Research on the antiviral activity of water-soluble melanin from the pharmaceutical chaga mushroom (Inonotus obliquus) against influenza А virus subtypes H5N1, H3N2 and H1N1pdm09 in experiments in vitro

Ekaterina I. Filippova; Филиппова Екатерина Игоревна; Elena V. Makarevich; Макаревич Елена Викторовна; Maria A. Protsenko; Проценко Мария Анатольевна; Oleg Y. Mazurkov; Мазурков Олег Юрьевич; Tamara V. Teplyakova; Теплякова Тамара Владимировна; Natalya A. Mazurkova; Мазуркова Наталья Алексеевна

doi:10.36233/0372-9311-316

Исследование противовирусной активности водорастворимого меланина из аптечной чаги (Inonotus obliquus) в отношении вируса гриппа A субтипов H5N1, H3N2 и H1N1pdm09 в экспериментах in vitro

Авторы: Филиппова Е.И.¹, Макаревич Е.В.¹, Проценко М.А.¹, Мазурков О.Ю.¹, Теплякова Т.В.¹, Мазуркова Н.А.¹
Учреждения:
1. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Выпуск: Том 100, № 1 (2023)
Страницы: 103-109
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 13.02.2023
Дата принятия к публикации: 13.02.2023
Дата публикации: 03.04.2023
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/4639
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-316
ID: 4639

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Актуальность. Вирус гриппа А является причиной возникновения эпидемий и пандемий, наносящих колоссальный вред здоровью и социально-экономическому положению населения. В связи с необходимостью разработки новых методов этиотропной терапии, а также с возрастающей способностью вирусов противодействовать применяемым препаратам поиск новых фармакологически активных веществ и последующее изучение их лекарственных свойств обладает неоспоримой актуальностью.

Цель — изучение противовирусных свойств меланина, полученного из аптечной чаги (Inonotus obliquus), в отношении разных субтипов вируса гриппа.

Материалы и методы. Образец водорастворимого меланина Inonotus obliquus, полученный методом щелочного гидролиза и высушенный при 40°С, был исследован на токсичность и противовирусную активность. В качестве референс-препарата использован коммерческий противогриппозный препарат Тамифлю^®. Статистическая обработка полученных данных проведена по методу Спирмена–Кербера.

Результаты. Для культуры клеток MDCK были установлены маркеры токсичности меланина из чаги (образец 20-24), такие как максимально переносимая концентрация, составляющая 237 мкг/мл, а также 50% цитотоксическая концентрация (ЦТД₅₀), равная 153,45 мкг/мл. Под действием исследуемого образца в отношении субтипов вируса гриппа А H5N1, H3N2 и H1N1pdm09 обнаружено снижение инфекционности вируса гриппа на 2,5–3,5 lg, а также установлены 50% эффективные дозы (ЭД₅₀), составляющие 1,55–9,52 мкг/мл. На основании полученных значений ЦТД₅₀ и ЭД₅₀ были рассчитаны химиотерапевтические индексы образца, характеризующие его перспективность для дальнейших исследований.

Заключение. Меланин, полученный из аптечной чаги, проявил наибольшую активность против штамма пандемического вируса гриппа человека A/California/04/2009 (H1N1)pdm09, вызывал снижение его инфекционности на 3,5 lg и обладал ЭД₅₀, равной 1,6 мкг/мл. Полученные результаты указывают на перспективность создания противовирусного препарата на основе меланинов из чаги в отношении вируса гриппа.

Ключевые слова

меланин, агарикомицеты, противовирусное средство, вирус гриппа А

Полный текст

Введение

Широкое разнообразие зоонозных вирусов, способных преодолевать межвидовой барьер, ведёт к появлению в человеческой популяции новых, потенциально пандемических вирусов. За последние 10 лет человечество столкнулось с двумя пандемиями: гриппа свиного происхождения А/H1N1pdm09 в 2009 г. и COVID-19 в 2019 г. Совместно с вирусами, имеющими пандемическое значение, циркулирует множество сезонных респираторных вирусов, которые вносят свой вклад в структуру заболеваемости людей, а сочетанные инфекции отягчают состояние заболевших [1].

Вирус гриппа характеризуется активной сезонной циркуляцией, затрагивающей большую часть населения Земли (до 1 млрд случаев гриппа ежегодно), группы риска — дети раннего возраста, пожилые люди, лица с сопутствующими хроническими заболеваниями и ослабленным иммунитетом [2]. Высокий уровень генетической изменчивости вирусов гриппа обусловливает отсутствие 100% эффективной вакцины, а также возникновение резистентности штаммов вируса к имеющимся противовирусным препаратам [3].

В настоящее время в мире активно проводятся поиск и разработка противовирусных препаратов на основе соединений природного происхождения, обладающих более мягким терапевтическим действием и низкой токсичностью по сравнению с синтетическими лекарственными средствами. В этом отношении базидиальные грибы представляют значительный интерес как источники лечебных и профилактических средств с противоопухолевой, иммуностимулирующей и противовирусной активностью.

С 2008 г. в ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» проводятся изучение противовирусной активности плодовых тел грибов Юго-Западной Сибири и выделение их в чистую культуру. На основе скрининга полисахаридов и меланина из грибов, самый широкий спектр противовирусной активности обнаружен у чаги (Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pilát; трутовик скошенный) [4, 5].

Известна высокая протективная активность образцов меланинов из чаги in vitro в отношении вируса гриппа субтипа H1N1pdm09, вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2), вируса Западного Нила, вируса натуральной оспы и вируса осповакцины [6].

Показана высокая противовирусная активность в отношении SARS-CoV-2 водных экстрактов чаги, содержащих меланин и гуминовые вещества. Данные экстракты обладали низкой токсичностью, 50% эффективной дозой (ЭД₅₀) 0,75 мкг/мл, высоким химиотерапевтическим индексом (ХТИ) — 155,5 [7].

Водные экстракты, полученные из склероция чаги, ингибировали инфекционность штаммов вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Moscow/226/2009(H1N1)pdm09 с индексами нейтрализации 4,7 и 3,2 lg соответственно. Противогриппозное действие данных образцов было сопоставимо с активностью препарата Тамифлю^® [6].

Целью настоящего исследования является изучение противогриппозных свойств меланина, полученного из аптечной чаги. Задачи исследования: получение водорастворимого меланина, определение токсичности полученного образца, тестирование способности меланина подавлять инфекционность вируса гриппа, определение 50% токсических и 50% ингибирующих вирус гриппа концентраций образцов.

Материалы и методы

Культура клеток

Для определения токсичности и противовирусной активности грибных меланинов использовали перевиваемую линию клеток MDCK, полученную из коллекции культур клеток ГНЦ ВБ «Вектор». Клетки выращивали в среде DMEM (ООО «Биолот») в присутствии 10% инактивированной сыворотки крови плодов коровы (ООО «Биолот») и антибиотиков (пенициллин 100 МЕ/мл, стрептомицин 100 мкг/мл). Клеточную суспензию вносили в 96-луночные планшеты по 100 мкл в лунку в концентрации 1,0–1,5 × 10⁵ клеток/мл. Планшеты с клетками помещали в термостат при 37ºC, 5% СО₂ и 100% влажности на 2–3 сут до образования клеточного монослоя.

Вирусы

В работе использовали штаммы вируса гриппа А: штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) с инфекционным титром 7,25 ± 0,49 lg ТЦД₅₀/мл; штамм адаптированного к лабораторным мышам вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) с инфекционным титром 4,50 ± 0,69 lg ТЦД₅₀/мл; штамм пандемического вируса гриппа человека A/California/04/2009 (H1N1)pdm09 с инфекционным титром 5,00 ± 0,57 lg ТЦД₅₀/мл. Все используемые штаммы получены из Государственной коллекции микроорганизмов ГНЦ ВБ «Вектор».

Концентрацию вируса каждого субтипа определяли путём титрования в культуре клеток MDCK при культивировании в течение 3 сут в термостате при 37ºC, 5% СО₂ и 100% влажности. Титры вируса рассчитывали по методу Спирмена–Кербера, выражали в десятичных логарифмах 50% тканевых цитопатических доз в 1 мл (lg ТЦД₅₀/мл) и представляли в виде М ± I₉₅ для (где M — среднее значение, I₉₅ — 95% доверительный интервал) и сравнивали по методу Спирмена–Кербера с помощью пакета компьютерных программ «Statistica 6.0» [8, 9].

Исследуемые образцы

Для получения водорастворимого меланина из аптечной чаги (образец 20-24) к 5 г сухого измельчённого (до 1 мм) природного сырья чаги добавляли 100 мл 2% NaOH и выдерживали в автоклаве 30 мин при избыточном давлении 0,7 атм. Далее полученный раствор фильтровали через капроновый и бумажный фильтры. Меланин осаждали концентрированной соляной кислотой и центрифугировали (центрифуга «Centra CL3») 20 мин при 4000 об/мин. Далее проводили 3-кратное переосаждение 1Н соляной кислотой и трижды промывали осадок дистиллированной водой (1 : 10). Полученный препарат не растворяется в воде, но хорошо растворяется в щелочах. Водорастворимую форму меланина получали путём растворения полученного пигмента в 10% водном растворе аммиака (значение рН от 7 до 8) с последующим мягким выпариванием остаточного аммиака и воды до сухого состояния при температуре воздушного потока 30°С. Полученный препарат полностью растворим в воде. Для проведения экспериментов по изучению токсичности и противовирусной активности сухой меланин был растворён в дистиллированной воде до концентрации 2 мг/мл.

В качестве референс-препарата использовали Тамифлю^® («Hoffmann-La Roche Ltd.»).

Определение максимально переносимых концентраций образцов и изучение их способности подавлять инфекционность вируса гриппа in vitro

При определении токсических концентраций меланина из чаги исходную концентрацию образца (800 мкг/мл) разводили в 1,5; 2,3; 3,4; 5,0; 7,6; 11,4; 17,1; 25,6; 38,5; 57,5; 86,5; 129,7 раза (с шагом 1,5) средой DMEM, вносили по 100 мкл разведений меланина в лунки 96-луночного планшета с клеточным монослоем (по 4 лунки на каждое разведение образца) и убирали в термостат на 2 сут при 37ºC, 5% СО₂ и 100% влажности. Спустя 2 сут с помощью инвертированного микроскопа производили оценку деструктивных изменений монослоя клеток MDCK, инкубированных с различными концентрациями исследуемого образца. Параллельно, в качестве клеточного контроля, использовали монослой культуры MDCK без внесения препарата. За максимально переносимую концентрацию (МПК) принимали ту концентрацию, при которой не было выявлено цитотоксического эффекта.

Исследование способности грибного меланина 20-24 влиять на инфекционную активность (титр) вируса гриппа А в монослое клеток было проведено при использовании МПК для данной клеточной культуры. Препарат сравнения Тамифлю^® был использован в концентрации 100 мкг/мл. В лунки 96-луночных планшетов с клеточным монослоем за 1 ч до заражения вносили по 100 мкл образца, разведённого до необходимой концентрации средой DMEM, содержащей 2 мкг/мл трипсина TPCK («Sigma»). Инфицирование монослоя клеток осуществляли десятикратными разведениями вируса гриппа, приготовленными на этой же среде, в объёме 100 мкл/лунку (по 4 лунки на каждое разведение вируса). Клетки инкубировали 2 сут при 37ºC, 5% СО₂ и 100% влажности. Далее определяли наличие вируса гриппа в культивируемой среде по реакции гемагглютинации с 1% суспензией куриных эритроцитов. Титр вируса гриппа в опыте (с исследуемым образцом), а также в соответствующем контроле (без образца) определяли в lg ТЦД₅₀/мл и рассчитывали индекс нейтрализации (ИН), составляющий разницу между титрами вируса в контроле и опыте (lg) [10]. В соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [10] вещество обладает высокой активностью, если подавляет инфекционность вируса в 100 и более раз (ИН ≥ 2,0 lg).

Определение 50% цитотоксических и 50% ингибирующих вирус гриппа концентраций образцов in vitro

Изучали изменение оптической плотности (ОП) раствора красителя, поглощённого живыми клетками в монослое культуры клеток MDCK, определяли 50% цитотоксические (ЦТД₅₀) и 50% вирусингибирующие (ЭД₅₀) концентрации препаратов колориметрическим методом [11]. В эксперименте использовали ряд 12-кратных и последовательных 2-кратных разведений водного раствора меланина из чаги: в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2051, 4000 раз средой DMEM (диапазон исследуемых концентраций составлял 0,38–800 мкг/мл). Препарат сравнения Тамифлю^® разводили 8 раз с шагом 3 средой DMEM (диапазон исследуемых концентраций составлял 0,046–100,0 мкг/мл).

Для определения ЦТД₅₀ ряд полученных разведений вносили на монослой клеток в объёме 100 мкл/лунку 96-луночного планшета и ставили в термостат при 37ºC, 5% СО₂ и 100% влажности на 3 сут. В качестве клеточного контроля использовали интактный монослой (без внесения исследуемого образца).

Для определения ЭД₅₀в отношении 3 штаммов вируса гриппа А в лунки 96-луночных планшетов с монослоем клеток вносили ряд разведений образцов в объёме 100 мкл/лунку, через 2 ч инкубирования при 37ºC, 5% СО₂ и 100% влажности препарат удаляли из лунок и вносили по 100 мкл разведения вируса с множественностью инфицирования 0,1 ТЦД₅₀/клетку. Спустя 1 ч адсорбции вируса на клетках удаляли вируссодержащую жидкость и снова вносили исследуемые образцы на монослой. В качестве контроля вируса использовали инфицированный монослой клеток (без внесения препарата). Планшеты помещали в термостат при 37ºC, 5% СО₂ и 100% влажности на 3 сут.

После инкубирования в лунки планшета, содержащие культуральную среду, вносили витальный (прижизненный) краситель нейтральный красный (50 мкл/лунку) и инкубировали 2 ч при 37ºC. Далее клетки промывали двукратно физиологическим раствором в объёме 400 мкл/лунку, вносили лизирующий буфер (смесь равных частей 96% этилового спирта и 0,01 М раствора моноаммонийфосфата, pH 3,5) и через 30 мин определяли ОП. Величину ОП измеряли с помощью многофункционального спектрофотометра «xMark Microplate Absorbance Reader» при длине волны 540 нм, которая является показателем количества жизнеспособных клеток в монослое, сохранившихся при цитопатическом действии вируса или токсическом действии исследуемого образца. Затем при помощи компьютерной программы «SoftMaxPro 4.0» результаты ОП представляли в полулогарифмической системе координат. На основании полученных данных рассчитывали ЦТД₅₀ и ЭД₅₀ для исследуемых препаратов. ЦТД₅₀ — величина концентрации определённого образца препарата в лунке планшета, под воздействием которого разрушается 50% клеточного монослоя, ЭД₅₀ — величина концентрации определённого образца препарата в лунке планшета, под воздействием которого сохраняется 50% жизнеспособного клеточного монослоя. Полученные данные дают возможность рассчитать химиотерапевтический индекс (ХТИ) препарата по формуле: ХТИ = ЦТД₅₀/ЭД₅₀. Активными считаются соединения с ХТИ ≥ 8 [10].

Результаты

При визуальном изучении цитотоксичности водного раствора меланина из чаги установлено, что МПК данного препарата, не оказывающая на клетки токсического действия, составила 237,0 мкг/мл. Результаты определения противовирусной активности экспериментального образца 20-24, снижающего инфекционность (титры) 3 штаммов вируса гриппа в культуре клеток MDCK, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Снижение инфекционности вируса гриппа А в культуре клеток MDCK под действием водорастворимого меланина из чаги и референс-препарата Тамифлю^®

Table 1. Reduction of the influenza А virus infectivity under the influence of water-soluble melanin 20-24 obtained from Inonotus obliquus and reference drug Tamiflu^®

Штамм вируса гриппа Influenza virus strain	Опыт/контроль Experiment/control	Титр вируса гриппа, lg ТЦД₅₀/мл Virus titer, lg TCID₅₀/mL (М ± I₉₅; n = 4)	ИН, lg Neutralization index (IN), lg
A/California/04/2009 (H1N1)pdm09	Образец 20-24 Sample 20-24	1,50 ± 0,00*	3,50
	Тамифлю^® Tamiflu^®	2,25 ± 0,49	2,75
	Контроль вируса Virus control	5,00 ± 0,57	–
A/Aichi/2/68 (H3N2)	Образец 20-24 Sample 20-24	1,50 ± 0,00*	3,00
	Тамифлю^® Tamiflu^®	0,50 ± 0,00*	4,00
	Контроль вируса Virus control	4,50 ± 0,69	–
A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)	Образец 20-24 Sample 20-24	4,75 ± 0,49*	2,50
	Тамифлю^® Tamiflu^®	5,00 ± 0,57*	2,25
	Контроль вируса Virus control	7,25 ± 0,49	–

Примечание. n — число лунок с монослоем клеток, инфицированных разными разведениями вируса. *p ≤ 0,05 по сравнению с контролем (без образца) по методу Спирмена–Кербера.

Notes. TCID₅₀ — 50% tissue culture infectious doses; M (mean) and SD (standard deviation) for 95% confidence interval calculated by the Spearman–Kerber method; n means the number of wells with the cell monolayer infected with viruses in different concentrations. *p ≤ 0.05 compared to the control (sample-free) by the Spearman–Kerber method.

Под действием исследуемого образца чаги наблюдалось снижение титра вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)pdm09 в 3162 раза, титра вируса A/Aichi/2/68 (H3N2) — в 1000 раз, титра вируса A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) — в 316 раз относительно соответствующих контролей (без образца). ИН составляли 2,5–3,5 lg.

Определены ЦТД₅₀ и ЭД₅₀ для образца 20-24 и Тамифлю^® в отношении 3 штаммов вируса гриппа А и рассчитаны соответствующие значения ХТИ (табл. 2). ЭД₅₀ образца 20-24 для 3 субтипов вируса гриппа находились в пределах от 1,6 до 9,5 мкг/мл. В отношении пандемического вируса гриппа А/H1N1pdm09 исследуемый образец оказался наиболее активным, т.к. проявил 50% вирусингибирующую активность при наименьшей концентрации (ЭД₅₀ = 1,6 мкг/мл).

Таблица 2. Противовирусная активность водорастворимого меланина 20-24 из чаги и референс-препарата Тамифлю^® в отношении вируса гриппа А в культуре клеток MDCK

Table 2. Antiviral activity of water-soluble melanin 20-24 obtained from Inonotus obliquus and reference drug Tamiflu^® against influenza A virus in MDCK cell culture

Штамм вируса гриппа Influenza virus strain	Опыт/контроль Experiment/control	ЦТД₅₀, мкг/мл CC₅₀, µg/mL	ЭД₅₀, мкг/мл IC₅₀, µg/mL	ХТИ SI
A/California/04/ 2009 (H1N1)pdm09	Образец 20-24 \| Sample 20-24	153,45	1,55	99,00
A/California/04/ 2009 (H1N1)pdm09	Тамифлю^® \| Tamiflu^®	> 100,00	0,94	> 106,38
A/Aichi/2/68 (H3N2)	Образец 20-24 \| Sample 20-24	153,45	5,70	26,92
A/Aichi/2/68 (H3N2)	Тамифлю^® \| Tamiflu^®	> 100,00	0,06	> 1666,67
A/chicken/Kurgan/ 05/2005 (H5N1)	Образец 20-24 \| Sample 20-24	153,45	9,52	16,07
A/chicken/Kurgan/ 05/2005 (H5N1)	Тамифлю^® \| Tamiflu^®	> 100,00	0,02	> 5000,00

Note. CC₅₀ — 50% cytotoxic concentration; IC₅₀ — 50% inhibitory (effective) concentration; SI — selectivity index.

Обсуждение

Проведённые исследования показали, что образец меланина 20-24, полученный из чаги, обладает противовирусным действием в системе in vitro в отношении исследуемых штаммов вируса гриппа: A/California/04/2009 (H1N1)pdm09, A/Aichi/2/68 (H3N2) и A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1). В исследовании по изучению снижения инфекционности под действием меланина из чаги для 3 субтипов вируса гриппа А выявлены статистические отличия от соответствующих контролей вируса (без внесения образца), установленные по методу Спирмена–Кербера (табл. 1). В данном эксперименте обнаружено, что противовирусное действие образца 20-24 в отношении всех исследуемых штаммов вируса гриппа было сопоставимо с действием Тамифлю^®. Разница индексов нейтрализации между референс-препаратом и тестируемым образцом не превышала 1,0 lg.

При сравнении значений ХТИ для меланина, полученного из чаги, в отношении 3 штаммов вируса гриппа установлено, что самое высокое значение данного показателя, составляющее 99,0 (сопоставимое со значением ХТИ Тамифлю^®), было обнаружено для вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)pdm09. Т.В. Тепляковой и соавт. установлено высокое значение ХТИ меланинов, выделенных из культуральной жидкости и биомассы культивируемого мицелия чаги (штамм F-1244), которое достигало 160 в отношении этого же штамма вируса гриппа [6, 12]. В отношении вируса гриппа А субтипов H3N2 и H5N1 нами были получены значения ЭД₅₀ 5,7 и 9,52 мкг/мл, а ХТИ — 26,92 и 16,07 соответственно.

Таким образом, меланин из чаги 20-24 проявил высокую активность в отношении вируса гриппа А разных субтипов (H1N1pdm09, H3N2, H5N1). При этом наибольшую активность образец меланина оказал против пандемического вируса гриппа А/H1N1pdm09 (снижал его инфекционность на 3,5 lg и обладал ЭД₅₀ 1,6 мкг/мл) [6].

Полученные результаты указывают на перспективность создания противогриппозного препарата на основе меланина Inonotus obliquus широкого спектра, снижающего вирусную нагрузку.