Effect of Rabbit Immunization with Yeast Antigens on the Activity of the Fraction of Serum Antimicrobial Peptides

Full Text

Введение

Прямым противомикробным действием сыворотки крови млекопитающих обладают белки системы комплемента, иммуноглобулины и антимикробные пептиды (АМП). При различных механизмах это действие выражается в повреждении клеточной мембраны патогенных микроорганизмов [1]. На основании данного свойства разработан способ оценки общей противомикробной активности сыворотки крови и ее низкомолекулярной фракции (2,8-80 кД), в которую входят АМП [2]. Данный способ заключается в действии образцов сыворотки на клетки тест-культур микроорганизмов и спектрофотометрическом измерении процента красителя, вошедшего в убитые клетки, по сравнению с контролем. С помощью этого метода определены указанные свойства сывороток 4 видов млекопитающих, включая человека, и обнаружены различия в величинах противогрибковой активности (ПГА) АМП-фракций сывороток, но не в величинах общей активности [3]. Этим же методом показано. что иммунизация мышей дрожжевыми антигенами приводила не только к увеличению уровней специфических иммуноглобулинов класса G, но и к повышению активности фракции АМП по отношению к Candida albicans [4].

Целью исследования явилось изучение влияния иммунизации кроликов клетками разных видов условно-патогенных дрожжевых грибов на общую антимикробную активность сыворотки и специфическую активность фракции ее АМП.

Материал и методы

Опытная группа кроликов состояла из 7 здоровых самок породы шиншилла массой 1,5 кг, полученных из питомника ФГБУН «НЦБМТ» ФМБА России, филиал «Андреевка». Контрольную группу составляли 4 таких же кролика. Эксперименты проводили в соответствии с межгосударственным стандартом по содержанию и уходу за лабораторными животными (ГОСТ 33217-2014).

Штаммы дрожжей Candida albicans № 927, Rhodotorula mucilaginosa № 132, Malassezia furfur № 1451, Cryptococcus neoformans № 3465, Geotrichum candidum № 1206, Trichosporon cutaneum № 18 получены из коллекции ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова; а Saccharomyces cerevisiae Y-375 — из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Суспензии клеток для иммунизации и прочих опытов готовили из экспоненциальных культур, выращенных на плотной среде Сабуро при 25°С (в случае M. furfur — на модифицированной среде Диксона при 32°С).

Иммунизацию кроликов проводили по следующей схеме: каждого кролика из опытной группы иммунизировали суспензией убитых мертиолятом клеток одной из культур дрожжей плотностью 10¹⁰ КОЕ/мл в объеме 1 мл, внутримышечно (в бедро), 8-кратно в течение 2 мес. Сыворотки получали от всех кроликов одновременно, включая контрольную группу, лиофильно высушивали, определяли плотность путем взвешивания сухих остатков и соотнесения с объемами исходных сывороток, после чего хранили при 5°С. Для проведения каждого эксперимента с одним видом дрожжей взвешивали часть сыворотки, разводя ее до исходной плотности дистиллированной стерильной водой.

Фракции, содержащие АМП, получали путем фильтрования сывороток через молекулярные фильтры «Amicon Ultra» («Millipore», «Merck») с диаметром пор 100 кД на центрифуге в течение 15 мин при 16 000 об/мин. ПГА определяли по схеме: аликвоты сывороток или их АМП-фракций объемом 150 мкл (контрольная пробирка содержала физиологический раствор) соединяли с 50 мкл суспензии дрожжей в пробирках типа Эппендорф, инкубировали 2 ч при 32°С на шейкере, затем центрифугировали 5 мин при 16 000 об/мин, супернатанты удаляли, а к осадкам добавляли по 300 мкл раствора бромкрезолового пурпурного в фосфатном буфере рН 4,6. Смесь суспендировали, инкубировали 45 мин при 32°С на шейкере, затем суспензии вновь центрифугировали и по 50 мкл полученных супернатантов добавляли в заранее подготовленные пробирки, содержащие по 2,5 мл фосфатного буфера рН 4,6. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре «Genesys 10S UV-Vis» при длине волны 440 нм в кюветах толщиной 1 см. Активность рассчитывали в процентах по отношению к контрольному образцу [5].

Метод определения концентрации сывороточного альбумина основан на образовании окрашенных комплексных соединений при взаимодействии альбумина с бромкрезоловым зеленым в слабокислой среде в присутствии детергента. К 0,1 мл сыворотки, разведенной в 10 раз, добавляли 4 мл реактива, содержащего бромкрезоловый зеленый и детергент Triron Х-100 в ацетатном буфере («Альбумин Агат», «Агат», Россия); инкубацию проводили в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете толщиной 1 см. Калибровочные растворы делали на основе человеческого сывороточного альбумина («Reanal», Чехия). Прямая зависимость оптической плотности от концентрации альбумина имела место в диапазоне концентраций 0,3-20 мг/мл.

Статистический анализ проводили с помощью программы Microsoft Excel. Коэффициенты МаннаУитни, свидетельствующие о наличии/отсутствии значимости различий между показателями, рассчитывали с помощью автоматической программы¹. В качестве показателя корреляционных взаимосвязей использовали коэффициент Пирсона (г).

Результаты

В табл. 1 приведены медианы величин общей ПГА сывороток, полученных при иммунизации кроликов дрожжевыми антигенами, и контрольных («чистых») кроликов. Сравнение данных величин показывает наличие прямой корреляции высокой степени между общей активностью сыворотки иммунизированных кроликов (горизонтальные ряды) и общей активностью неиммунизированных животных (верхний ряд) против разных видов дрожжей. Кроме того, если сравнивать те же величины (верхний ряд) с активностями сывороток иммунизированных кроликов против тех же культур, которыми они были иммунизированы (числа, выделенные жирным шрифтом), то обнаруживается также высокая положительная корреляция (г = 0,819). Несмотря на то что достоверность различий в величинах общей активности между выборками неиммунизированных и иммунизированных кроликов не в каждом случае высока, векторы изменения общей ПГА для всех изучаемых микроорганизмов одинаковы — тенденция к снижению активности в результате иммунизации.

 

 

В табл. 2 приведены медианы величин ПГА фракции сывороточных антимикробных пептидов кроликов в ответ на иммунизацию дрожжевыми клетками. Видно, что, в отличие от величин общей активности, эти величины менялись значительно, о чем свидетельствуют значения коэффициентов Манна-Уитни. Однако прямая корреляция высокой силы между АМП-активностью сыворотки иммунизированных кроликов (горизонтальные ряды) и общей активностью неиммунизированных животных (верхний ряд) также имела место. Сравнение тех же величин (верхний ряд) с АМП-активностями сывороток иммунизированных кроликов против тех же культур, которыми они были иммунизированы (числа, выделенные жирным шрифтом), показало также наличие высокой положительной корреляции (г = 0,687). В отличие от общей активности векторы изменения АМП-активностей зависели от вида дрожжей: в случае иммунизации S. cerevisiae, G. candidum, Cr. neoformans и C. albicans имело место повышение данного показателя, тогда как после иммунизации R. mucilaginosa, M. furfur и T. cutaneum — снижение.

 

Интересно отметить, что значения общей активности сыворотки иммунизированных кроликов против данной культуры не коррелировали с таковыми для АМП-активности (г = -0,006).

Концентрацию альбумина определяли во всех сыворотках: медиана для неиммунизированных кроликов равна 86,9 мг/мл, а для иммунизированных — 83,1 мг/мл. Различия между выборками недостоверны: p > 0,05. Сравнение величин концентрации альбумина и общей активности сывороток против разных видов дрожжей по всей выборке иммунизированных и неиммунизированных кроликов дало следующие коэффициенты корреляции: для C. albicans — 0,760; для R. mucilaginosa — 0,728; для M. furfur — 0,723; для Cr. neoformans — 0,316; для G. candidum — 0,432; для T. cutaneum — 0,588 и для S. cerevisiae — 0,056.

Обсуждение

Дрожжевые грибы родов Candida, Cryptococcus, Rhodotorula и Trichosporon имеют большое значение в клинической практике, а такие роды, как Geotrichum и Saccharomyces, часто встречаются в продуктах питания [7]. Дрожжи рода Malassezia являются нормальными обитателями кожи теплокровных животных, но при иммунодефиците вовлекаются в патологические процессы [8]. Хорошо известно, что на введение чужеродного антигена организм отвечает повышением уровней специфических иммуноглобулинов. Публикаций о влиянии иммунизации на АМП чрезвычайно мало. Есть данные об индукции эпителиального бета-дефензина-3 в результате иммунизации мышей живыми клетками Pseudomonas aeruginosa [9]. На группе здоровых добровольцев, получавших живые аттенуированные бактериальные вакцины, показано подавление экспрессии эпителиального кишечного альфа-дефензина [10]. При иммунизации мышей антигенами разных видов дрожжей наблюдали увеличение специфических иммуноглобулинов наряду с повышением активности АМП-фракции сывороток животных по отношению к одному виду дрожжей, а именно C. albicans [4].

В настоящей работе оценивали не только активность АМП-фракций сыворотки против C. albicans в результате иммунизации животных, но и ту же активность против других значимых видов дрожжей, а также общую ПГА сывороток. Оказалось, что общая ПГА сывороток под действием иммунизации менялась незначительно, однако имела тенденцию к снижению независимо от вида дрожжей. В то же время активность АМП-фракций сывороток варьировала гораздо сильнее, при этом имела место зависимость от вида дрожжевых грибов: под действием C. albicans, Cr. neoformans, G. candidum и S. cerevisiae она значительно возрастала, а под действием прочих — снижалась. Обращает на себя внимание тот факт, что общая активность сывороток (и активность их АМП-фракций) у «чистых» и иммунизированных кроликов коррелировала между собой, что свидетельствует о некоторой специфичности по отношению к разным видам испытуемых дрожжей. Наиболее высокая чувствительность к АМП-фракции сывороток характерна для C. albicans, особенно в отношении сыворотки кролика, иммунизированного этими же дрожжами. Очевидно, что наибольшую активность АМП-фракции организм проявляет в отношении грибов, наиболее часто выступающих в качестве возбудителя микозов. Именно их антигены, попадая в организм животного, вызывают повышение иммунного ответа не только в виде специфических иммуноглобулинов, но и в виде комплекса АМП. Напротив, наименьшую активность организм проявляет по отношению к представителям нормобиоты и видам, поступающим с пищевыми продуктами.

Недавно установлено, что сывороточный альбумин в физиологических концентрациях (порядка 50 мг/мл и выше) обладает непосредственным антимикробным действием на клетки дрожжевых грибов и бактерий, проявляя при этом дозозависимый эффект [10]. Определение концентрации альбумина в настоящем исследовании показало отсутствие существенных различий в этих показателях у иммунизированных и неиммунизированных животных. Однако для некоторых видов дрожжей наблюдалась корреляция между концентрацией альбумина и общей активностью сыворотки. Величина коэффициента корреляции Пирсона убывала в ряду: C. albicans — R. mucilaginosa — M. furfur — T. cutaneum — G. candidum — Cr. neoformans — S. cerevisiae. Наиболее высокой взаимосвязь между общей ПГА сыворотки и концентрацией альбумина была в случае дрожжей C. albicans.

Заключение

Альбумин сыворотки, как и АМП, обладает специфичностью в отношении разных дрожжевых грибов, причем наибольшую активность они проявляют в отношении тех видов, которые чаще выступают в роли условных патогенов.

About the authors

V. G. Arzumanian

Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: veraar@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9769-1634

Vera G. Arzumanian — Doct. Sci. (Biol.), Prof., Head, Laboratory of physiology of fungi and bacteria

Moscow 105064

Russian Federation

A. M. Iksanova

Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: asya7700@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8841-910X

Asiya M. Iksanova — research assistant, Laboratory of physiology of fungi and bacteria

Moscow 105064

Russian Federation

T. A. Artemyeva

Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: tamar1946@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5187-6676

Tamara A. Artemyeva — lead technologist, Laboratory of physiology of fungi and bacteria

Moscow 105064

Russian Federation

L. M. Butovchenko

Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: lubu1504@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1964-2399

Lyubov M. Butovchenko — lead engineer, Laboratory of physiology of fungi and bacteria

Moscow 105064

Russian Federation

References

Supplementary files