Тетрануклеотидный профиль герпесвирусных ДНК

Полный текст

Введение

Герпесвирусы семейства Herpesviridae, вклю­чая HHV, делятся на три подсемейства: альфа-HV. бета-HV и гамма-HV [1]. Другой классификацией HV является классификация по макроструктуре ДНК (рис. 1). Она не совсем совпадает с делением на подсемейства и, в соответствии с общеприняты­ми взглядами [2], образует 6 классов — от A до F.

 

 

Альфа-HHV (HHV1, HHV2 и HHV3), а так­же бета-HHV (HHV5) содержат двухсегментную ДНК; каждый сегмент ограничен взаимно инвер­тированными мономерными концевыми повторами TR₁ (ДНК классов D и E). ДНК HHV класса A (бета-HHV: HHV6A, HHV6B и HHV7) представляет собой несегментированную уникальную линейную последовательность, ограниченную прямыми мо­номерными концевыми повторами TR₁, содержа­щими по два «островка» теломероподобных гекса­нуклеотидов. Гамма-HHV содержат ДНК классов B и C, которые имеют уникальную последователь­ность, ограниченную прямыми тандемно органи­зованными короткими (т.е. не мономерными) по­вторами, TR₂.

Сегменты и концевые повторы ДНК класса F не структурированы, хотя иногда они просто не показаны в GenBank. Существуют герпесвирус­ные ДНК с более экзотической макроструктурой (например, скутавирусы), но их очень немного. Данные, полученные нами в предлагаемой работе, позволили нам объединить классы A, D и E в одну группу (сегменты ДНК, ограниченные мономерны­ми концевыми повторами), а B, C и F — в другую (отсутствие макроструктуры или нефиксированное число тандемно организованных коротких конце­вых повторов).

Ранее мы заметили, что молекулы ДНК гер- песвируса и его хозяина содержат короткие (20-29 нт) идентичные последовательности — микрого­мологии, концентрация которых не случайна и, как мы полагаем, объясняется длительными (в эволюционном масштабе) близкими межгеномными отношениями между партнерами [3]. Позже [4, 5] мы обнаружили, что такие микрогомологии имеют характерные особенности распределения в геноме герпесвируса, концентрируясь в основном в его концевых (прямых или инвертированных) повто­рах, особенно в тех областях TR, в которых нет ге­нов. Самое интересное — это последовательность видов HHV по нарастанию плотности геномных микрогомологий вирус/хозяин, которая согласуется с макроструктурой ДНК: меньшая плотность — в двухсегментных ДНК, большая — в несегментированных. В качестве рабочей гипотезы мы предпо­ложили, что двухсегментные вирусные геномы, у которых терминальные повторы взаимно инверти­рованы, склонны в латентном состоянии замыкать­ся, скорее, на себя (подобно эписомам) и меньше взаимодействовать с хозяйской ДНК, в то время как односегментные, имеющие прямые повторы, могут вытягиваться вдоль хозяйской ДНК, что облегчает межгеномное взаимодействие.

В качестве подхода для анализа мы исполь­зовали сравнение частот нуклеотидов в молекулах ДНК и второе правило четности ДНК Чаргаффа, CPR2 [6], которое становится наглядным в ДНК размером более 100 000 нт [7, 8]. CPR2 формулиру­ется так же, как первое (CPR1), но относится толь­ко к одной цепи ДНК. Оно имеет приблизительную точность, которая увеличивается по мере удлине­ния анализируемой цепи. Оно относится не только к моно-, но и к олигонуклеотидам до 10-15 нт — с уменьшением строгости по мере удлинения анали­зируемого олигонуклеотида [7, 9]. В метагеномике часто используется тетрануклеотидный анализ для формирования молекулярных сигнатур [10]. Частота тетрануклеотидов (TN) в геномах герпесвирусов достоверно соответствует CPR2 и обеспечивает бо­лее детальную характеристику ДНК, чем моно-, ди- и тринуклеотиды [7, 11]. В принципе, симметрии TN генома HHV были описаны ранее [12], но они только подтвердили соответствие CPR2. Наш под­ход обнаруживает другие необычные свойства этих геномов.

Цель настоящей работы — продолжение ана­лиза формальных характеристик герпесвирусных ДНК, а также сопоставление их с плотностью ДНК-микрогомологий вирус/хозяин и с геномной макроструктурой герпесвирусов.

Материалы и методы

Мы проанализировали около 90% нуклеотид­ных последовательностей полноразмерных моле­кул вирусной ДНК каждого рода всех трех семейств герпесвирусов позвоночных и беспозвоночных, содержащихся в GenBank. Проанализировав по 20 штаммов и изолятов каждого из 5 типов HHV (HHV1, HHV2, HHV3, HHV4, HHV5), 10 штаммов

HHV8, 5 штаммов HHV6A, 4 штамма HHV6B и 3 штамма HHV7, мы убедились в практической иден­тичности внутривидовых результатов и поэтому приводим в таблицах данные только по ДНК рефе- ренс-штаммов каждого вида герпесвирусов.

Для сравнения использовали ДНК челове­ка длиной 1,5 мегануклеотида (5 фрагментов по 300 000 нт каждый):

• фрагмент Chr 03 163229646-163529646;
• фрагмент Chr 05 29372672-29672672;
• фрагмент Chr 14 64016329-64316329;
• фрагмент Chr 21 15306102-15606102;
• фрагмент Chr 21 33931862-34231862.

Для определения частоты TN мы использовали инструменты GenBank.

Результаты

Мы проанализировали TN-состав полностью секвенированных ДНК практически всех герпес- вирусов отряда Herpes virales, содержащихся в GenBank. Класс ДНК, т.е. преобладание G + C или A + T в одной из ее цепей, не дает слишком много в этом отношении, разделяя HHV на две группы по классам:

• класс АТ — HHV3 (альфа) и HHV6A, 6В, 7 (бета);
• класс GC — HHV1,2 (альфа), 5 (бета) и 4,8 (гамма).

Вместе с тем динуклеотидный анализ хоро­шо иллюстрирует CPR2 [8], по которому A ≈ T, C ≈ G, С + Т ≈ А + Г и С + А ≈ Т + Г для одной нити ДНК. Это определяется размером герпесвирусных ДНК — 125-295 Кб.

Общее количество TN составляет 256 (4⁴). Что­бы избежать влияния класса ДНК (GC или AT) на результаты подсчета, показанного ранее [8, 13, 14], мы проанализировали только те TN, которые со­держат все 4 различных основания, т.е. «полные» TN — 4TN. В ДНК HHV1 (класс GC) наименьшим («недопредставленным») является именно такой 4TN — CTAG (91 нт на геном из ~150 тыс. пар ос­нований). В дНк HHV6A (класс AT) число CTAG также близко к наименьшему (303 нт) среди всех тетрамеров и является наименьшим из 4TN. Мень­ше только AGGG (287) и GGCT (296) — в соответ­ствии с классом ДНК. Это обстоятельство еще раз обосновывает выбор именно «полных» наборов для анализа TN.

Из 256 TN только 24 состоят из всех 4 нуклео­тидов (P₄ = 4! = 24). Эти 24, в свою очередь, делятся на две группы: 8 из них (октет А) при инверсии не меняются, например CTAG|CTAG, остальные (ок­тет В) составляют пары В1 и В2 взаимноинвертированных неидентичных TN, например, CTAG|TCAG. В таблицах и на рисунках октеты А и В показаны раздельно. Для корректного сравнения данные представлены в процентах от суммы частот TN каждого октета, А и В. В табл. 1 сравниваются данные по всем 24 обсуждаемым TN октетов А и В (референс-штаммы) всех известных типов HHV. Данные табл. 1 показывают, что тетрамер CTAG «недо­представлен» в геномах всех HHV, за исключением HHV7; в последнем «недопредставлен» тетрамер ACTG. В ДНК HHV4 «недопредставлен» тетрамер TCGA (как и в геноме человека).

 

 

В соответствии со снижением «недопредстав­ленности» CTAG геномы HHV образуют последова­тельность, которая напоминает последовательность ДНК-микрогомологий вирус/хозяин по нарастанию их плотности (рис. 2): наибольшая «недопредстав­ленность» CTAG характерна для двухсегментных ДНК, наименьшая — для односегментных.

 

 

В то же время ДНК каждого HHV содержит «сверхпредставленные» TN, которые также харак­терны для геномов определенной макроструктуры: ACGT — для двухсегментной ДНК (классы D, E), TGCA — для односегментной (класс A, розеоловирусы) и CATG — для односегментных (классы B, C). Однако, поскольку ДНК вирусов герпеса, отлич­ных от человека, очень слабо представлена для видов-хозяев в GenBank, мы не приводим результаты анализа по «максимальным» TN.

Колонки чисел, относящихся к ДНК каждо­го вируса, представляют собой TN-профили ДНК, и они — в случае HHV4, 8 и 7 — демонстрируют определенное сходство с профилем ДНК человека. В некоторых случаях (HHV4, 5, 7) представленные попарно TN октетов BI и В2 демонстрируют ха­рактерные отклонения от CPR2, которые, вероятно, связаны с недостаточными размерами ДНК этих вирусов или с недостаточным числом штаммов в GenBank, которое не обеспечивает достоверность соответствующих данных. Позитивная сторона та­ких отклонений заключается в том, что они могут быть использованы в качестве компонентов молеку­лярных сигнатур этих вирусов.

Обращает на себя внимание, что разница меж­ду максимальными и минимальными значениями в октете А существенно больше, чем в октете В. В тех случаях, когда показатели плотности TN ок­тета В меньше, чем октета А, их «недопредстав­ленность» напрямую связана с классом ДНК, т.е. они имеют вид [TA/AT|GC/CG]; левая и правая па­ры тетрамера могут меняться местами, а знак «/» означает «или». Таких TN — 8, и их причастность к формированию класса ДНК не имеет значения для использования — вместе с другими полными тетрамерами — в качестве молекулярных сигна­тур. В табл. 2 суммированы данные по «минималь­ным» («недопредставленным») 4TN ДНК герпесвирусов человека. Анализ серий штаммов (до 20) одного и того же типа HHV показал почти полную идентичность результатов, что в первом прибли­жении позволило считать полученные результаты достаточно надежными.

 

 

Далее мы провели TN-анализ полностью секвенированных ДНК почти всех других видов вирусов суперсемейства Herpesvirales (табл. 3).

 

Таблица 3 показывает, что все герпесвирусы разделены на две группы в соответствии с двумя основными «недопредставленными» TN — CTAG или TCGA. Разница между этими двумя группами следует из их геномной макроструктуры. Мини­мальный CTAG (CTAG_min) характерен для классов A, D, E структурированной ДНК с большими мо­номерными концевыми повторами —TR₁, TCGA_min характерен для менее строго структурированных классов ДНК B, C[F] с нефиксированными тандем­ными концевыми повторами — TR₂.

Обсуждение

«Недопредставленность» TN CTAG (CTAG_min) в геномах эшерихий и сальмонелл, а также некото­рых фагов известна давно [15] и продолжает изу­чаться [16]. Мы впервые систематически показыва­ем эту особенность для всех известных герпесви­русных ДНК и предполагаем ее возможную связь с их структурой. CTAG_min характерен для ДНК большей группы герпесвирусов (классы A, D, E) с на­личием одного или двух сегментов, ограниченных мономерными концевыми повторами (TR₁, прямы­ми или взаимно инвертированными). TCGA_min ха­рактерен для ДНК меньшей группы герпесвирусов (классы B, C[F]) с односегментным геномом, огра­ниченным неопределенным числом тандемно орга­низованных прямых концевых повторов (TR₂).

На мысль о более общей природе параллелей CTAG_min|ADE и TCGA_min|BC[F] среди вирусов жи­вотных наводит «недопредставленность» CTAG за рамками отряда Herpesvirales, в частности в ДНК вирусов африканской чумы свиней (Asfarviridae) и фибромы Shope у кроликов (Poxviridae), струк­турированных аналогично герпесвирусам A, D, E. В то же время геномы вирусов оспы и осповакцины (Poxviridae) не структурированы подобным об­разом, в них нет «недопредставленности» CTAG. Эти наблюдения требуют серьезного расширения обсуждаемых исследований в других таксономиче­ских группах вирусов животных.

Термодинамическая модель CTAG в составе РНК показывает, что этот тетрамер нарушает опти­мальную структуру стволовых петель молекулы, ко­торые контролируют экспрессию генов, увеличивая их свободную энергию. Авторы этой гипотезы [15] предположили также, что общий предок Salmonella и Escherichia имел значительно более высокую плотность CTAG, но эволюционное вырождение привело к замене CTAG у его потомков, и эта тен­денция в настоящее время сохраняется. В серии генов и в межгенных пространствах у Escherichia и Salmonella это вырождение выразилось в эволю­ционной замене CTAG, в первую очередь на CTGG.

В этом отношении наиболее уместно срав­нить филогенетически родственные (одного рода) розеоловирусы человека HHV6 и HHV7. В ДНК обоих вирусов — по сравнению с другими виру­сами герпеса — частоты CTAG и CTGG наиболее различны. Сравнение показывает, что если в HHV7 (NC_001716) отношение частот CTAG:CTGG со­ставляет 530:301 соответственно, то в HHV6A (NC_001664) оно даже противоположное и состав­ляет 303:391 — при близких размерах ДНК обоих вирусов. Если наблюдение Le Tang с соавт. [16] в какой-то мере применимо и к обсуждаемым герпес-вирусам, то HHV7, очевидно, ближе к эволюцион­ному предшественнику обоих розеоловирусов, чем HHV6, в котором многие CTAG были заменены на CTGG. В то же время HHV6 приобрел способность интегрировать свой геном в геном хозяина, что, как правило, не является обязательным условием для более тесных отношений с ДНК хозяина [17], о чем свидетельствует сходство профиля TN HHV7 (но не HHV6) и ДНК человека (рис. 3), а также более вы­сокий уровень ДНК-микрогомологии вирус/хозяин в HHV7, чем в HHV6, или более низкий уровень та­кой микрогомологии у мардивирусов с выраженны­ми теломерными островками в концевых повторах сегментов ДНК [5, 18].

 

 

На рис. 3 дополнительно показаны некоторые особенности проанализированных профилей 4TN вирусных ДНК. В соответствии с CPR2 сходство между В1 и В2 в ДНК человека намного больше, чем в ДНК вирусов, поскольку фрагменты ДНК че­ловека имеют здесь длину 300 Кб, а геномы HHV намного короче. В HHV7 различия между B1 и B2 достаточно характерны и могут использоваться в ка­честве элемента молекулярной сигнатуры ДНК это­го вируса (то же относится к профилю 4TN HHV4; рис. 4). Тот факт, что GenBank представляет полные (почти полные) последовательности ДНК только трех штаммов HHV7, позволяет применять статисти­ческие методы для подтверждения представленных здесь данных с большими оговорками. По этой при­чине мы не использовали здесь эти методы, отметив, что сегодня это лишь похоже на факт.

На рис. 4 приведено сравнение 4TN-профиля ДНК другой пары вирусов — HHV1 и HHV4. В слу­чае HHV1 низкое содержание CTAG позволяет ви­русу вызывать острую продуктивную инфекцию и накапливаться в клетках входных ворот (в тех же фибробластах), а затем переходить в нейроны, где он будет оставаться на всю жизнь — в частности, из-за ингибирующего действия эпигенетических механизмов хозяина, одним из которых является метилирование вирусной ДНК. Концентрация ди­нуклеотидов CpG в геноме HHV1 существенно пре­вышает среднее значение (табл. 1).

 

 

Низкие уровни CTAG могут играть роль в обо­стрении латентных инфекций. В случае HHV4 пер­вичная литическая инфекция не характеризуется высоким уровнем вирусных синтезов, а после пе­рехода в хроническую фазу она также регулируется эпигенетическими инструментами, включая мети­лирование цитозина в составе CpG [18, 19]. В то же время очевидная близость 4TN-профилей генома HHV4 и хозяина указывает на сходную реакцию на эти регулирующие инструменты. То же самое мож­но сказать о HHV8 и эпигенетической регуляции его генов [19, 20]. Из многих эпигенетических меха­низмов, которые модифицируют экспрессию генов вируса и хозяина, мы рассматриваем здесь только метилирование ДНК, точнее, метилирование цито­зина в CpG, поскольку этот димер является частью тетрамера TCGA, что позволяет сравнивать его с другим тетрамером, CTAG, в предложенном здесь аспекте.

Гипотеза о низкой плотности тетрамера CTAG из-за его эволюционного вырождения не объясняет очевидных ограничений его использования и во­все не касается причин низкой плотности другого тетрамера октета А, TCGA, в ДНК представителей этого же суперсемейства. Около 40% CpG, централь­ной пары этого тетрамера, находится в промоторных зонах млекопитающих [21, 22] и имеет гораздо более низкую плотность в полных последовательностях геномов позвоночных, чем можно было бы ожидать [23, 24]. Эта «недопредставленность» является след­ствием высокой частоты мутаций метилированных сайтов CpG в геномах хозяев и их вирусов, особенно тех, которые тесно взаимодействуют с ДНК хозяина.

Причины пониженного содержания CpG не­однократно обсуждались и прежде [25], однако во­прос заключается не столько в низкой плотности CpG, сколько в контексте этой пары, т.е. в составе TCGA, поскольку этот тетрамер представлен в гер­песвирусных ДНК в значительно меньшей концен­трации, нежели ACGT.

Данные Le Tang и соавт. [16] показывают, что само по себе минимальное содержание CTAG (и TCGA) не ограничивается герпесвирусной ДНК.

Мы проанализировали TN-профиль больших ДНК с концевыми повторами некоторых других вирусов. Обнаружено, что CTAG является «минимальным» у вирусов африканской чумы свиней (семейство Asfarviridae) и вируса фибромы Shope (семейство Poxviridae), но не у вирусов оспы и осповакцины (также семейства Poxviridae), ДНК которых не име­ет терминальных повторов. Это означает, что при построении филогенетических деревьев необходи­мо учитывать не только изменения в генах и белках, но и эволюцию молекулы ДНК, включая ее обсуж­даемые здесь характеристики.

В первом приближении для анализа плотности потенциально метилируемого цитозина в геномах герпесвирусов достаточно оценить соотношение CpG:GpC (т.е. проанализировать динуклеотидный профиль ДНК), которое не связано с типом гено­ма (AT или GC). Эту оценку можно проследить в табл. 2: ДНК HHV с CpG>GpC (в серых ячейках). В этом случае результаты, представленные здесь, будут касаться только концентрации и соотношения CTAG/CpG в герпесвирусных ДНК, которые могут влиять на уровень вирусных синтезов. В наиболее общем (не строгом) виде это соотношение имеет зеркальный характер: наиболее низкая концентра­ция CTAG сопровождается самой высокой концен­трацией CpG (табл. 1). Тем не менее соотношение CTAG/CpG обедняет получаемую информацию, которая указывает на различие именно в TN-про­филе герпесвирусных ДНК, CTAG/TCGA. Другими словами, составляющей этого отношения является TCGA/ACGT, четко выраженное в рамках классов DE/A/BC[F] (табл. 1). В свою очередь, это указыва­ет на необходимость учитывать контекст, который определяет функциональную ценность димера CpG. Возможно, этот контекст выходит за рамки тетрамера. Для надежных выводов необходимо расши­рить исследования за рамки герпесвирусов — при серьезном пополнении GenBank новыми полными последовательностями вирусных ДНК. Но в любом случае результаты, продемонстрированные здесь, указывают на то, что биологический смысл макро­структуры герпесвирусной ДНК гораздо глубже, чем принято считать.

Об авторах

Феликс Петрович Филатов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»;
ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»

Автор, ответственный за переписку.
Email: felix001@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6182-2241

к.м.н., д.б.н., в.н.с. лаб. молекулярной биотехнологии 

ведущий научный сотрудник 

Россия

Александр Валерьевич Шаргунов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5536-1557
ведущий инженер, лаб. генетики ДНК-содержащих вирусов Россия

Список литературы

Дополнительные файлы