Протективные эффекты катионов цинка в отношении бактерий Staphylococcus aureus, подвергающихся воздействию антибиотиков

Полный текст

Введение

Антибактериальные свойства катионов цинка, специфически проявляющиеся, в частности, на клинических изолятах Streptococcus pyogenes [1], Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa [2], на шига-токсигенных Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae [3], а также способность металла блокировать развитие SOS-реакций, ведущих посредством индукции гипермутагенеза к формированию устойчивости бактерий к действию антибиотиков [3], определяют методологию комбинирования цинка с антибактериальными препаратами. По мнению исследователей, это должно повышать эффективность последних в терапии хронических инфекций, поскольку применение классических антибиотиков не позволяет достичь полной элиминации возбудителя и купирования инфекционного процесса [4-6].

Действительно, комплексы цинка с соединениями группы фторхинолонов левофлоксацином и ципрофлоксацином за счёт изменения проницаемости клеточной мембраны обладают более высокой антимикробной активностью в отношении бактерий S. aureus, E. coli, K. pneumoniae и Bacillus dysenteriae, чем исходные антибиотики [4, 5]. Связавший цинк и полимеризованный им ванкомицин реализует повышенную активность против резистентных к самому ванкомицину бактерий [6]. В составе эритромицин-цинкового комплекса цинк предотвращает развитие бактериальной резистентности к эритромицину.

В то же время образование антибиотиками комплексов с цинком может приводить не только к повышению, но и к снижению их антимикробного потенциала, что позволяет трактовать взаимодействие металлов с антибиотиками в качестве фактора, в определённой мере препятствующего достижению эффекта антимикробной химиотерапии.

Целью работы стала оценка чувствительности бактерий S. aureus к действию стандартного набора антибиотиков при нанесении на диск с антибиотиком катионов цинка или в условиях предобработки катионами цинка газона бактерий.

Материалы и методы

Первичные культуры бактерий S. aureus получены принятым методом посева патологического биоматериала человека на элективные и селективные питательные среды. В работе использовали 10 клинических изолятов S. aureus, предварительно охарактеризованных по чувствительности к антибактериальным препаратам с использованием диско-диффузионного метода и стандартных условий.

Для постановки реакций стандартизованную суспензию бактерий, полученную из суточных культур S. aureus и содержавшую 10⁸ КОЕ/мл, засевали газоном из объёма 1,0 мл суспензии в физиологическом растворе на стандартные стерильные чашки Петри диаметром 90 мм с питательным агаром Мюллера-Хинтона (ООО «НИЦФ», Санкт-Петербург). Спустя 30 мин на поверхность газона по стандартному шаблону помещали бумажные диски, пропитанные антибиотиками. Использовали расширенный набор из 14 дисков для определения чувствительности стафилококков к противомикробным лекарственным средствам (№011214, ООО «НИЦФ», Санкт-Петербург).

Катионы цинка применяли в виде водного сульфата ZnSO₄ х 7H₂O в 0,15 М растворе NaCl (pH 7,16-7,62). Раствор в объёме 5 мкл наносили на диски с антибиотиками непосредственно после их размещения на поверхности газона, добиваясь полного смачивания диска. Искомая концентрация катионов цинка на диске составляла 1,0 мкг/мл или соответствовала одному, четырём или восьми катионам на молекулу антибиотика. В отдельных экспериментах содержавший катионы цинка в искомых концентрациях 0,15 М раствор NaCl (pH 7,6-7,8) в объёме 5 мкл наносили непосредственно на поверхность газона по стандартному шаблону и выдерживали 10 мин экспозиции при комнатной температуре, после чего на местах нанесения катионов цинка размещали диски с антибиотиками.

Чашки Петри, содержавшие размещённые на газоне культуры бактерий S. aureus диски с антибиотиками и катионы цинка, инкубировали в течение 24 ч при 37 °С. По истечении срока инкубации результат учитывали, определяя диаметр зоны задержки роста культуры с использованием угловой линейки Partigen (Behringwerke AG, Германия).

Для каждого клинического изолята бактерий использовали не менее двух параллельных постановок.

На препаративном этапе исследования маточный раствор сульфата цинка в 0,15 М NaCl стерилизовали методом мембранной фильтрации с использованием насадок для водно-солевых растворов Millex с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore, США), после чего готовили образцы с искомой концентрацией катионов металла в 0,15 М растворе NaCl.

В ходе экспериментов кислотность 0,15 М раствора NaCl контролировали с помощью базового электронного рН-метра Sartorius PB-11, укомплектованного электродом Sartorius PY-P11.

При математической обработке результатов исследования достоверность различия средних величин устанавливали с помощью ί-критерия Стьюдента.

Результаты

В присутствии на диске с антибиотиком катионов цинка в физиологической концентрации 1,0 мкг/мл зона задержки роста S. aureus увеличилась в диаметре на 3,0 мм и более в 8 (5,7%) из 140 наблюдений и уменьшилась на 3,0 мм и более в 4 (2,9%). Тенденция к повышению чувствительности S. aureus проявилась на газоне бактерий, подверженных воздействию клиндамицина, линезолида и левомицетина (по 2 наблюдения); тенденция к снижению чувствительности обнаружилась при обработке газона (другие изоляты) левомицетином (2 наблюдения).

Из наиболее показательных по средним значениям эффектов катионов цинка следует отметить увеличение диаметра зоны задержки роста S. aureus в присутствии клиндамицина на 4,1% (р > 0,1), в присутствии ванкомицина на 4,0% (р < 0,1).

В присутствии на диске эквимолярных по отношению к антибиотику количеств катионов цинка зона задержки роста S. aureus увеличилась в диаметре в 10 (7,1%) из 140 наблюдений и уменьшилась в 2 (1,4%). Тенденция к повышению чувствительности S. aureus проявилась на газоне бактерий, подверженных воздействию линезолида и котримоксазола (по 2 наблюдения), левомицетина (4 случая).

Наиболее показательно увеличение диаметра зоны задержки роста S. aureus в присутствии рифампицина на 3,15% (р > 0,1), в присутствии левомицетина на 11,5% (р < 0,1) и уменьшение в присутствии ванкомицина на 3,4% (р > 0,1).

В присутствии на диске четырёх катионов цинка на молекулу антибиотика зона задержки роста S. aureus увеличилась в 1 (0,7%) из 140 наблюдений и уменьшилась в 3 (2,1%). В присутствии линезолида диаметр зоны задержки роста S. aureus увеличился на 4,5% (р > 0,1), доксициклина на 2,7%, левомицетина на 2,2%, а в присутствии фузидина натрия уменьшился на 2,9%.

В присутствии на диске восьми катионов цинка на молекулу антибиотика зона задержки роста S. aureus увеличилась в 3 (2,1%) из 140 наблюдений и уменьшилась в 8 (5,7%). Тенденция к повышению чувствительности S. aureus проявилась на газоне бактерий, подверженных воздействию доксициклина, 2 наблюдения. Тенденция к снижению чувствительности обнаружилась при обработке газона бензилпенициллином, оксациллином и гентамицином по 2 наблюдения.

Диаметр зоны задержки роста S. aureus в присутствии доксициклина увеличился на 5,4%, в присутствии левомицетина на 4,4% (р > 0, 1), тогда как в присутствии бензилпенициллина уменьшился на 4,0%, оксациллина на 5,6%, эритромицина на 3,3% (р > 0,1), ципрофлоксацина на 3,3%, левофлоксацина на 4,2%, фузидина натрия на 3,5% (р > 0,1).

Предобработка газона бактерий в области последующей установки диска с антибиотиком катионами цинка (8 катионов на молекулу антибиотика) способствовала увеличению диаметра зоны задержки роста S. aureus на 1,0 мм и более в 4 (12,1%) из 33 проведённых наблюдений и уменьшению на 1,0 мм и более в 9 (27,3%). Тенденция к повышению чувствительности S. aureus проявилась на газоне бактерий, подверженных воздействию оксациллина, 3 случая. Тенденция к снижению чувствительности обнаружилась при обработке газона ципрофлоксацином, левофлоксацином и фузидином натрия по 2 наблюдения.

Как показывают данные табл. 1, по сравнению с действием катионов цинка, нанесённых на диск с антибиотиком, предобработка газона катионами цинка оказывает на 7,2% (р < 0,05) более выраженное протективное действие на бактерии S. aureus, которые становятся при этом на 10,5% (р < 0,01) более устойчивыми к действию применённого спектра антибиотиков по сравнению с контролем без металла.

 

 

Предобработка газона бактерий катионами цинка, применёнными в эквимолярном отношении к антибиотику, способствует увеличению диаметра зоны задержки роста S. aureus в 1 (3,0%) из 33 наблюдений и уменьшению в 15 (45,5%). Тенденция к снижению чувствительности обнаружилась при обработке газона оксациллином, левофлоксацином и фузидином натрия по 3 наблюдения.

Как показывают данные табл. 2, по сравнению с действием катионов цинка, нанесённых на диск с антибиотиком, предобработка газона катионами цинка оказывает на 10,4% (р < 0,05) более выраженное протективное действие на бактерии S. aureus, которые становятся при этом на 9,3% (р > 0,1) более устойчивыми к действию применённого спектра антибиотиков, чем в контроле без металла.

 

Обсуждение

Эволюционная динамика бактериальных популяций в контексте их адаптации к условиям окружающей среды и персистенции в организме хозяина формирует ряд механизмов, позволяющих бактериям поддерживать режимы продуктивного развития, даже подвергаясь воздействию неблагоприятных факторов макрои микроокружения. К числу таких механизмов правомерно относить на первый взгляд не связанные между собой тонкие настройки гомеостаза тяжёлых металлов, в первую очередь цинка, содержание которого в клетках разных видов бактерий поддерживается на достаточно близком уровне при относительно невысоком диапазоне вариабельности [7, 8], способность к образованию биоплёнок, существенно повышающих устойчивость микробов к действию токсичных соединений и антибиотиков [9, 10], генерацию популяций персистеров, обеспечивающих бактериям переживание неблагоприятных условий окружения и восстановление в последующем процессов персистенции [11, 12].

Поскольку металлы не синтезируются и не подлежат деградации в биологических системах, поддержание их гомеостаза определяется регуляцией транспортных и обменных процессов между клеткой и окружающей её средой [7]. На ограничение доступности металлов бактериальная клетка отвечает дерепрессией высокоаффинных систем импорта, заменой металлозависимых белков и ферментов на металлонезависимые, мобилизацией металла из внутриклеточных депо, перепрограммированием протеома на трансляционную репрессию синтеза менее важных для её жизнеобеспечения ферментов [7].

Первостепенная роль цинка в процессах деления бактериальной клетки и поддержания её жизнедеятельности в ходе инфекционного процесса обусловливает экспрессию бактериями Streptococcus pneumoniae специфических импортёров цинка AdcA и AdcAII, продукцию S. aureus металлофора стафилонина и высокоаффинных специфических транспортёров, наличие в протеоме Bacillus subtilis белков, связывающих цинк с константами порядка 10^-15 М, которые определяют содержание у бактерий, соответствующих по размерам B. subtilis, не более 10⁶ атомов цинка на клетку и отсутствие в физиологических условиях полностью гидратированного (свободного) цинка в цитозоле [8].

Активное потребление бактериями катионов цинка, даже в условиях применения относительно низких сублетальных концентраций металла, вызывает форсирование мутагенеза и обогащение de novo мутантов, селекционируемых под давлением механизмов отбора на проявление множественной устойчивости к антибиотикам. Одновременно физиологические концентрации цинка (но не кальция или магния) способствуют формированию биоплёнок S. aureus, образующихся с участием фибронектин-связывающих белков [13] и переводящих бактерии в семидормантное состояние. Микробы оказываются недоступными для распознавания и не подлежат элиминации нейтрофилами и макрофагами организма хозяина, обретая при этом устойчивость к антибиотикам [13].

Биоплёнки S. aureus, формирующиеся у бактерий в условиях повышенной агрегации из подобных биоплёнкам кластеров, которые образуются вследствие снижения активности регуляторной системы Agr, ответственной за диспергирование биоплёнок посредством синтеза фенол-растворимых модулинов [9], совокупностью химических, физических и физиологических механизмов, включая факторы фенотипической диверсификации популяций, создают условия для защиты бактерий от антибиотиков, дезинфектантов и тяжёлых металлов [10]. Даже высокие концентрации антибиотиков не эффективны в отношении бактерий S. aureus, переведённых в состояние биоплёнки [9, 10].

Вместе с тем биоплёнки стафилококков, как и других патогенных плёнкообразующих бактерий стрептококков, P. aeruginosa, E. coli, Mycobacterium tuberculosis, создают условия для проявления генерации или собственно генерации клеток-персистеров, метаболически неактивных клеточных форм, находящихся в дормантном состоянии, близком к некультивируемому, с заблокированными на активную реализацию процессами биосинтеза РНК, ДНК, белков, пептидогликанов и фолиевой кислоты, служащими мишенями воздействия классических антибиотиков [11, 12]. В силу особенностей метаболизма и физиологического состояния персистеры защищены от действия классических антибиотиков и тяжёлых металлов [11, 12, 14, 15], активно экспрессируют энергозависимый экспортирующий белок TolC, способствующий эффективному выведению токсичных соединений из клетки [14], гены шаперонов, регулоны множественной устойчивости к антибиотикам, белки холодового шока [10], определяются в микробных биоплёнках в количествах, в тысячи раз превышающих содержание этих клеточных форм в планктонных популяциях [10]. Для разработки средств борьбы с такими персистентными инфекциями требуются принципиально иные, нежели основанные на воздействии на активные метаболические процессы в популяции возбудителей, подходы к антимикробной химиотерапии [11, 12, 15].

В контексте описанных механизмов переживания бактериями неблагоприятных условий существования даже кратковременная экспозиция с катионами цинка индуцирует переход возбудителей в некультивируемое состояние, связанное с генерацией клеток-персистеров. Реализация эффектов катионов в ходе образования биоплёнок S. aureus с участием фибронектин-связывающих белков происходит на стадии, следующей сразу за первичным прилипанием [13]. В полностью сформированных биоплёнках E. coli цинк не проникает глубоко и действует по поверхности матрикса [10].

Следовательно, обменные процессы, связанные с транспортом катионов цинка, образование биоплёнок и генерация персистеров обоснованно представляются механизмами обеспечения переживания бактериальных популяций, имеющими глубокие, последовательно реализуемые причинно-следственные связи, в совокупность которых катионы цинка вовлечены на инициальных и ранних постинициальных этапах [10, 13].

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о протективном действии катионов цинка, нанесённых на диск с антибиотиком, в отношении бактерий S. aureus, подвергающихся воздействию этого антибиотика. Эффект реализуется при использовании физиологической концентрации цинка (протекция бактерий в 2,9% наблюдений) и в присутствии на диске одного, четырёх или восьми катионов цинка на молекулу антибиотика (последовательное нарастание от 1,4 до 5,7% случаев протекции). При этом наиболее выраженное протективное действие катионов (от 27,3 до 45,5% наблюдений в селекционированных по чувствительности изолятах) отмечено в условиях 10-минутной предобработки газона бактерий катионами цинка на местах последующей установки диска с антибиотиком. В этих опытах до половины наблюдений демонстрировали очевидное протективное действие определённой концентрации катионов цинка (см. табл. 1 и 2).

Можно спорить о том, насколько правомерны сравнение начальных этапов формирования газона бактерий с инициальными стадиями образования биоплёнок и рассмотрение краткосрочной экспозиции катионов цинка с клетками на формирующемся газоне в качестве подобия дисперсии катионов по поверхности плёнки [10, 13], но не подлежит сомнению высочайшая скорость реагирования микробов на присутствие тяжёлого металла, отражающая быстрое включение механизмов стрессовых реакций в условиях реализации токсического воздействия. Произведённые расчёты показывают, что концентрации цинка в местах предобработки газона бактерий, ответивших на воздействие металла снижением чувствительности к антибиотикам, по отношению к которым они и были подобраны, варьировали в диапазоне от 0,25 до 2,0 мг/мл, а в отдельных наблюдениях достигали 8,0 мг/мл, т.е. более чем на 3 порядка превышали физиологические и следовательно могут оцениваться в качестве токсичных.

Снижение чувствительности бактерий к антибиотикам выступает естественным следствием немедленного включения S. aureus механизмов протекции популяции от токсического воздействия тяжёлого металла, общность которых с механизмами защиты бактерий от других неблагоприятных воздействий хорошо документирована в научной периодике [10].

Заключение

В совокупности современных представлений о природе и путях возникновения множественной лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний человека, связывающих динамическое нарастание количества резистентных к антибиотикам и другим антимикробным препаратам бактерий с наличием в экосистеме доступных микробам меди и цинка в условиях продолжающегося нарастания содержания тяжёлых металлов в окружающей среде, появляется важнейшая временная категория, определяющая эволюционную динамику резистентности как процесс, запускаемый импульсным воздействием тяжёлых металлов, конкретно цинка, и, не исключено, не контролируемый в дальнейшем для подвергшейся такому воздействию популяции бактерий меняющимися условиями окружения.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

С. Б. Чекнёв

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: cheknev@gamaleya.org
ORCID iD: 0000-0002-9512-7148
Чекнёв Сергей Борисович, д-р мед. наук, заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией межклеточных взаимодействий, 123098, г. Москва Россия

Е. И. Вострова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9214-0590
123098, г. Москва Россия

М. А. Сарычева

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-0250-1581
123098, г. Москва Россия

А. В. Востров

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-2834-537X
123098, г. Москва Россия

Список литературы

Дополнительные файлы