Индикация и идентификация вирусов денге и Чикунгунья в комарах рода Aedes spp., отловленных в Центральной Америке

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Целью работы было выделение арбовирусов из комаров различных видов в культуре клеток и их идентификация молекулярными и иммунохимическими методами.

Материалы и методы. Выделение вирусов проводилось на клетках C6/36. Возбудителей идентифицировали с использованием наборов для иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления антигенов вирусов денге, Чикунгунья, ВЗН и Синдбис и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) со специфическими праймерами с последующим секвенированием по Сенгеру.

Результаты. Всего было исследовано 102 комара, относящихся к трем родам: Culex spp., Culiseta spp., Aedes spp. Комары каждого вида или рода были разделены на пулы по 4–5 особей. При исследовании суспензий только 2 пулов комаров, полученных от Aedes aegypti и Aedes albopictus, начиная с 3-го пассажа отмечены изменения монослоя клеток C6/36. В материалах суспензии, полученной из пула Aedes albopictus, начиная с 4-го пассажа методом ИФА выявлялся антиген вируса Чикунгунья. В материалах, полученных из пула Aedes aegypti, на 5-м пассаже определялся вирус денге. Таким образом, только в 2 из 23 исследованных пулов комаров разных родов определялись антигены вирусов Чикунгунья или денге. Материалы 5-го пассажа были исследованы в ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к вирусам денге и Чикунгунья. Подтверждено, что изолят, полученный от комаров Aedes albopictus, содержал РНК вируса Чикунгунья и соответствовал Восточному/Центральному/Южно-Африканскому генотипу, а изолят, полученный от комаров Aedes aegypti, содержал РНК вируса денге 2-го типа.

Заключение. Полученные нуклеотидные последовательности вируса Чикунгунья были депонированы в международной базе данных GenBank под номерами MN271691 и MN271692.

Полный текст

Введение

Комары различных родов являются перено­счиками целого ряда возбудителей вирусных забо­леваний, прежде всего относящихся к семействам Flaviviridae (род Flavivirus) и Togaviridae (род Alfavirus) [1, 2]. Ареал распространения комаров родов Aedes spp., Culex spp., Culiseta spp. не огра­ничивается странами, расположенными в тропиче­ской и субтропической зонах. Комары этих видов распространены в странах с умеренным климатом в Южном и Северном полушариях [2-4]. В связи с этим возрастает вероятность смены переносчика, что, в свою очередь, может приводить к изменениям инфекционности вирусов для человека [5].

Для вируса Чикунгунья описаны три геноти­па: Восточный/Центральный/Южно-Африканский, Западно-Африканский и Азиатский [6]. Увеличение выявляемости вируса Чикунгунья в отловленных комарах и у заболевших людей привело к более подробному изучению нуклеотидных последова­тельностей его изолятов, из-за чего изменилось представление о генотипах данного патогена. В частности, некоторыми исследователями предла­гаются генотипы линии Индийского океана и ка­рибский [6-8]. Для вируса денге описаны только 4 серотипа [5, 9]. Учитывая растущую выявляемость вирусов, переносимых комарами, и их патогенность для человека, разработка средств профилактики и лечения заболеваний, вызываемых альфа- и флави- вирусами, остается актуальной. Выделение вирусов непосредственно от переносчиков, отловленных в естественных ареалах обитания, и изучение выде­ленных штаммов являются составной частью этого процесса.

Целью данной работы были выделение и идентификация арбовирусов, принадлежащих ро­дам Flavivirus и Alfavirus, из комаров видов Aedes albopictus, Aedes aegypti, Culiseta spp., Culex spp.

Материалы и методы

Комары были отловлены в сухой сезон в лесной зоне в Никарагуа (муниципалитет Типитапа) с ко­ординатами 12.325527N 85.974662W и 12.323326N 85.974275W. Среди отловленных комаров были представители родов Aedes (виды Aedes albopictus, Aedes aegypti), Culiseta spp. и Culex spp. После опре­деления видов комары были разделены на пулы по 4-5 особей одного вида. Каждый пул был гомоге­низирован до получения суспензии в объеме 0,4 мл фосфатно-солевого буфера рН 7,4.

Выделение вируса. Полученную суспензию комаров наносили на монослой комариных клеток линии С6/36, выращенный в культуральных флако­нах («Coming», США) площадью 25 см2. После 1 ч адсорбции во флаконы добавляли среду поддержки DMEM (ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова» РАН) с 2% фетальной эмбриональной сывороткой («Gibco»). Флаконы находились в термостате при 32°С с 5% содержанием СО2. Наблюдение за мо­нослоем проводили ежедневно под микроскопом до появления цитопатического действия.

Определение антигенов вирусов. Для опре­деления антигенов вирусов Чикунгунья, Денге, Синдбис и вируса Западного Нила в образцах куль­туральной жидкости использовали наборы реаген­тов компании «Биосервис»: «БиоСкрин-Денге» (комплект AG), «БиоСкрин-Чикунгунья» (комплект AG), «БиоСкрин-ВЗН» (комплект AG), «БиоСкринСиндбис» (комплект AG). Постановку реакции и учет результатов проводили согласно инструкции к наборам реагентов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Из 100 мкл вируссодержащей культуральной жидко­сти с помощью комплекта реагентов «АмплиСенс® Магно-Сорб» («ИнтерЛабСервис») выделяли РНК согласно инструкции производителя.

Далее с использованием обратных праймеров для вируса Чикунгунья: pE2CHVrev1, pE2CHVrev2. pElCHVrevl, pE1CHVrev2, pNSlCHVrevl, pNS1 CH-Vrev2, pNS1CHVrev3 (табл. 1); для вируса денге — pDV2rt (5’-CAGCCATGGCAGCGGTAGGTC-3’) и набора реагентов для обратной транскрипции (ОТ) («Синтол») на матрице вирусной РНК проводили реакцию ОТ и получали кДНК. На первом этапе смешивали 2 мкл обратного праймера (10 пкмоль/ мкл) с 6 мкл выделенной РНК и прогревали смесь при 95°С 5 мин. После этого пробирки охлажда­ли при комнатной температуре 2 мин, добавляли в них 22 мкл смеси для ОТ (9 мкл деионизированной воды, 12 мкл 2,5-кратного буфера для ОТ, 2,5 мкл MMLV-ревертазы) и инкубировали при 42°С 30 мин. Для инактивации ревертазы смесь прогревали в те­чение 5 мин при 95°С.

Для получения фрагментов генов El, Е2 и NS1 вируса Чикунгунья и их секвенирования использо­вали олигонуклеотиды, описанные в табл. 1.

 

Таблица 1. Праймеры, использованные для ОТ, ПЦР и секвенирования вируса Чикунгунья

Table 1. Primers used for RT, PCR and sequencing of the Chikungunya virus

Номер комплекта праймеров

Ref No. of primers

Праймер

Primer index

Ген белка

Protein gene

Последовательность праймера

Sequence of the primer

Координаты

Coordinates

Размер ПЦР- продукта, п.н.

Size of the PCR- product, b.p.

1

pE1CHVfor1

pE1CHVrev1

Е1

5'-GAACTGACACCAGGAGCTACCGTCC-3'

5'-CGCCAAATTGTCCTGGTCTTCCTG-3'

9745-10600

856

2

pE1CHVfor2

pE1CHVrev2

 

5'-AACATGGACTACCCGCCCTT-3'

5'-GTGCCTGCTRAACGACACGC-3'

10552-11313

762

1

pE2CHVfor1

pE2CHVrev1

Е2

5'-TTCAATGTCTATAAAGCCACAAGACC-3'

5'-GTGATTGGTGACCGCGGCATG-3'

8560-9240

681

2

pE2CHVfor2

pE2CHVrev2

 

5'-GYCAGACGGTGCGGTACAAGTG-3'

5'-GCAGCATATTAGGCTAAGCAGGAAAG-3'

9125-9794

670

1

pNS1CHVfor1

pNS1CHVrev1

NS1

5'-ATGGATYCTGTGTACGTGGAYATAGAC-3'

5'-GGTGRTATAGCGACGTGGGTGC-3'

80-572

493

2

pNS1CHVfor2

pNS1CHVrev2

 

5'-CATGTAGACAGAGAGCAGACGTCGC-3'

5'-CCTCCGGCGTGACTTCTGTAGC-3'

498-1139

642

3

pNS1CHVfor3

pNS1CHVrev3

 

5'-CGTGCCGGCGACCATTTGTG-3'

5'-GCKCCTCTMGGAGTCTCTATTATTCC-3'

1078-1710

633

ПЦР на кДНК, полученной после ОТ, проводи­ли с использованием следующих комбинаций прай­меров для вируса Чикунгунья:

  • ген Е1 — pE1CHVfor1 и pE1CHVrev1, pE1CHVfor2 и pE1CHVrev2;
  • ген Е2 — pE2CHVfor1 и pE2CHVrev1, pE2CHVfor2 и pE2CHVrev2;
  • ген NS1 — pNS1CHVfor1 и pNS1CHVrevL pNS1CHVfor2 и pNS1CHVrev2, pNS1CHV- for3 и pNS1CHVrev3.

Для вируса денге ПЦР проводили при ранее описанных условиях [10]: pDV2for (5’-CCAAAAACCCGCCACTCTAAGG-3’) и pDV2rev (5’-GTTAT CACGACAGTGTATTCCA-3’). ПЦР-смесь полу­чали смешиванием по 1 мкл прямого и обратно­го праймеров с концентрацией 10 пкмоль/мкл, 10 мкл универсальной 2,5-кратной реакционной сме­си для ПЦР («Синтол»), 8 мкл деионизированной воды с последующим добавлением 5 мкл кДНК. Амплификацию проводили на приборе XP Cycler («Hangzhou Bioer Technology») по следующей про­грамме: 95°С — 1 мин 30 с; 30 циклов: 95°С — 20 с, 55°С — 15 с, 72°С — 30 с; финальная элонгация: 72°С — 10 мин. Программа для амплификации ви­руса денге: 95°С — 1 мин 30 с; 40 циклов: 95°С — 20 с, 57°С — 15 с, 72°С — 30 с; финальная элонга­ция 72°С — 10 мин.

Определение инфицированности (minimum infection rate, MIR) исследованных комаров прово­дили, как описано ранее [11, 12].

Результаты

Всего обследовано 102 комара трех родов (табл. 2). Наибольшее количество комаров относи­лось к роду Aedes, представленному видами Aedes aegypti и Aedes albopictus. Каждый образец суспен­зии прошел 4 последовательных «слепых» пассажа на клетках С6/36. Контроль за состоянием моно­слоя клеток проводили под микроскопом в течение 5 дней после пассажа.

 

Таблица 2. Род комаров, общее количество и количество исследованных пулов

Table 2. Mosquito genus and total number of mosquitoes; number of studied pools

Род комаров

Mosquito genus

Количество комаров

Number of mosquitoes

Количество пулов

Number of pools

ИФА / ELISA

ПЦР/PCR

денге

dengue

Чикунгунья

Chikungunya

денге

dengue

Чикунгунья

Chikungunya

Culex spp.

16

4

0/4

0/4

0/4

0/4

Culiseta spp.

21

5

0/5

0/5

0/5

0/5

Aedes spp.

65

16

1/16

1 /16

1 /16

1 /16

Aedes aegypti

28

7

1/7

0/7

1/7

0/7

Aedes albopictus

37

9

0/9

1/9

0/9

1/9

В результате подтверждено, что изолят, по­лученный из комаров Aedes albopictus, содержал РНК вируса Чикунгунья и не содержал РНК ви­руса денге. Изолят, полученный от комаров Aedes aegypti, содержал РНК вируса денге и не содержал РНК вируса Чикунгунья. Изолят денге по резуль­татам секвенирования был отнесен ко 2-му типу. ПЦР-продукты генов Е1, Е2 и NS1, полученные при амплификации изолята вируса Чикунгунья, также были отсеквенированы.

Полученные последовательности пред­ставлены в GenBank под номерами MN271691 и MN271692. С помощью компьютерной программы BLAST нуклеотидные последовательности изолята вируса Чикунгунья были отнесены к Восточному/ Центральному/Южно-Африканскому генотипу.

При исследовании суспензий только в 2 пу­лах комаров, полученных от Aedes aegypti и Aedes albopictus, начиная с 3-го пассажа были отмечены изменения монослоя клеток. На 4-м пассаже пула Aedes aegypti цитопатическое действие отмечалось на 4-е сутки, а для пула Aedes albopictus — на 3-и сутки. После дополнительного, 5-го пассажа на клетках С6/36 материалы указанных пулов были ис­следованы в ИФА (наборы реагентов «Биосервис») на определение наличия антигенов вирусов денге, Чикунгунья, Западного Нила и Синдбис.

В пулах Aedes aegypti и Aedes albopictus в ма­териалах всех исследованных пассажей антигены вирусов Западного Нила и Синдбис не выявлены (табл. 2). В то же время в материалах суспензии, полученной из пула Aedes albopictus, начиная с 4-го пассажа выявлялся антиген вируса Чикунгунья. В материалах, полученных из пула Aedes aegypti, на 5-м пассаже определялся вирус денге (рисунок). Таким образом, только в 2 из 25 исследованных пу­лов комаров разных родов определялись антигены вирусов Чикунгунья или денге.

 

Электрофорез фрагментов генов вируса Чикунгунья (а) и денге (б) в 1% агарозном геле. а — ПЦР-продукты фрагментов генов Е1, Е2 и NS1 вируса Чикунгунья. 1-3 — номера комплекта праймеров (табл. 1); б — ПЦР-продукты фрагмента гена поверхностного белка виру­са денге, полученного на 4-м (DV2-1) и 5-м (DV2-3) пассажах. М 100 bp — весовой ДНК-маркер, 100 п.о.

The electrophoresis of gene fragments of Chikungunya (a) and dengue (b) viruses in 1% agarose gel. a — PCR products of E1, E2 and NS1 gene fragments of the Chikungunya virus. 1-3 — the reference numbers of primers (Table 1); b — PCR products of the gene fragment of the surface protein of the dengue virus, which was obtained on the 4th (DV2-1) and 5th (DV2-3) passages. M 100 bp — the DNA molecular weight marker, 100 bp.

 

Инфицированность (MIR) составила для Aedes aegypti 0,0357, для Aedes albopictus — 0,0270. Таким образом, пулы, содержащие антигены Чикунгунья и денге, на 4-м и 5-м последовательных пассажах вы­зывали цитопатическое действие на клетках С6/36. Материал 5-го пассажа обоих пулов комаров был исследован в ОТ-ПЦР со специфическими прайме­рами к вирусам денге и Чикунгунья.

Обсуждение

В странах Центральной Америки распростра­нение вирусов денге и Чикунгунья связано с кома­рами вида Aedes. Сбор насекомых проводится, как правило, в местах проживания человека [2-5, 9, 12]. В нашем исследовании комары 3 видов были отловлены вне населенных пунктов, в лесной зоне. При определении инфицированности комаров это­го вида тем или иным вирусом важным фактором является количество комаров в исследуемом пуле. Оптимальным является пул, состоящий из 4 кома­ров [2, 11, 12]. Для детекции вирусов в пулах ко­маров используется ПЦР, в случае положительного результата проводится секвенирование получен­ного ампликона. Данных об использовании ИФА в опубликованных статьях нет.

В связи с ограниченным объемом первичной суспензии комаров в нашем исследовании прове­дение детекции вирусов после «слепых» последо­вательных пассажей на клетках C6/36 полностью оправданно. Использование для детекции вируса ИФА, как и проведение ОТ-ПЦР, позволяет прове­сти детекцию двумя независимыми методами.

×

Об авторах

Георгий Михайлович Игнатьев

ФГБНУ «Федеральный научный центр исследования и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова»

Автор, ответственный за переписку.
Email: marburgman@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9731-3681
д.м.н., проф., зам. руководителя производственного направления Россия

Константин Владимирович Каа

ФГБНУ «Федеральный научный центр исследования и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8446-1853
асп. лаб. молекулярной биологии вирусов Россия

Алексей Сергеевич Оксанич

ЗАО БТК «Биосервис»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8600-7347
к.б.н., генеральный директор Россия

Лилия Петровна Антонова

ФГБНУ «Федеральный научный центр исследования и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1221-1134
асп. лаб. молекулярной биологии вирусов Россия

Татьяна Геннадьевна Самарцева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3264-6722
м.н.с. Россия

Кирилл Михайлович Мефед

ФГБНУ «Федеральный научный центр исследования и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7335-1982
к.б.н., зам. нач. отдела управления качеством Россия

Динора Абдуллаевна Яковлева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8771-4177
к.м.н., с.н.с. Россия

Екатерина Николаевна Жиренкина

ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-0810-5985
к.м.н., зам. директора по научной работе Россия

Список литературы

  1. Kraemer M.U.D., Sinka M.E., Duda K.A., Mylne A., Shearer F.M., Brady O.J., et al. The global compendium of Aedes aegypti and Aedes albopictus occurrence. Sci. Data. 2015; 2: 150035. DOI: http://doi.org/10.1038/sdata.2015.35
  2. Ponce P., Morales D., Argoti A., Cevallos V.E. First report of Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), the Asian tiger mosquito, in Ecuador. J. Med. Entomol. 2018; 55(1): 248‐9. DOI: http://doi.org/10.1093/jme/tjx165
  3. Cevallos V., Ponce P., Waggoner J.J., Pinsky B.A., Coloma J., Quiroga C., et al. Zika and Chikungunya virus detection in naturally infected Aedes aegypti in Ecuador. Acta Trop. 2018; 177: 74-80. DOI: http://doi.org/10.1016/j.actatropica.2017.09.029
  4. Waggoner J.J., Gresh L., Vargas M.J., Ballesteros G., Tellez Y., Soda K.J., et al. Viremia and clinical presentation in Nicaraguan patients infected with Zika virus, Chikungunya virus, and Dengue virus. Clin. Infect. Dis. 2016; 63(12): 1584-90. DOI: http://doi.org/10.1093/cid/ciw589
  5. Vega-Rua A., Zouache K., Caro V., Diancourt L., Delaunay P., Grandadam M., et al. High efficiency of temperate Aedes albopictus to transmit Chikungunya and dengue viruses in the Southeast of France. PLoS One. 2013; 8(3): e59716. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0059716
  6. Intayot P., Phumee A., Boonserm R., Sor-Suwan S., Buathong R., Wacharapluesadee S., et al. Genetic characterization of Chikungunya virus in field-caught Aedes aegypti mosquitoes collected during the recent outbreaks in 2019, Thailand. Pathogens. 2019; 8(3): 121. DOI: http://doi.org/10.3390/pathogens8030121
  7. Chen R., Puri V., Fedorova N., Lin D., Hari K.L., Jain R., et al. Comprehensive genome scale phylogenetic study provides new insights on the global expansion of Chikungunya virus. J. Virol. 2016; 90(23): 10600‐11. DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.01166-16
  8. Villero-Wolf Y., Mattar S., Puerta-González A., Arrieta G., Muskus C., Hoyos R., et al. Genomic epidemiology of Chikungunya virus in Colombia reveals genetic variability of strains and multiple geographic introductions in outbreak, 2014. Sci. Rep. 2019; 9(1): 9970. DOI: http://doi.org/10.1038/s41598-019-45981-8
  9. Guzman M.G., Halstead S.B., Artsob H., Buchy P., Farrar J., Gubler D.J., et al. Dengue: a continuing global threat. Nat. Rev. Microbiol. 2010; 8(12 Suppl.): S7‐S16. DOI: http://doi.org/10.1038/nrmicro2460
  10. Букин Е.К., Отрашевская Е.В., Воробьева М.С., Игнатьев Г.М. Сравнительное изучение показателей гемостаза и продукции цитокинов при экспериментальной инфекции вирусом денге. Вопросы вирусологии. 2007; 52(2): 32-6.
  11. Gu W., Unnasch T.R., Katholi C.R., Lampman R., Novak R.J. Fundamental issues in mosquito surveillance for arboviral transmission. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2008; 102(8): 817-22. DOI: http://doi.org/10.1016/j.trstmh.2008.03.019
  12. Medeiros A.S., Costa D.M.P., Branco M.S.D., Sousa D.M.C., Monteiro J.D., Galvão S.P.M., et al. Dengue virus in Aedes aegypti and Aedes albopictus in urban areas in the state of Rio Grande do Norte, Brazil: Importance of virological and entomological surveillance. PLoS One. 2018; 13(3): e0194108. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0194108

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Электрофорез фрагментов генов вируса Чикунгунья (а) и денге (б) в 1% агарозном геле. а — ПЦР-продукты фрагментов генов Е1, Е2 и NS1 вируса Чикунгунья. 1-3 — номера комплекта праймеров (табл. 1); б — ПЦР-продукты фрагмента гена поверхностного белка виру­са денге, полученного на 4-м (DV2-1) и 5-м (DV2-3) пассажах. М 100 bp — весовой ДНК-маркер, 100 п.о.

Скачать (102KB)
Метаданные

© Игнатьев Г.М., Каа К.В., Оксанич А.С., Антонова Л.П., Самарцева Т.Г., Мефед К.М., Яковлева Д.А., Жиренкина Е.Н., 2020

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах