Detection of enterotoxigenic strains Staphylococcus aureus, producing SEC and SEI, isolated in patients with pneumonia, sepsis and burns

Full Text

Введение

Staphylococcus aureus бактериальный патоген, вызывающий различные заболевания, от лёгких фурункулов и кожных инфекций до таких серьёзных заболеваний, как остеомиелит, эндокардит, пневмония, менингит и синдром токсического шока [1]. Кроме того S. aureus вызывает бактеримию, которая часто возникает в результате кожных инфекций при наличии хирургических ран, пневмонии, использования инфицированных катетеров, внутривенного употребления наркотиков и в 20-40% случаев становится причиной смертности [2]. Эти заболевания связаны с выработкой факторов патогенности, в частности со стафилококковыми энтеротоксинами (SE). Тем не менее недавние исследования показывают, что SE играют более значительную роль в проявлении ряда других заболеваний человека, в том числе связанных с дыхательными путями и развитием аутоиммунных заболеваний.

SE являются мощными неспецифическими стимуляторами Т-клеток (суперантигенами), которые вызывают нерегулируемую активацию иммунного ответа. Если эта стимуляция сохраняется, возникает массивная перегрузка цитокинами, включая клинические признаки синдрома токсического шока: быстрое начало лихорадки, полиорганная недостаточность и высокая смертность. В отличие от большинства секретируемых токсинов, продуцируемых S. aureus, SE токсичны для человека даже в незначительных количествах. Они способны вызывать рвоту и гастроэнтериты при однократном поступлении 100 нг 1 мкг [3]. Кроме того, все SE играют значительную медиаторную роль: они являются суперантигенами и способны увеличивать токсичность эндотоксинов более чем в 1000 раз, что может вызвать синдром токсического шока. Так, в случае попадания энтеротоксина в организм человека с тяжёлым инфекционным заболеванием (например, с сепсисом, пневмонией, ожогами) вместо пищевого отравления развивается иммунодефицитное состояние. Смертельная доза эндотоксина для людей составляет 1-2 мг, а при адекватном добавлении суперантигена, которым может выступать SE, минимальная смертельная доза эндотоксина может снижаться до пикограммов [4].

Известно, что стафилококки продуцируют не менее 26 различных суперантигенов (SAg), включая SE (SEA-E, SEG-J и SER-T); стафилококковые энтеротоксиноподобные токсины (SEl: SElK-Q, -U, -V и -X Z); токсин токсического шока (TSST-1) [5]. SAg индуцируют νβ-специфическую пролиферацию Т-клеток наряду с высвобождением провоспалительных цитокинов, включая интерлейкины (IL) -1, -2, -6; фактор некроза опухоли (TNF-α), интерферон-гамма (IFN-γ) и хемокины CCL2 и CCL3 [6]. Кроме того, имеются данные, что SEC стимулирует секрецию IL-8 в эндотелиальных клетках аорты человека [7]. Неконтролируемое высвобождение провоспалительных медиаторов может привести к сыпи, лихорадке, коме и смерти от сильного шока. Наибольшее значение в практике имеют стафилококковые энтеротоксины типов: SEA, SEB, SEC. SED, SEE, а также TSST-1, которые являются причиной 95% пищевых отравлений стафилококковой этиологии. SE могут быть пусковым механизмом в развитии артритов и поражениях миокарда желудочков сердца, особенно у детей, а также причиной внезапной младенческой смертности [8]. Следует отметить, что S. aureus, продуцирует три подтипа SEC (SEC1, SEC2, SEC3), которые различаются по изоэлектрическим точкам (Cl-pI8,6; C2-pI7,8; C3-pI8,0), но иммунологически идентичны между собой и обладают суперантигенной активностью [9, 10].

Особый интерес представляет выявление классического энтеротоксина типа С, продуцируемого штаммами S. aureus, который может существенно повлиять на нормальное функционирование иммунной системы больного. SEC один из наиболее изученных энтеротоксинов, поскольку он был обнаружен третьим и обычно продуцируется устойчивыми к метициллину штаммами S. aureus (MRSA) в очень высоких концентрациях, что может вызвать тяжёлые патологии [11].

Классические SE являются критическими факторами вирулентности при смертельном сепсисе, инфекционном эндокардите и повреждении почек. Следует отметить, что классические энтеротоксины (SEA, SEB, SEC, SED, SEE) продуцируются в количестве от 80 до 100 мкг/мл в жидкой среде, тогда как вновь открытые SE в количестве от 0,0001 до 0,03 мкг/мл [7]. Так, Н. Hogevick и соавт. обнаружили у 15 из 22 пациентов с инфекционным эндокардитом поражение клапанного аппарата сердца, ассоциированное с персистенцией S. aureus [12]. Кроме того, исследование штаммов S. aureus от определённых пациентов с инфекционным эндокардитом продемонстрировало высокую распространённость генов SAg, кодирующих TSST-1, SEC, SEG и SEI, по сравнению с изолятами от инфекций мягких тканей [13].

Не менее важно определение одного из представителей вновь открытых токсинов, а именно энтеротоксина I, который образуется в значительно меньшем количестве, чем классические энтеротоксины, но также способен вызывать дисфункцию иммунной системы.

Целью данной работы было выявление частоты встречаемости стафилококковых энтеротоксинов (SE) типа SEC и SEI, продуцируемыми штаммами S. aureus, выделенных от больных с различной нозологией, инфекционный процесс у которых протекает с выраженной интоксикацией без рвоты и кишечных расстройств.

Материалы и методы

В работе использовали культуры S. aureus, полученные из ГКБ № 1 им. Н.И. Пирогова, ГКБ им. С.П. Боткина и ожогового отделения НИИ СП им. Н.В. Склифосовского (Москва). Штаммы были любезно предоставлены профессором Д.Д. Меньшиковым.

Культивирование проводили на ферментативном казеиновом гидролизате с добавлением 1% сердечно-мозговой вытяжки (Difco). Выращивание штаммов S. aureus проводили в пробирках объемом 50 мл, в которые помещали 5 мл среды. Культивирование осуществляли на шуттель-аппарате при 210 об/мин в течение 24-30 ч при 37 °С. После культивирования микробные клетки удаляли центрифугированием в течение 15 мин при 10 000 об/мин. Наличие SEC и SEI в надосадочной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем с чувствительностью 1 нг/мл [14, 15].

Результаты

Частота встречаемости культур стафилококков, продуцирующих SE типов SEC и SEI, выделенных от больных разного профиля, представлена в табл. 1, 2. Как следует из данных табл. 1, среди 43 штаммов S. aureus, выделенных при пневмонии, частота обнаружения SEС составила 48,3%. Продуцентами SEI был 31 (72,1%) штамм стафилококков, и 20 штаммов продуцировали одновременно SEС и SEI (см. табл. 2). Из 13 изолятов, выделенных при ожоговых инфекциях, только 4 были энтеротоксигенными. При этом 3 (23,0%) изолята продуцировали SEС (см. табл. 1), 2 (15,4%) изолята SEI и 1 (13,0%) изолят одновременно SEC и SEI (см. табл. 2). Среди 11 культур S. aureus, выделенных при сепсисе, 4 (36,4%) штамма продуцировали SEC (см. табл. 1), 5 (45,5%) штаммов продуцировали SEI и 3 штамма (27,3%) SEC и SEI (см. табл. 2). При исследовании нами обнаружено 4 штамма S. aureus, выделенных из катетеров, 2 из них продуцировали SEC и 3 штамма образовывали SEI. Кроме того, были выделены две культуры из зева и одна из плевральной жидкости. В двух штаммах из зева был обнаружен SEI и в одном SEC и SEI. В одном штамме, выделенном из плевральной жидкости, были выявлены SEC и SEI.

 

 

Обсуждение

В данной работе было выявлено, что доля культур S. aureus, продуцирующих энтеротоксины SEC, при сепсисе значительно выше, чем штаммов продуцентов SEB (5,4%) и намного меньше, чем SEA (75,6%), что изучалось нами ранее и освещено в предыдущей публикации [16]. При пневмонии был обнаружен самый высокий процент SEI-положительных штаммов по сравнению со штаммами, которые продуцируют классические энтеротоксины SEA, SEB и SEC. При ожоговых инфекциях доля штаммов, продуцирующих SEC и SEI, составила 15,4 и 23,0% соответственно, что значительно ниже, чем SEA (92,9%).

Известно, что стафилококковые энтеротоксины образуются в условиях интенсивной аэрации. Лёгкие являются благоприятной средой для роста стафилококков и интенсивного токсинообразования. Так, в ранее опубликованной работе установлено, что среднее количество SEA (мкг/мл) было значительно больше у штаммов S. aureus, выделенных при пневмонии, чем при ожоговых ранах [16]. В связи с этим необходимо дальнейшее углублённое изучение роли токсинообразования SEA стафилококков при пневмонии, что может повлиять на тактику лечения для улучшения исходов пневмоний.

Стафилококки самая распространённая причина сепсиса (бактеримии) [17]. Из всех бактериальных инфекций кровотока устойчивый к метициллину S. aureus ассоциировался с самым высоким показателем общей смертности (22,5%). S. aureus был наиболее часто встречающимся патогеном при всех типах бактериемии с ранним началом [18]. Бактериемия S. aureus часто возникает в результате кожных инфекций, инфицирования катетеров, обсеменения и загрязнения хирургических ран, вследствие пневмонии или внутривенного употребления наркотиков.

Имеются данные о том, что S. aureus способен адгезироваться на полимерных материалах и образовывать биоплёнки. Бактериальные клетки в биоплёнках чрезвычайно устойчивы к лекарственному лечению и атакам иммунной системы, что является распространённой причиной инфицирования катетеров, имплантатов, кардиостимуляторов [19, 20]. Для элиминации стафилококковых биоплёнок необходимо заменить или удалить полимерный материал из организма человека, что не всегда возможно из-за клинических обстоятельств, в результате чего значительно повышается заболеваемость и смертность пациентов [21]. До недавнего времени не было эффективного препарата против адгезии стафилококков на катетерах. Однако последние исследования показали, что катетеры, покрытые ауранофином, способны ингибировать рост MRSA, а также полностью ингибировать образование биоплёнки MRSA [22].

Следует отметить, что при антибиотикотерапии кроме колоний стафилококков нормального размера (1-3 мм) могут встречаться малые варианты колоний, размер которых примерно в 10 раз меньше. Они обладают меньшей вирулентностью, но большей способностью адгезироваться на полимерных материалах и часто не выявляются при посеве крови. Малые колонии стафилококков трудно обнаружить, их часто упускают из виду или неправильно идентифицируют из-за уменьшенного примерно в 6 раз времени регенерации [23]. Они, как правило, обладают высокой антибиотикорезистентностью к ванкомицину, рифампину, ампициллин-сульбактаму и гентамицину [24]. Малые варианты колоний S. aureus могут персистировать в клетках хозяина в течение нескольких лет и вызывать стойкие рецидивирующие инфекции, что способствует их внутриклеточной выживаемости и уклонению от иммунной системы [25]. Следовательно, существует острая потребность в новых и эффективных диагностических препаратах для определения продуктов жизнедеятельности стафилококков с целью проведения соответствующих терапевтических вмешательств.

Борьба со стафилококковыми инфекциями в последнее время значительно усложняется в связи с распространением MRSA. Резистентность золотистого стафилококка является причиной смерти около 19 000 госпитализированных пациентов в США, что аналогично количеству смертей от СПИДа, туберкулёза и вирусного гепатита, вместе взятых [26]. Несмотря на высокую частоту возникновения угрожающих жизни заболеваний и устойчивых к лекарствам инфекций, не существует успешной вакцины для предотвращения заболеваемости S. aureus.

Заключение

Полученные нами данные свидетельствуют о необходимости своевременного обнаружения штаммов S. aureus, продуцирующих SEC у больных с пневмонией, ожогами и сепсисом, поскольку он является решающим фактором вирулентности, приводящим к летальному сепсису, инфекционному эндокардиту и синдрому токсического шока, с целью его элиминации. Кроме того, нами показана необходимость дальнейшего изучения роли не только классических энтеротоксинов, но и вновь открытых, поскольку их продукция также демонстрируется теми штаммами S. aureus, что выделены у больных с тяжёлыми заболеваниями.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

F. S. Fluer

Federal State Budgetary Institution «National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after honorary academician N.F. Gamalei» of the Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: fluerfs@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5111-7888
Fedor S. Fluer, Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Laboratory of Molecular Fundamentals of Pathogenicity, Staphylococcal Infections Group, Moscow, 123098, Russia Russian Federation

Ya. A. Panova

Federal State Budgetary Institution «National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after honorary academician N.F. Gamalei» of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2344-8532
Moscow, 123098, Russia Russian Federation

A. A. Azanova

Federal State Budgetary Institution «National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after honorary academician N.F. Gamalei» of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5519-5285
Moscow, 123098, Russia Russian Federation

E. V. Mamycheva

Federal State Budgetary Institution «National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after honorary academician N.F. Gamalei» of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0160-7547
Moscow, 123098, Russia Russian Federation

References

Supplementary files