Development of the scheme of obtaining antibodies to the ribonucleoprotein of attenuated rabies virus

Yu. K. Gavrilova; Гаврилова Ю. К.; S. V. Generalov; Генералов С. В.; M. N. Kireev; Киреев М. Н.; N. A. Sharapova; Шарапова Н. А.; E. G. Abramova; Абрамова Е. Г.; L. V. Savitskaya; Савицкая Л. В.; M. V. Ovchinnikova; Овчинникова М. В.; T. Yu. Kirillova; Кириллова Т. Ю.; A. P. Semakova; Семакова А. П.

doi:10.36233/0372-9311-2019-5-3-8

Разработка схемы получения антител к рибонуклео протеину аттенуированного вируса бешенства

Авторы: Гаврилова Ю.К.¹, Генералов С.В.¹, Киреев М.Н.¹, Шарапова Н.А.¹, Абрамова Е.Г.¹, Савицкая Л.В.¹, Овчинникова М.В.¹, Кириллова Т.Ю.¹, Семакова А.П.¹
Учреждения:
1. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Выпуск: Том 96, № 5 (2019)
Страницы: 3-8
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 18.11.2019
Дата принятия к публикации: 18.11.2019
Дата публикации: 18.11.2019
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/467
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-5-3-8
ID: 467

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Выделение рибонуклеопротеина (РНП) аттенуированного вируса бешенства с последующей разработкой схем иммунизации животных препаратами на его основе и установлением наиболее эффективной схемы, позволяющей получить сыворотку с высоким титром антител к РНП.

Материалы и методы. В работе использовали перевиваемую клеточную линию Vero, штамм вируса бешенства «Москва 3253Vero», адаптированный к репродукции на клетках Vero, кроликов породы шиншилла. С целью получения сывороток, содержащих антитела к РНП вируса бешенства, предложены экспериментальные схемы иммунизации животных РНП, в том числе и с адъювантами: полиоксидонием и коллоидным золотом. Динамика накопления антител к РНП вируса бешенства в сыворотке крови подопытных животных исследована методом дот-иммуноанализа.

Результаты. Целевой компонент (РНП вируса бешенства) выделяли непосредственно из цитоплазмы инфицированной вирусом бешенства клеточной культуры Vero по модифицированному методу M. Dastkhosh (2014), лиофильно высушивали и использовали при разработке препаратов для иммунизации животных-продуцентов. При исследовании динамики образования антител к РНП вируса бешенства методом дот-иммуноанализа установлена эффективность действия адъюванта — наночастиц коллоидного золота размером от 15 до 17 нм, применение которого позволяет увеличить титр антител в 2 раза.

Заключение. Полученные результаты представляют интерес для дальнейших исследований, связанных с конструированием диагностических препаратов и разработкой методических приемов с использованием подобных препаратов.

Ключевые слова

бешенство, вирус бешенства, рибонуклеопротеин, схема иммунизации, иммунные сыворотки, антитела к рибонуклеопротеину, антирабический иммуноглобулин

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Бешенство, характеризуемое безрезультативностью лечения инфекции при появлении первых клинических симптомов и, как следствие, абсолютной летальностью, в настоящее время представляет проблему для многих государств мира [15]. Важную роль в предупреждении развития данного заболевания играет своевременное принятие мер экстренной профилактики, а также выявление случаев инфицирование вирусом бешенства с помощью современных лабораторных методов. Для оценки титра антител к вирусу бешенства в сыворотке крови иммунизированных животных, а также для выявления самого вируса, применяют методы, основанные на иммунофлуоресценции [7]. Среди рекомендованных экспертами ВОЗ методов определения титра антител к вирусу бешенства в материале особое место занимает реакция нейтрализации вируса бешенства на клеточной культуре с применением флуоресцирующих антител, которая также известна, как FAVN тест (fluorescent antibody virus neutralization test) [15]. Многочисленные исследования свидетельствуют об успешном использовании различных модификаций данного теста при оценке содержания специфических антител в материале. Основные отличия существующих модификаций состоят в применении различных клеточных линий и штаммов вируса бешенства [7, 10]. Для использования в производстве антирабического иммуноглобулина предложена модификация FAVN теста с применением перевиваемой клеточной линии Vero и штамма вируса бешенства «Москва 3253 Vero» [3]. При постановке реакции нейтрализации на клеточной культуре окрашивание проводят с применением флюоресцирующих конъюгатов на основе антител, полученных к вирусу бешенства [7, 10]. На наш взгляд, более эффективным является выявление не цельного вируса, а его компонента — рибонуклеопротеина (РНП), содержащегося в цитоплазме инфицированной клетки на этапе сборки вирусной частицы. Такой подход позволит сократить время проведения анализа. Более того, применение антител к РНП вируса бешенства оправдано и при конструировании других диагностических наборов, например, для иммуноферментного анализа [6]. Целью данного исследования явилась разработка эффективной схемы получения сыворотки, содержащей специфические антитела к РНП штамма вируса бешенства «Москва 3253 Vero». МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero), используемая в работе, была получена из коллекции ООО «Биолот» (Россия) и проверена на отсутствие микоплазм. Клетки Vero культивировали в течение трёх суток стационарным методом на культуральных флаконах с площадью рабочей поверхности 75 см2 («Orange Scientific», Бельгия) с применением питательной среды Игла МЕМ с 10 % сыворотки КРС (ООО «Биолот», Россия) в CO2 инкубаторе MCO-15AC (Sanyo, Япония). В работе использовали аттенуированный штамм вируса бешенства «Москва 3253 Vero» (получен из НЦЭСМП, Москва, Россия), адаптированный к росту на клеточной культуре Vero [1]. РНП из инфицированной вирусом бешенства клеточной культуры Vero выделяли по модифицированному методу M. Dastkhosh [12]. В основу метода положен принцип извлечения РНП непосредственно из содержимого инфицированной клетки на ранних этапах репродукции вируса. В суспензию клеток Vero вносили вируссодержащую жидкость в дозе 0,1-1,0 ИД50 на клетку. Выращивание вируса бешенства на культуре Vero осуществляли в условиях, аналогичных условиям для культивирования неинфицированной клеточной линии. Культуру клеток собирали и инкубировали в течение 30 мин при 560 C на водяной бане для инактивации вируса бешенства, затем клетки осаждали центрифугированием при ускорении 900 g в течение 10 минут и двукратно промывали 0,9% раствором хлорида натрия. Для осуществления клеточного лизиса полученный осадок суспендировали в ледяной деионизованной воде с 0,2 мМ фенилметилсульфонилфлуорида (AppliChem), инкубировали в холодильнике в ёмкости со льдом в течение 1 ч, после чего клетки и клеточный детрит осаждали на центрифуге Sigma 2К15 (Германия) в течение 20 минут при ускорении 1000 g и температуре 40 С. Процедуру лизиса клеток с последующим центрифугированием проводили двукратно. Полученную надосадочную жидкость, содержащую РНП, собирали и высушивали на лиофильной установке Alpha-I-5 (Германия) в течение 8 часов. Полученный лиофилизат РНП использовали для иммунизации кроликов породы шиншилла обоего пола, массой от 1,5 до 2,5 кг. С целью получения материала для иммунизации РНП вируса бешенства растворяли в деионизованной воде до концентрации 400 мкг/мл, при необходимости добавляли адъювант, а затем внутримышечно вводили подопытным животным на 0, 43 и 57 сут от начала иммунизации. Материал для иммунизации готовили за 1,5-2 ч до введения и хранили при температуре 5-80 C, за 30 мин до введения животным выдерживали при комнатной температуре. В качестве адъювантов использовали полиоксидоний (лиофилизат, ООО «НПО Петровакс Фарм», Россия) и раствор коллоидного золота с размером частиц от 15 до 17 нм, который получали по стандартной методике [14]. Процедуры взятия образцов крови из краевой ушной вены, а также тотального обескровливания экспериментальных животных осуществляли с соблюдением принципов биоэтики [5]. При выполнении тотального обескровливания применяли препараты ксила (Interchemie werken «De Adelaar» B.V. Нидерланды) и золетил (Virbac, Франция). Собранную от различных экспериментальных групп сыворотку крови выдерживали в течение месяца при 4-8 °C, после чего проводили исследование показателя активности сывороток in vitro в дот-иммуноанализе [8]. При хранении в качестве консерванта использовали раствор хинозола в концентрации 0,5 мл на 100 мл сыворотки. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Первым этапом работы явилась задача получения РНП вируса бешенства. Особенностью РНП является сложность его выделения непосредственно из вирусных частиц. Более эффективным подходом является его выделение из цитоплазмы клеток, в которых происходит репродукция вируса бешенства. Выбранный способ получения РНП является простым в исполнении и в наименьшей степени влияет на его структурную целостность, от которой зависят биологические и иммунологические функции указанной субъединицы [12]. Следует отметить, что оптимальное время культивирования используемого в работе штамма вируса бешенства на клетках Vero с целью получения РНП составило (72±4) ч. Изменение сроков выращивания инфицированной вирусом культуры клеток приводило к уменьшению выхода РНП. Выход РНП с монослойной клеточной культуры, содержащей (2,8±0,4)106 клеток, составил 0,18±0,02 мг/мл. Лиофильно высушенный РНП представлял собой белый порошок, хорошо растворимый в воде. Образцы РНП являлись электрофоретически однородными, примеси отсутствовали. Молекулярная масса соответствовала 55 кДа. На следующем этапе работы выполняли иммунизацию кроликов раствором РНП с целью получения антител к нему. Выбор схем иммунизации животных обусловлен опытом отечественных и зарубежных исследователей [6, 11]. С целью повышения активности сывороток к РНП в качестве адъювантов использовали полиоксидоний и наночастицы коллоидного золота. Иммуноадъювантное действие полиоксидония ранее было доказано при его совместном введении с антирабической вакциной, проявляющееся в усилении ее протективных свойств и увеличении выживаемости животных при их инфицировании [2]. Отмечено также усиление антителообразования в ответ на введение кроликам инактивированного аттенуированного вируса бешенства вместе с полиоксидонием [4]. Применение металлов, в том числе золота, в виде наноразмерных частиц в качестве адъювантов противовирусных вакцин также обосновано результатами отечественных и зарубежных исследователей [9, 13]. При этом рекомендуемый средний размер золотых наночастиц составляет 15 либо 50 нм [13]. В настоящей работе использовали раствор коллоидного золота с размером частиц от 15 до 17 нм. Исследование антителообразования проводили на трех группах, каждая из которых включала 3 животных. Первую группу иммунизировали раствором РНП без добавления адъювантов (дозировка — 400 мкг РНП), вторую и третью — с адъювантами: полиоксидоний (дозировка — 1 мг полиоксидония, 400 мкг РНП) и раствор коллоидного золота соответственно (дозировка — 0,5 мл раствора наночастиц коллоидного золота, 400 мкг РНП). Конечный объем материала, вводимого подопытным животным, составлял 1 мл. Для исследования динамики накопления антител в крови экспериментальных животных на 43 и 57 дни эксперимента у животных каждой экспериментальной группы брали образцы крови из краевой вены уха. На 70 день эксперимента осуществляли процедуру тотального обескровливания подопытных животных с применением лекарственных препаратов ксила и золетил. Оба препарата принадлежат к 3 классу опасности по ГОСТ 12.1.007-76. Препарат ксила оказывает миорелаксационный, седативный и аналгезирующий эффект. Данный препарат вводили подопытным животным в концентрации 0,15 мл/кг. Золетил представляет собой комплексный анестетик, оказывает анксиолитическое, седативное действие, расслабление скелетной мускулатуры. Введение препарата подопытным животным осуществляли в концентрации 0,1 мл/кг. Комплекс препаратов ксила и золетил, взятых в соответствии с массой подопытного животного, доводили 0,9% физиологическим раствором до объема 1,5 мл и вводили животным в краевую вену уха. Эффект от введения препаратов наблюдали через 10-20 с после инъекции. Титр антител к РНП в собранных сыворотках устанавливали в дот-иммуноанализе с применением антигенного диагностикума с наночастицами коллоидного золота. При исследовании образцов крови животных из всех экспериментальных групп был подтвержден факт образования антител к РНП. Наибольший титр установлен в группе животных, иммунизированных РНП в сочетании с золотыми наночастицами. К 43 дню исследования титр антител к РНП составлял 1:3200, что превышало значения титра антител в сыворотках, полученных от животных 1 и 2 групп, в 4 и 2 раза соответственно. Аналогичная тенденция сохранялась до конца эксперимента. К 70 дню исследования титр антител в сыворотках, полученных от животных, иммунизированных РНП с наночастицами золота, составил 1:25 600 и являлся наибольшим по сравнению с титрами антител сывороток, полученных от животных остальных экспериментальных групп (рис.).

Титр антител к РНП вируса бешенства в образцах сыворотки крови животных трех экспериментальных групп на 43, 57 и 70 сутки от начала иммунизации. 1 — группа животных, иммунизированных РНП вируса бешенства штамма «Москва 3253Vero»; 2 — группа животных, иммунизированных РНП вируса бешенства штамма «Москва 3253Vero» в комплексе с адъювантом (полиоксидоний); 3 — группа животных, иммунизированных РНП вируса бешенства штамма «Москва 3253Vero» в комплексе с адъювантом (наночастицы коллоидного золота 0,1 моль/л)

Таким образом, в результате исследования предложена эффективная схема получения антител к РНП вируса бешенства, включающая этапы получения антигена, приготовления на его основе препаратов для иммунизации животных-продуцентов с последующим проведением иммунизационных мероприятий и выявления эффективной схемы иммунизации, позволяющей получить наибольший титр антител к РНП в сыворотках крови животных. Особенностью этапа получения антигена является культивирование вируса бешенства на клеточной культуре Vero в течение 72 ч в условиях CO2 инкубатора (37 °С и 5% CO2), непосредственное выделение нативного РНП из инфицированной клеточной культуры и его лиофильное высушивание. В ходе эксперимента было установлено, что наиболее эффективной является схема иммунизации животных РНП в сочетании с наночастицами коллоидного золота размером от 15 до 17 нм. При этом следует отметить и положительный эффект использования в качестве адъюванта полиоксидония на образование антител к РНП. Полученные результаты представляют интерес для дальнейших исследований, связанных с конструированием диагностических препаратов для исследования биологического материала на содержание вируса бешенства и антител к нему.