Влияние иммунизации кроликов дрожжевыми антигенами на активность фракции сывороточных антимикробных пептидов

Полный текст

Введение

Прямым противомикробным действием сыворотки крови млекопитающих обладают белки системы комплемента, иммуноглобулины и антимикробные пептиды (АМП). При различных механизмах это действие выражается в повреждении клеточной мембраны патогенных микроорганизмов [1]. На основании данного свойства разработан способ оценки общей противомикробной активности сыворотки крови и ее низкомолекулярной фракции (2,8-80 кД), в которую входят АМП [2]. Данный способ заключается в действии образцов сыворотки на клетки тест-культур микроорганизмов и спектрофотометрическом измерении процента красителя, вошедшего в убитые клетки, по сравнению с контролем. С помощью этого метода определены указанные свойства сывороток 4 видов млекопитающих, включая человека, и обнаружены различия в величинах противогрибковой активности (ПГА) АМП-фракций сывороток, но не в величинах общей активности [3]. Этим же методом показано. что иммунизация мышей дрожжевыми антигенами приводила не только к увеличению уровней специфических иммуноглобулинов класса G, но и к повышению активности фракции АМП по отношению к Candida albicans [4].

Целью исследования явилось изучение влияния иммунизации кроликов клетками разных видов условно-патогенных дрожжевых грибов на общую антимикробную активность сыворотки и специфическую активность фракции ее АМП.

Материал и методы

Опытная группа кроликов состояла из 7 здоровых самок породы шиншилла массой 1,5 кг, полученных из питомника ФГБУН «НЦБМТ» ФМБА России, филиал «Андреевка». Контрольную группу составляли 4 таких же кролика. Эксперименты проводили в соответствии с межгосударственным стандартом по содержанию и уходу за лабораторными животными (ГОСТ 33217-2014).

Штаммы дрожжей Candida albicans № 927, Rhodotorula mucilaginosa № 132, Malassezia furfur № 1451, Cryptococcus neoformans № 3465, Geotrichum candidum № 1206, Trichosporon cutaneum № 18 получены из коллекции ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова; а Saccharomyces cerevisiae Y-375 — из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Суспензии клеток для иммунизации и прочих опытов готовили из экспоненциальных культур, выращенных на плотной среде Сабуро при 25°С (в случае M. furfur — на модифицированной среде Диксона при 32°С).

Иммунизацию кроликов проводили по следующей схеме: каждого кролика из опытной группы иммунизировали суспензией убитых мертиолятом клеток одной из культур дрожжей плотностью 10¹⁰ КОЕ/мл в объеме 1 мл, внутримышечно (в бедро), 8-кратно в течение 2 мес. Сыворотки получали от всех кроликов одновременно, включая контрольную группу, лиофильно высушивали, определяли плотность путем взвешивания сухих остатков и соотнесения с объемами исходных сывороток, после чего хранили при 5°С. Для проведения каждого эксперимента с одним видом дрожжей взвешивали часть сыворотки, разводя ее до исходной плотности дистиллированной стерильной водой.

Фракции, содержащие АМП, получали путем фильтрования сывороток через молекулярные фильтры «Amicon Ultra» («Millipore», «Merck») с диаметром пор 100 кД на центрифуге в течение 15 мин при 16 000 об/мин. ПГА определяли по схеме: аликвоты сывороток или их АМП-фракций объемом 150 мкл (контрольная пробирка содержала физиологический раствор) соединяли с 50 мкл суспензии дрожжей в пробирках типа Эппендорф, инкубировали 2 ч при 32°С на шейкере, затем центрифугировали 5 мин при 16 000 об/мин, супернатанты удаляли, а к осадкам добавляли по 300 мкл раствора бромкрезолового пурпурного в фосфатном буфере рН 4,6. Смесь суспендировали, инкубировали 45 мин при 32°С на шейкере, затем суспензии вновь центрифугировали и по 50 мкл полученных супернатантов добавляли в заранее подготовленные пробирки, содержащие по 2,5 мл фосфатного буфера рН 4,6. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре «Genesys 10S UV-Vis» при длине волны 440 нм в кюветах толщиной 1 см. Активность рассчитывали в процентах по отношению к контрольному образцу [5].

Метод определения концентрации сывороточного альбумина основан на образовании окрашенных комплексных соединений при взаимодействии альбумина с бромкрезоловым зеленым в слабокислой среде в присутствии детергента. К 0,1 мл сыворотки, разведенной в 10 раз, добавляли 4 мл реактива, содержащего бромкрезоловый зеленый и детергент Triron Х-100 в ацетатном буфере («Альбумин Агат», «Агат», Россия); инкубацию проводили в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете толщиной 1 см. Калибровочные растворы делали на основе человеческого сывороточного альбумина («Reanal», Чехия). Прямая зависимость оптической плотности от концентрации альбумина имела место в диапазоне концентраций 0,3-20 мг/мл.

Статистический анализ проводили с помощью программы Microsoft Excel. Коэффициенты МаннаУитни, свидетельствующие о наличии/отсутствии значимости различий между показателями, рассчитывали с помощью автоматической программы¹. В качестве показателя корреляционных взаимосвязей использовали коэффициент Пирсона (г).

Результаты

В табл. 1 приведены медианы величин общей ПГА сывороток, полученных при иммунизации кроликов дрожжевыми антигенами, и контрольных («чистых») кроликов. Сравнение данных величин показывает наличие прямой корреляции высокой степени между общей активностью сыворотки иммунизированных кроликов (горизонтальные ряды) и общей активностью неиммунизированных животных (верхний ряд) против разных видов дрожжей. Кроме того, если сравнивать те же величины (верхний ряд) с активностями сывороток иммунизированных кроликов против тех же культур, которыми они были иммунизированы (числа, выделенные жирным шрифтом), то обнаруживается также высокая положительная корреляция (г = 0,819). Несмотря на то что достоверность различий в величинах общей активности между выборками неиммунизированных и иммунизированных кроликов не в каждом случае высока, векторы изменения общей ПГА для всех изучаемых микроорганизмов одинаковы — тенденция к снижению активности в результате иммунизации.

 

 

В табл. 2 приведены медианы величин ПГА фракции сывороточных антимикробных пептидов кроликов в ответ на иммунизацию дрожжевыми клетками. Видно, что, в отличие от величин общей активности, эти величины менялись значительно, о чем свидетельствуют значения коэффициентов Манна-Уитни. Однако прямая корреляция высокой силы между АМП-активностью сыворотки иммунизированных кроликов (горизонтальные ряды) и общей активностью неиммунизированных животных (верхний ряд) также имела место. Сравнение тех же величин (верхний ряд) с АМП-активностями сывороток иммунизированных кроликов против тех же культур, которыми они были иммунизированы (числа, выделенные жирным шрифтом), показало также наличие высокой положительной корреляции (г = 0,687). В отличие от общей активности векторы изменения АМП-активностей зависели от вида дрожжей: в случае иммунизации S. cerevisiae, G. candidum, Cr. neoformans и C. albicans имело место повышение данного показателя, тогда как после иммунизации R. mucilaginosa, M. furfur и T. cutaneum — снижение.

 

Интересно отметить, что значения общей активности сыворотки иммунизированных кроликов против данной культуры не коррелировали с таковыми для АМП-активности (г = -0,006).

Концентрацию альбумина определяли во всех сыворотках: медиана для неиммунизированных кроликов равна 86,9 мг/мл, а для иммунизированных — 83,1 мг/мл. Различия между выборками недостоверны: p > 0,05. Сравнение величин концентрации альбумина и общей активности сывороток против разных видов дрожжей по всей выборке иммунизированных и неиммунизированных кроликов дало следующие коэффициенты корреляции: для C. albicans — 0,760; для R. mucilaginosa — 0,728; для M. furfur — 0,723; для Cr. neoformans — 0,316; для G. candidum — 0,432; для T. cutaneum — 0,588 и для S. cerevisiae — 0,056.

Обсуждение

Дрожжевые грибы родов Candida, Cryptococcus, Rhodotorula и Trichosporon имеют большое значение в клинической практике, а такие роды, как Geotrichum и Saccharomyces, часто встречаются в продуктах питания [7]. Дрожжи рода Malassezia являются нормальными обитателями кожи теплокровных животных, но при иммунодефиците вовлекаются в патологические процессы [8]. Хорошо известно, что на введение чужеродного антигена организм отвечает повышением уровней специфических иммуноглобулинов. Публикаций о влиянии иммунизации на АМП чрезвычайно мало. Есть данные об индукции эпителиального бета-дефензина-3 в результате иммунизации мышей живыми клетками Pseudomonas aeruginosa [9]. На группе здоровых добровольцев, получавших живые аттенуированные бактериальные вакцины, показано подавление экспрессии эпителиального кишечного альфа-дефензина [10]. При иммунизации мышей антигенами разных видов дрожжей наблюдали увеличение специфических иммуноглобулинов наряду с повышением активности АМП-фракции сывороток животных по отношению к одному виду дрожжей, а именно C. albicans [4].

В настоящей работе оценивали не только активность АМП-фракций сыворотки против C. albicans в результате иммунизации животных, но и ту же активность против других значимых видов дрожжей, а также общую ПГА сывороток. Оказалось, что общая ПГА сывороток под действием иммунизации менялась незначительно, однако имела тенденцию к снижению независимо от вида дрожжей. В то же время активность АМП-фракций сывороток варьировала гораздо сильнее, при этом имела место зависимость от вида дрожжевых грибов: под действием C. albicans, Cr. neoformans, G. candidum и S. cerevisiae она значительно возрастала, а под действием прочих — снижалась. Обращает на себя внимание тот факт, что общая активность сывороток (и активность их АМП-фракций) у «чистых» и иммунизированных кроликов коррелировала между собой, что свидетельствует о некоторой специфичности по отношению к разным видам испытуемых дрожжей. Наиболее высокая чувствительность к АМП-фракции сывороток характерна для C. albicans, особенно в отношении сыворотки кролика, иммунизированного этими же дрожжами. Очевидно, что наибольшую активность АМП-фракции организм проявляет в отношении грибов, наиболее часто выступающих в качестве возбудителя микозов. Именно их антигены, попадая в организм животного, вызывают повышение иммунного ответа не только в виде специфических иммуноглобулинов, но и в виде комплекса АМП. Напротив, наименьшую активность организм проявляет по отношению к представителям нормобиоты и видам, поступающим с пищевыми продуктами.

Недавно установлено, что сывороточный альбумин в физиологических концентрациях (порядка 50 мг/мл и выше) обладает непосредственным антимикробным действием на клетки дрожжевых грибов и бактерий, проявляя при этом дозозависимый эффект [10]. Определение концентрации альбумина в настоящем исследовании показало отсутствие существенных различий в этих показателях у иммунизированных и неиммунизированных животных. Однако для некоторых видов дрожжей наблюдалась корреляция между концентрацией альбумина и общей активностью сыворотки. Величина коэффициента корреляции Пирсона убывала в ряду: C. albicans — R. mucilaginosa — M. furfur — T. cutaneum — G. candidum — Cr. neoformans — S. cerevisiae. Наиболее высокой взаимосвязь между общей ПГА сыворотки и концентрацией альбумина была в случае дрожжей C. albicans.

Заключение

Альбумин сыворотки, как и АМП, обладает специфичностью в отношении разных дрожжевых грибов, причем наибольшую активность они проявляют в отношении тех видов, которые чаще выступают в роли условных патогенов.

Об авторах

В. Г. Арзуманян

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Автор, ответственный за переписку.
Email: veraar@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9769-1634

Арзуманян Вера Георгиевна — доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией физиологии грибов и бактерий

105064, Москва

Россия

А. М. Иксанова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: asya7700@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8841-910X

Иксанова Асия Мунировна — лаборант-исследователь лаборатории физиологии грибов и бактерий

105064, Москва

Россия

T. А. Артемьева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: tamar1946@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5187-6676

Артемьева Тамара Алексеевна — ведущий технолог лаборатории физиологии грибов и бактерий

105064, Москва

Россия

Л. М. Бутовченко

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: lubu1504@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1964-2399

Бутовченко Любовь Михайловна — ведущий инженер лаборатории физиологии грибов и бактерий

105064, Москва

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы