенные в 2010 г. в Москве, согласно данным SNP-типирования относятся к штаммам «гаитянской группы» [10]. Однако при анализе с использованием другого набора SNP указанные штаммы попали в группу «непальских штаммов», дистанцированную от штаммов, вызвавших вспышку на о. Гаити [11]. Проведение как виртуальной ПЦР in silico, так и последующей ПЦР in vitro позволило установить у данных штаммов наличие «гаитянского варианта» гена VCA1095 с присутствием INDEL-маркера «1095». В пользу правомочности такого результата свидетельствует наличие у данных штаммов аллеля B7 гена ctxB, что также является признаком «гаитянских» штаммов.
Заключение
В ходе исследования апробирована методика целенаправленного поиска INDEL-маркеров для выявления заранее известной группы штаммов. Обнаружен «гаитянский» вариант гена VCA1095, содержащий INDEL-маркер «1095», являющийся отличительным признаком штаммов, обусловивших эпидемические осложнения по холере на о. Гаити в 2010 г. и в Республике Йемен в 2016-2017 гг. Сконструированы праймеры и подобраны условия для выявления делеции 8 п.о. методом ПЦР, что позволило подтвердить принадлежность штаммов V. cholerae O1 № 19187 и 19188, выделенных в 2010 г. в Москве, к «гаитянской» группе. Показано мировое распространение штаммов, несущих «гаитянский вариант» гена VCA1095 с наличием INDEL-маркера «1095», до и после 2010 г.
Об авторах
Алексей Сергеевич Водопьянов
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора
Автор, ответственный за переписку.
Email: alexvod@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9056-3231
к.м.н., с.н.с. группы вирусологии Россия
Сергей Олегович Водопьянов
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4336-0439
д.м.н., зав. лаб. биохимии микробов Россия
Игорь Павлович Олейников
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2390-9773
н.с. лаб. биохимии микробов Россия
Руслан Вячеславович Писанов
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7178-8021
к.б.н., зав. лаб. диагностики особо опасных инфекций Россия
Список литературы
- Ghosh P., Sinha R., Samanta P., Saha D.R., Koley H., Dutta S., et al. Haitian variant Vibrio cholerae O1 strains manifest higher virulence in animal models. Front. Microbiol. 2019; (10): 111. DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00111
- Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1): 46-54. DOI: http://doi.org/10.1016/j.tim.2009.10.003
- Naha A., Pazhani G.P., Ganguly M., Ghosh S., Ramamurthy T., Nandy R.K., et al. Development and evaluation of a PCR assay for tracking the emergence and dissemination of Haitian variant ctxB in Vibrio cholerae O1 strains isolated from Kolkata, India. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(5): 1733-6. DOI: http://doi.org/10.1128/JCM.00387-12
- Larsson P., Svensson K., Karlsson L., Guala D., Granberg M., Forsman M., et al. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis. Emerg. Infect. Dis. 2007; 13(11): 1725-32. DOI: http://doi.org/10.3201/eid1311.070603
- Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишанькин Б.Н., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. и др. INDEL- и VNTR-типирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных в 2013 году из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации. Здоровье населения и среда обитания. 2015; (5): 41-4.
- Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишанькин Б.Н. INDEL-типирование штаммов Vibrio choleraе. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2017; 22(4): 195-200. DOI: http://doi.org/10.18821/1560-9529-2017-22-4-195-200
- Kutyrev V.V., Eroshenko G.A., Motin V.L., Nosov N.Y., Krasnov J.M., Kukleva L.M., et al. Phylogeny and Classification of Yersinia pestis through the lens of strains from the plague foci of Commonwealth of Independent States. Front. Microbiol. 2018; 9: 1106. DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01106
- Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., et al. SPAdes: A new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5): 455-77. DOI: http://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021
- Weill F.X., Domman D., Njamkepo E., Almesbahi A.A., Naji M., Nasher S.S., et al. Genomic insights into the 2016–2017 cholera epidemic in Yemen. Nature. 2019; 565(7738): 230-3. DOI: http://doi.org/10.1038/s41586-018-0818-3
- Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н., Олейников И.П., Кругликов В.Д. и др. Молекулярная эпидемиология Vibrio cholerae – разработка алгоритма анализа данных полногеномного секвенирования. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2016; 21(3): 146-52. DOI: http://doi.org/10.18821/1560-9529-2016-21-3-146-152
- Kuleshov K.V., Vodop'ianov S.O., Dedkov V.G., Markelov M.L., Deviatkin A.A., Kruglikov V.D., et al. Travel-associated Vibrio cholerae O1 El Tor, Russia. Emerg. Infect. Dis. 2016; 22(11): 2006-8. DOI: http://doi.org/10.3201/eid2211.151727
Дополнительные файлы
