Анализ in silico геномов штаммов Bacillus anthracis главных генетических линий

Полный текст

Введение

Структура глобальной популяции Bacillus anthracis представлена тремя главными генетическими линиями — A, B и С с 14 «каноническими» (canSNP) группами. Штаммы возбудителя распределены между ними неравномерно, преобладают представители линии A (около 90%), линия B охватывает примерно 10%, линия C включает всего 3 штамма (менее 1%) [1, 2]. Отдельную линию в группе B. cereus sensu lato, включающую B. anthracis, составляют штаммы, отнесённые к B. cereus biovar anthracis, способные вызывать сибиреязвенную инфекцию [3, 4]. Причины неравномерной распространённости штаммов B. anthracis разных генетических линий не установлены. Неизвестно, почему штаммы линии A имеют глобальное распространение, а штаммы линии B настолько ограничены в количестве и распространении.

Одними из объяснений являются адаптивные генетические различия, которые влияют на выживание и размножение либо в окружающей среде, либо в организме хозяина.

Эффективность размножения в организме хозяина зависит от адаптивных генетических различий факторов патогенности. Патогенность B. an- thracis связана с основными факторами: двумя бинарными экзотоксинами, летальным и отёчным, и d-глутамилполипептидной капсулой [2]. Компоненты экзотоксинов, летальный, отёчный факторы и протективный антиген (ПА) кодируются генами lef, cya и pagA, расположенными на плазмиде pXO1 [5]. Оперон capBCDAE для продукции капсулы кодируется плазмидой pXO2 [2]. Утрата любой из двух плазмид приводит к авирулентности штаммов. Вместе с тем по вирулентности для лабораторных животных штаммы, несущие обе плазмиды, существенно различаются. Известна аттенуация вакцинного штамма Carbosap, не связанная с утратой плазмид pXO1 и pXO2, которая определяется делециями хромосомной области, содержащими более 50 генов, функция которых, как установлено или предполагается, может быть связана с вирулентностью [6]. Обнаруженные различия в вирулентности штаммов, синтезирующих полноценный токсин и типичную капсулу, предполагают наличие дополнительных факторов патогенности. На их роль претендуют многие продукты сибиреязвенного микроба:

• белок GerXC, кодируемый плазмидным геном gerXC и необходимый для прорастания спор in vivo [7];
• фосфолипаза С (ген plC) [8];
• синтаза оксида азота (ген nos) [9];
• бифункциональная лизилфосфатидилглицерол флиппаза/синтетаза (ген mprF) [10];
• металлопротеаза семейства энхансина (локус GBAA_RS16775), гомолог которого впервые описан у бакуловирусов [11, 12];
• металлопротеаза иммунный ингибитор А (ген inhA) [12];
• автоиндуктор сигнальных молекул «чувства кворума» LuxS (ген luxS [13];
• антролизин О Alo (холестеринзависимый цитолизин) (ген alo [14]);
• энтеротоксин EntFM (ген entFM) [13].

У некоторых штаммов B. anthracis отмечен комплекс фенотипических признаков, отличающих их от типичных вирулентных штаммов, один из которых — неспособность расти на минимальной синтетической среде без добавления триптофана, сниженная вирулентность для кроликов. Генетическая основа этих изменений не определена [16].

В литературе есть сведения о влиянии аминокислотных замен в белке летального фактора на его каталитическую активность и связывание с ПА [17–19]. Эти данные получены в экспериментах с внесением мутаций в описанные гены и оценкой их влияния на вирулентность мутантных штаммов в сравнении со штаммами дикого типа. Аллельный полиморфизм для гена ПА, имеющего 6 аллельных типов у природных штаммов дикого типа [20], описан и для других генов факторов патогенности [21–23]. Однако вариабельность хромосомных генов, кодирующих продукты, для которых установлено или предполагается влияние на вирулентность B. anthracis, остается не изученной. Не установлены количественные и качественные отличия полиморфизмов, свойственных геномам штаммов определённых генетических линий.

Схема молекулярного типирования B. anthracis на основе полиморфизма генов факторов патогенности (MVLST) не включала хромосомные гены.

Актуальность проведённой работы определяется отсутствием данных, которые дадут новое понимание патогенеза сибирской язвы, помогут выявить потенциальные мишени для разработки новых средств лечения и профилактики этой инфекции, будут способствовать развитию представлений об эволюции возбудителя сибирской язвы и методов его молекулярного типирования.

Целью данной работы была характеристика особенностей геномов разных генетических линий, потенциально влияющих на их распространённость, с использованием анализа in silico представительной выборки штаммов B. anthracis.

Материалы и методы

Исследованы полные геномы 49 диплазмидных штаммов, включая 19 изолятов B. anthracis из коллекции патогенных микроорганизмов Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора и 30 изолятов из базы данных GenBank, относящихся к главным генетическим линиям A, B, C и 14 canSNP-группам, а также геном штамма CI B. cereus biovar anthracis.

Идентификаторы Genbank¹ для геномов:

GCF_000008445.1, GCF_009831565.1, GCF_000167335.1, GCF_003063965.1, GCF_003064045.1, GCF_003860145.1, GCF_000793525.1, GCF_000832965.1, GCF_000310045.1, GCF_000167235.1, GCF_000534935.2, GCF_000258885.1, GCF_000278385.1, GCF_000832465.1, GCF_001273005.1, GCF_001273085.1, GCF_000167295.1, GCF_002896575.1, GCF_014249775.1, GCF_003227955.1, GCF_000831505.1, GCF_000832745.1, GCF_003064005.1, GCF_000008165.1, GCF_000583105.1, GCF_000833275.1, GCF_022221345.1, GCF_000743805.1, GCF_900014355.1, GCF_002356575.1, GCF_000143605.1.

Анализ геномов проводили in silico, используя геном штамма B. anthracis Ames Ancestor (GenBank: NC_007530.2; NC_007322.2; NC_007323.3) в качестве референсного. Идентификацию полиморфизмов осуществляли в программах «BLASTn», «BLASTp», «MEGA X», «MAUVE», «Tandem Repeat Finder». Выравнивание объединённых последовательностей генов факторов патогенности, трансляцию нуклеотидных последовательностей генов выполняли в программе «MEGA X». Для полногеномного анализа однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) использовали программу «Parsnp» из пакета «Harvest Suite» для множественного выравнивания геномных последовательностей. В качестве входных данных принимали геномы 50 штаммов, описанных выше, которые были выровнены с хромосомной нуклеотидной последовательностью эталонного генома B. anthracis Ames Ancestor (GenBank: NC_007530.2) с использованием «Parsnp» (параметры -c -e -u -C 1000). Обнаруженные SNP были извлечены в файл VCF с помощью «HarvestTools v. 1.0». Отредактированный файл использовался в качестве входного файла в «HarvestTools» для компиляции файла FASTA.

Филогенетическая реконструкция была построена в «MEGA X» с использованием метода максимальной вероятности (Neibor-Joining) в соответствии с моделью Tamura-Nei, достоверность достигалась при значении bootstrap 1000, а также методом goeBURST Full MST в программе «PHYLOViZ 2.0» для определения клональных комплексов. Визуализацию дендрограмм осуществляли в программе «FigTree». Определение индекса дискриминирующей способности Hanter–Gaston проводили в соответствии c [24].

Результаты

Анализ полиморфизмов хромосомной области генома B. anthracis и B. cereus biovar anthracis

Вариабельность хромосомной области B. anthracis и B. cereus biovar anthracis определялась SNP, однонуклеотидными повторами (SNR), тандемными повторами, заменами и инделами (инсерциями/делециями). Основными полиморфизмами в хромосомной области генома были SNP (табл. 1). Заметны отличия в количестве полиморфизмов у штаммов разных генетических линий.

 

Таблица 1. Полиморфизмы хромосомной области геномов штаммов B. anthracis и B. cereus biovar anthracis / Table 1. Polymorphisms of chromosome genomes оf B. anthracis and B. cereus biovar anthracis strains

Главная генетическая линия Major lineage	Штамм Strain	Количество полиморфизмов в сравнении с референс-штаммом B. anthracis Ames Ancestor Quantity of polymorphisms comparing with B. anthracis strain Ames Ancestor
		SNP	SNR	тандемные повторы tandem repeats	замены substitutions	инделы indels	всего total
A	Australia 94	411	142	23	8	64	648
A	Vollum	609	233	32	12	68	954
B	SVA11	1693	418	73	16	109	2309
C	2002013094	2381	576	99	134	414	3604
B. cereus biovar anthracis	CI	76 714	1075	188	7857	1783	87 617

 

Для главных генетических линий B. anthracis определены хромосомные маркерные (специфичные) SNP (табл. 2).

 

Таблица 2. Маркерные SNP хромосомной области геномов B. Anthracis / Table 2. Marker SNPs for chromosome genomes of B. anthracis

Главная генетическая линия Major lineage	Количество маркерных SNP Quantity of marker SNP	Отношение маркерные SNPs/геном линии Ratio marker SNPs/genome	Локализация SNP | SNP localization
			ген gene	межгенное пространство intergene space
A	180	4,73	152	28
B	183	18,3	141	42
C	594	594	Не определяли Not tested	Не определяли Not tested

 

Отмечается выраженная разница в относительном количестве маркерных SNP у штаммов линий B и C по сравнению с линией A.

Большинство маркерных SNPs для линий A и B локализовались преимущественно в генах жизнеобеспечения, из которых 4 гена имели отношение к споруляции и прорастанию спор.

Анализ SNP генов факторов патогенности

Анализу подвергли 19 вариабельных генов, кодирующих продукты, имеющие отношение к патогенности (табл. 3).

 

Таблица 3. SNP в генах факторов патогенности штаммов B. anthracis разных генетических линий / Table 3. SNPs in pathogenicity factors genes of B. anthracis strains of different lineages

Ген Gene	Отношение количество SNP/геном, у штаммов линий | Ratio quantity of SNPs/genome in strains of lineages
	A (n = 38)		B (n = 10)		C (n = 1)		B. cereus biovar anthracis (n = 1)
	всего total	несинонимичные nonsynonimic	всего total	несинонимичные nonsynonimic	всего total	несинонимичные nonsynonimic	всего total	несинонимичные nonsynonimic
cya	7/0,18	4/0,1	3/0,3	2/0,2	6	4	6	4
lef	2/0,05	2/0,05	2/0,2	2/0,2	4	3	10	8
pagA	4/0,1	2/0,05	3/0,3	2/0,2	3	2	4	3
atxA	1/0,02	0	0	0	0	0	1	1
capA	3/0,07	2/0,05	1/0,1	1/0,1	1	1	1	0
capC	2/0,05	0	0	0	1	1	1	0
capD	3/0,07	3/0,07	2/0,2	0	3	3	4	4
acpA	1/0,02	0	1/0,1	1/0,1	1	1	3	2
ger XC	1/0,02	1/0,02	2/0,2	2/0,2	1	1	1	1
mprF	2/0,05	1/0,02	2/0,2	2/0,2	2	1	23	1
entFM	2/0,05	2/0,05	1/0,1	1/0,1	0	0	17	5
GBAA_RS16775	1/0,02	1/0,02	2/0,2	2/0,2	0	0	132	31
plC	0	0	1/0,1	1/0,1	1/0,1	1/0,1	9	3
alo	3/0,07	3/0,073	0	0	0	0	57	23
nos	0	0	2/0,2	2/0,2	0	0	32	9
luxS	0	0	0	0	1	1	8	0
trpA	0	0	3/0,3	1/0,1	0	0	18	5
trpD	0	0	1/0,1	1/0,1	1	0	15	4
GBAA_RS06415 (trpG)	0	0	1/0,1	1/0,1	1	1	14	5

 

Характер вариабельности генов определялся наличием SNP, VNTR и INDELs. Больше всего всех SNP и несинонимичных SNP в пересчёте на 1 геном было у штамма B. cereus biovar anthracis, затем по мере уменьшения — у штамма B. anthracis линии C, штаммов линии B, штаммов линии A. Делеция в гене trpA приводила к образованию псевдогена и отсутствию функционального белка у части штаммов линии B. У штамма B. cereus biovar anthracis мутация со сдвигом рамки считывания вела к образованию псевдогена и отсутствию релаксазы Mobl (плазмида капсулообразования plC-XO2). Есть заметные различия в количестве SNP как в разных генах, так и у штаммов разных генетических линий.

Анализ полиморфизма белков факторов патогенности штаммов разных генетических линий

Летальный фактор. В белке летального фактора замены E709G и E681K локализуются в пределах домена 4, содержащего каталитический центр, на расстоянии 10 и 37 аминокислот соответственно от сайта связывания цинка, замены A299T, L298M и R543Q — в домене 2, E66K и V246I — в домене 1.

Отёчный фактор. У всех штаммов линии B отмечены замены D180G и 318T. У штамма линии C и штамма CI B. cereus biovar anthracis есть замены K278E, I318T и N789K. У штамма CI B. cereus biovar anthracis — замена V694A. Замены D180G, K278E локализуются в пределах PABD, I318T — в сегменте CA корового домена ACD, V694A и N789K — в спиральной области отёчного фактора.

Протективный антиген. У штаммов линии A отмечены замены A600V и P565S, у штаммов линии B — замены I433V и A600V, у штамма линии C и штамма CI B. cereus biovar anthracis — замены S66P и A600V. У штамма CI B. cereus biovar anthracis — замена S290I. S66P локализуется в домене 1, I433V — в домене 2, P565S — в домене 3, замена A600V — в домене 4 в области связывания с рецептором (L595–T735).

Сравнили гены и белки ПА всех вакцин на основе живых спор штаммов Carbosap, 34F2_Sterne, A16R, Tsiankovskii-1, STI-1, 55VNIIViM, 228/8 и Brazilian vaccinal, а также химических вакцин на основе ПА авирулентного штамма V770-NP-1R (вакцины США AVA (или BioThrax) и AV7909) и на основе ПА вакцинного штамма 34F2 Sterne (вакцина AVP; Великобритания). Все штаммы принадлежали линии A. У штаммов V770-NP-1R, Carbosap и всех штаммов российского происхождения (Tsiankovskii-1, STI-1, 55VNIIViM, 228/8) есть замены в гене C→T в положении 195 и 1799, у штамма Tsiankovskii-1, кроме того, замена 981 A→T. У этих же штаммов существует замена A600V в области связывания с рецептором домена 4 ПА. У штаммов 34F2 Sterne, Brazilian vaccinal и A16R замен в гене и белке ПА не обнаружено.

Синтетаза капсульного полиглутамата CapA: у штаммов линии A выявлена замена Q399K, у штаммов линии B — замена T345A, у линии C — замена V156L.

Белок синтеза капсулы CapC: замена T80M у штаммов линии C и B. cereus.

Гамма-глутамилтрансфераза CapD: у штаммов линии A — замены I4M, V266I и S381E; у штаммов линии B замен нет; у штамма линии C и штамма CI B. cereus biovar anthracis — замены H70Y, K223E и F379I; у штамма CI B. cereus biovar anthracis — замена G499D. Замена H70Y локализуется в цепи L, F379I — в цепи S.

Транскрипционный регулятор синтеза капсулы AcpA: у штаммов линий B, C и CI B. cereus biovar anthracis замена E285K, у B. cereus также замена Y354H.

Транскрипционный транс-активирующий регулятор сибиреязвенного токсина AtxA: замена I188N у штамма CI B. cereus biovar anthracis.

Антролизин О Alo: у штаммов группы A.Br.Vollum замена S422F, у штаммов группы A.Br.Aust94, выделенных в ЮАР, — замена N221T, у штаммов группы A.Br.005/006 — замена V416G.

Металлопротеаза семейства энхансина: у штаммов линии A — замены P631S; у штаммов линии B — замена L139F, у штаммов линии C — замена D444E, в белке штамма CI B. cereus biovar anthracis — 29 замен.

Белок прорастания спор GerXC: у линий A и B — замена H29R; у линии B — замена T35I, у линии C и B. cereus biovar anthracis — замена E219G.

Аутоиндуктор-2 продукции белка LuxS: у линии С — замена D111G.

Бифункциональная лизилфосфатидилглицерол флиппаза/синтетаза MprF: у линии A — замена H631R, у линии B — замена L289F, у линий B, C и B. cereus biovar anthracis — замена V424I.

Синтаза оксида азота NOS: у линии B — замены Q288H и I348F, у B. cereus biovar anthracis — 9 замен.

Фосфолипаза PIC: у штаммов линий В, С и B. cereus biovar anthracis — замена H194Y, у B. cereus biovar anthracis — также замены N20S и A59V.

Субъединица альфа триптофансинтазы TrpA: у линии B — замены T222K и нефункциональный белок у части штаммов этой линии ввиду делеции и образовании псевдогена, у B. cereus biovar anthracis — 5 замен.

Антранилат фосфорибозилтрансфераза TrpD: у линии B — замена N300S, у B. cereus biovar anthracis — 4 замены.

Компонент II аминодезоксихоризмат/антранилат синтазы TrpG: у линий B и C — замена N300S, у B. cereus biovar anthracis — 5 замен. H70Y локализуется в цепи L, F379I — в цепи S.

Полученные данные о заменах в плазмидных генах и белках факторов патогенности совпадают с опубликованными ранее [22, 23]. Замены в генах дополнительных факторов патогенности хромосомной локализации описаны нами впервые.

Больше всего значимых замен идентифицировано в генах энхансина и антролизина O штамма CI B. cereus biovar anthracis. В целом в 19 генах факторов патогенности было 15 значимых замен у 38 штаммов линии A, 20 замен — у 10 штаммов линии B, 20 замен — у 1 штамма линии C, 102 замены — у штамма CI B. cereus biovar anthracis. Прослеживается та же закономерность — у штаммов главных линий B и C и, тем более, у штамма B. cereus biovar anthracis аминокислотных замен в белках факторов патогенности, которые могут изменять их функциональную активность, значительно больше, чем у штаммов линии A.

Молекулярное типирование на основе SNP генов факторов патогенности

В 19 генах факторов патогенности 49 штаммов B. anthracis и 1 штамма B. cereus biovar anthracis идентифицированы 409 филогенетически значимых SNP и определены 33 генотипа факторов патогенности.

Для типирования на основе SNP генов факторов патогенности (MVLST) индекс дискриминирующей способности Hanter–Gaston составил 0,9633 и оказался выше, чем для canSNP-типирования (0,9056), приближаясь к показателю для WGS-SNP-типирования (0,9869). Близкие результаты получены нами при сравнении эффективности MVLST и полногеномного SNP-типирования [25]. Типирование на основе SNP генов факторов патогенности, в отличие от canSNP- и coreWGS-SNP-типирования, позволяет анализировать как хромосомные, так и плазмидные гены.

В дендрограмме на основе SNP генов факторов патогенности также выделяются три общепризнанные главные генетические линии: A, B, C B. anthracis и ветвь штамма B. cereus biovar anthracis, при этом последняя является базовой для всех трех главных генетических линий B. anthracis а ветвь линии C — базовой для линий B и C (рис. 1). Эти данные соответствуют представлению об эволюции B. anthracis от предшественника B. cereus к линии C и затем к линиям B и С, а также могут указывать на изменчивость генов факторов патогенности как движущую силу эволюции.

 

Рис. 1. Сопоставление филогенетической реконструкции результатов методов молекулярного типирования на основе анализа слитых последовательностей генов факторов патогенности и coreWGS-SNP. / Fig. 1. Comparison of the phylogenetic reconstruction of the results received using the multilocus sequence typing and coreWGS-SNP.

 

Филогенетические отношения штаммов, реконструируемые на основе SNP генов факторов патогенности, отличались от таковых на основе полногеномного SNP-типирования.

Полное соответствие кластеризации canSNP-групп B.Br.001/002 и B.Br.Kruger наблюдали при типировании на основе SNP генов факторов патогенности и на основе SNP полного генома.

При сравнении дендрограмм, полученных по результатам анализа слитых последовательностей генов факторов патогенности и полногеномного SNP-анализа тех же штаммов (рис. 1) показывает, что часть штаммов, относящихся к другим canSNP-группам, кластеризуются со штаммами из групп, не соответствующими их canSNP-групповой принадлежности.

Определение клональных комплексов на основе анализа SNP генов факторов патогенности

Определение клональных комплексов (CC) на основе анализа SNP генов факторов патогенности позволило выделить 33 генотипа (GT), объединённых в 5 клональных комплексов для 48 штаммов B. anthracis главных линий A и B, а также два отдельных GT для штаммов B. anthracis линии C и B. cereus bv anthracis (рис. 2). CC1 является наиболее многочисленным комплексом, объединяющим 12 GT 20 штаммов.

 

Рис. 2. Клональные комплексы штаммов B. anthracis. Дендрограмма построена на основе анализа SNP генов факторов патогенности методом goeBURST Full MST в программе «PHYLOViZ 2.0», цифры на ветвях соответствуют генетическим дистанциям. / Fig. 2. Clonal complexes of B. anthracis strains. The dendrogram was constructed using multilocus sequence typing and the goeBURST Full MST algorithm in the PHYLOViZ 2.0 program; numbers on the clades correspond to genetic distances.

 

Всего в СС1 входят GT 18 штаммов 7 из 14 canSNP главной генетической линии A B. anthracis. Комплекс CC2 включает 2 GT группы A.Br.008/011 и является промежуточным звеном между комплексами CC1, CC4 со штаммами линий A и комплексом CC5 со штаммами линии B. CC3 включает 7 GT групп A.Br.Aust94, A.Br.001/002 и A.Br.Ames. CC4 содержит 5 GT одной группы A.Br.008/011 главной линии A. CC5 объединяет 7 GT 10 штаммов всех canSNP групп главной линии B B. anthracis.

Внутри клональных комплексов генетические дистанции между GT составляют 1–6 ед. Все штаммы B. anthracis линии A отделены от штаммов линии B дистанцией 17 ед. (от GT17 до GT43), от штамма линии C — дистанцией 24 ед. (между GT7 и GT49), штамм B. cereus biovar anthracis (GT50) — дистанцией 340 ед. от штамма B. anthracis линии C (GT49).

Анализ клональных комплексов подтверждает деление штаммов B. anthracis на три главные генетические линии и распределение штаммов по генотипам генов факторов патогенности, не вполне соответствующее принадлежности к каноническим SNP-группам. Прослеживается эволюция факторов патогенности от B. cereus biovar anthracis к B. anthracis линии C и затем к линиям А и B, которая позволяет выделить генетические группы, отличающиеся от канонических SNP-групп.

Обсуждение

Количество всех видов полиморфизмов хромосомной области геномов у штаммов B. anthracis линий B и C было в 1,6–13,4 раза, а у штамма B. cereus biovar anthracis в 5–150 раз больше, чем у штаммов B. anthracis линии A. Особенно большие отличия были в количестве замен, SNP, и инделов в геноме штамма B. cereus biovar anthracis, соответственно, в 785,7, 150 и 27 раз больше, чем у штаммов B. anthracis линии A. Это может объясняться тем обстоятельством, что хромосомная область генома штаммов B. cereus biovar anthracis соответствует геному представителей группы B. cereus sensu lato, кроме B. anthracis, тогда как плазмиды pCI-XO1 и pCI-XO2 мало отличаются от плазмид pXO1 и pXO2 B. anthracis [4].

Количество хромосомных специфичных маркерных SNP в пересчёте на геном было в обратном отношении к количеству штаммов линии; так, для единственного штамма главной линии C этот показатель был в 24 раза больше, чем для 10 штаммов линии B, и в 170 раз больше, чем для 38 штаммов линии A. Это может быть следствием более длительной эволюционной истории c накоплением мутаций у генетических линий B и C по сравнению с линией A. Поскольку SNP локализовались преимущественно в генах «домашнего хозяйства», велика вероятность того, что эти мутации были значимыми и могли отрицательно сказаться на экологической адаптации линий B и C и, следовательно, к их ограниченной распространённости.

Вариабельность 19 генов факторов патогенности, из которых 9 кодировались плазмидами pXO1 и pXO2 B. anthracis или pCI-XO1 и pCI-XO2 B. cereus biovar anthracis, а еще 10 — хромосомой, выражалась в наличии SNP и инделов. Важно отметить, что у штаммов B. anthracis линии A, за исключением штамма 2000031008, в отличие от других линий, инделов не зарегистрировано. У штаммов линий B и C в гене acpA вставка ATATAGATA приводила к вставке 3 аминокислот NID (аспарагин-изолейцин-аспарагиновая кислота) в транскрипционном регуляторе синтеза капсулы AcpA. Эта вставка, единица тандемного повтора, была описана как новый VNTR-локус нами [26] и позднее другими авторами [23]. Делеция в области 107–124 п.н. в гене trpA превращала его в псевдоген, лишала субъединицу альфа триптофансинтазы TrpA 35-40 аминокислот с N-конца и делала фермент нефункциональным у большей части изученных нами штаммов линии B. Это могло объяснять зависимость от триптофана данных штаммов [16].

Основным иммуногенным компонентом сибиреязвенных вакцин является ПА. Все вакцинные штаммы живых вакцин, а также штаммы, ПА которых использован в химических вакцинах, относились к главной генетической линии A. У вакцинных штаммов российского происхождения, штаммов V770-NP-1R и Carbosap существует замена аланина на валин в области связывания с рецептором домена 4 ПА, которой нет у вакцинных штаммов из Китая, Бразилии и штамма 34F2 Sterne, используемого для вакцинации скота в западных странах. Эти данные могут быть полезными при разработке новых сибиреязвенных вакцин.

Доминирование генотипов линии А в глобальном масштабе свидетельствует о большом репродуктивном успехе (следовательно, приспособленности) и значительном рассеивании на большие расстояния [27]. K.L. Smith и соавт. полагают, что штаммам линии A, но не линии B, присуща гипотетическая способность вызывать латентную инфекцию у животных, с чем связано их глобальное распространение и ограниченное распространение линии B. Сравнение изолятов линий A и B из Южной Африки показало, что штаммы A были адаптированы к более разнообразным средам, чем штаммы B, которые были ограничены более узкими условиями окружающей среды [28]. Ограниченное количество и географическое распределение более редких линий может возникнуть из-за бóльших затрат на адаптацию, связанных с нишевой специализацией [29].

Генотипы из линии С и, в меньшей степени, из линии В, по-видимому, имеют очень низкую приспособленность по сравнению с генотипами линии А. Действительно, ветвь линии С имеет значительно более медленные эволюционные темпы, чем ветвь линии А, наводя на мысль о меньшем количестве инфекционных циклов в природе [1].

Различия эволюционных линий по кругу восприимчивых хозяев также могут быть объяснением их разного распространения. Штаммы группы B.Br.CNEVA линии B были зарегистрированы только во Франции, Южной Германии, Швейцарии, Северной Италии, Боснии и Герцеговине, Хорватии, Словении, Словакии и Польше. Они составляют трансальпийскую ось, состоящую из пастбищных долин с богатыми лугами, где традиционно разведение конкретных пород крупного рогатого скота, содержащихся изолировано и не обменивающихся на протяжении веков. Эта географическая изоляция, возможно, могла обеспечить благоприятную среду для выживания спор и размножения B. anthracis группы B.Br.CNEVA [2, 30].

Заключение

Существуют значительные различия в количестве полиморфизмов в геномах представителей главных генетических линий B. anthracis A, B и C. Штаммы наименее распространённой линии С имели в 4,5 раза больше, а штаммы линии B с ограниченным распространением в 3 раза больше видов полиморфизмов, чем штаммы многочисленной линии A. Преимущественная локализация нуклеотидных замен, в том числе значимых, внутри генов как домашнего хозяйства, так и факторов патогенности, могла изменять функции соответствующих белков. Экспансия линии A может объясняться преимуществами в сравнении с линиями B и С, закреплёнными в ходе эволюции. Линия С эволюционно более древняя, базовая по отношению к линиям B и A и наименее приспособленная, ограничена в распространении отрицательным отбором. Эволюция B. anthracis, определяемая изменчивостью факторов патогенности, позволяет выделить генетические группы, отличающиеся от канонических SNP-групп. MVLST ввиду хорошей дискриминирующей способности может быть дополнительным методом молекулярного типирования возбудителя сибирской язвы, позволяющим дифференцировать штаммы на основе детерминант патогенности.

Впервые в нашей работе показано многократное превышение числа полиморфизмов в геномах, включая гены факторов патогенности, у штаммов линий B и C по сравнению с линией A, определены значимые замены в хромосомных и плазмидных генах, потенциально влияющие на вирулентность, установлена высокая дискриминирующая способность схемы MVLST) на основе анализа SNP 19 генов факторов патогенности. Определён механизм зависимости от триптофана некоторых штаммов B. anthracis линии B, связанный с мутациями в гене субъединицы альфа триптофансинтазы триптофанового оперона.

Необходимо изучение вариабельности генов, связанных с прорастанием спор и спорообразованием, которые также могут влиять на адаптацию и распространение генетических линий B. anthracis.

Таким образом, одним из объяснений преимущественного распространения главной генетической линии A B. anthracis может быть значительно меньшее количество мутаций в геноме по сравнению с линиями B и, особенно, C и лучшая адаптация к условиям существования в окружающей среде и в организме хозяина.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

 

¹ URL: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/833/275/

Об авторах

Евгений Иванович Еременко

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: ejer@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1117-1185
SPIN-код: 3966-6884
Scopus Author ID: 6701369832
ResearcherId: AAJ-7406-2020

д.м.н., профессор, г.н.с. лаб. сибирской язвы

Россия, Ставрополь

Григорий Александрович Печковский

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7033-9972

м.н.с.. лаб. сибирской язвы

Россия, Ставрополь

Алла Геннадиевна Рязанова

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: anthraxlab.stv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5196-784X

к.м.н., зав. лаб. сибирской язвы

Россия, Ставрополь

Сергей Владимирович Писаренко

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: pisarenko_sv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6458-6790

к.х.н., в.н.с. лаб. биохимии

Россия, Ставрополь

Дмитрий Анатольевич Ковалев

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: kovalev_da.stv@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-9366-5647

к.х.н., зав. лаб. биохимии

Россия, Ставрополь

Людмила Юрьевна Аксенова

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: anthraxlab.stv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7744-3112

к.м.н., с.н.с. лаб. сибирской язвы

Россия, Ставрополь

Ольга Викторовна Семенова

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: anthraxlab.stv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0274-898X

к.б.н., н.с. лаб. сибирской язвы

Россия, Ставрополь

Александр Николаевич Куличенко

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: kulichenko_an@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-9362-3949

академик РАН, д.м.н., профессор, директор

Россия, Ставрополь

Список литературы

Дополнительные файлы