STUDY OF THE MASS-SPECTORS’ FEATURES OF SPORES AND VEGETATIVE FORMS OF BACILLUS ANTHRACIS BY THE METHOD OF TIME OF FLIGHT MASS-SPECTROMETRY

Full Text

ВВЕДЕНИЕСибирская язва представляет проблему общественного здравоохранения и ветери-нарии в силу малой предсказуемости нередких эпизоотических проявлений, часто со-провождающихся заболеваемостью людей.Возбудитель инфекции — Bacillus anthracis принадлежит к числу агентов биологического оружия и терроризма, высокий поражающий потенциал которого хорошо известен [7, 9]. Поэтому быстрая и точная индика-ция и идентификация возбудителя сибирской язвы важна и требует совершенствова-ния методов лабораторного исследования. Молекулярные методы с использованием специфичных генетических маркеров для идентификации микроорганизмов получили широкое распространение, с ними конкурирует по быстроте и чувствительности масс-спектрометрический анализ биополимеров, в частности, белков с помощью времяп-ролетной масс-спектрометрии с лазерно-активируемой матричной десорбцией-иони-зацией (MALDI-TOF MS). В настоящее время разработаны приборы, программное обеспечение и базы данных масс-спектров, позволяющие за короткое время с высокой точностью идентифицировать возбудители многих бактериальных инфекций, однако их использование для идентификации особо опасных патогенов затруднено отсутстви-ем в открытом доступе баз данных масс-спектров этих микробов. Другим ограниче-нием этого подхода является необходимость получения чистой вегетативной культуры возбудителя, что требует от одних до нескольких суток в зависимости от вида микроба. В клиническом материале возбудитель сибирской язвы, как правило, присутствует в форме вегетативных клеток, в материале из объектов окружающей среды, например, в почве — в споровой форме. Поскольку в разных фазах роста экспрессируются раз-ные белки, качественные и количественные характеристики масс-спектров в боль-шой степени зависят от того, в какой форме исследуется возбудитель. Тем не менее, по литературным данным, примерно в 50% препаратов вегетативных клеток бацилл группы Bacillus cereus, в которую входит B. anthracis, обнаруживаются интенсивные пики с массой, соответствующей малым кислоторастворимым белкам спор (SASP), среди которых пик с m/z 6679 специфичен для возбудителя сибирской язвы [2, 8]. По данным ряда авторов специфичные для B. anthracis пики в спектрах споровых препа-ратов отличаются [3, 4, 6]. Различия могут быть связаны с существованием атипичных штаммов, отличающихся по ряду фенотипических и генетических свойств, к которым можно отнести аттенуированные вакцинные штаммы [1].Оценка масс-спектров с целью идентификации бактерий и грибов методом MALDI-TOF MS проводится с использованием коммерческих платформ BioTyper (Bruker Daltonics), SARAMIS Vitek-MS (Biomerieux) и Andromas (Andromas SAS). Кроме отсутствия в этих базах данных спектров возбудителей особо опасных инфекций (ООИ), еще одним недостатком этого подхода является недостаточная точность дифференциа-ции близкородственных микроорганизмов [11]. Поэтому предпринимаются усилия, на-правленные на создание дополнительной библиотеки спектров на основе более совер-шенного статистического анализа c целью достижения однозначной дискриминации B. anthracis от близкородственных бацилл [10]. Описан и другой, достаточно сложный, подход для идентификации возбудителя сибирской язвы методом MALDI-TOF MS, не связанный с применением коммерческих информационных платформ, в котором ана-лиз базы данных проводили на основе модели искусственных нейронных сетей [8].Таким образом, существует потребность в разработке и применении для иден-тификации B. anthracis доступного и эффективного информационного алгоритма обработки данных MALDI-TOF MS. В связи c неоднозначностью сведений о ха-рактеристиках масс-спектров вегетативных и споровых клеток сибиреязвенного микроба представляется также актуальным сравнение таковых у набора типичных и атипичных штаммов.Цель работы — выявление особенностей белковых профилей споровой и веге-тативной форм сибиреязвенного микроба методом MALDI-TOF MS с использова-нием ресурсов программы Mass-Up и комплекса пакетов для статистического про-граммного обеспечения с открытым исходным кодом R.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫВ качестве объекта исследования использовали споровую и вегетативную фор-мы 32 штаммов B. anthracis из коллекции микроорганизмов Ставропольского про-тивочумного института Роспотребнадзора, в том числе 8 штаммов, выделенных при вспышке сибирской язвы на Ямале в 2016 году (табл.).
Питательные среды, реактивы: сверхчистая вода для масс-спектрометрии — хроматографии (Fluka, Германия), ацетонитрил, степень чистоты «для ВЭЖХ-МС» (Sigma-Aldrich, США), трифторуксусная кислота, > 99 % (Sigma-Aldrich, США), α-циано-4-гидроксикоричная кислота, степень чистоты «для MALDI-МS» (Bruker Daltonics, Германия), Brain Heart Infusion Agar (BHIA) (Becton Dickinson, США), агар порошок микробиологический, бактериальный тест-стандарт MBT для внутренней калибровки масс-спектрометра (Bruker Daltonics, Германия).Вся работа с исследуемым материалом, подозрительным на зараженность микро-организмами I-II групп патогенности, проводилась в соответствии с СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».Для исследования методом MALDI-TOF MS использовали 18 — 24 ч культуры B. anthracis, выращенные из отдельной колонии на пластинках BHIGA при 37 оС. Для исследования спор B. anthracis использовали отмытые в дистиллированной воде взвеси, полученные после 7-10 суток культивирования возбудителя на агаре Гладстона-Филдса. Суспендировали 1 микробиологическую петлю (No 1) чистой вегетативной культуры в 300 — 500 мкл дистиллированной воды. При обеззаражи-вании культур возбудителя сибирской язвы 20 мкл полученной взвеси вегетативной культуры или взвеси отмытых спор суспендировали в 80 мкл ТФК, выдерживая при комнатной температуре в течение 5 минут, затем центрифугировали в течение30 мин при 13000 об/мин. Полученный супернатант переносили в ультрамикроцент-рифужный PVDF фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, центрифугировали в микроцен-трифуге при 13000 об./мин в течение 20 мин.Фильтрат из нижней части центрифужного ультрафильтра переносили в микро-пробирку типа Эппендорф и использовали для исследования. Верхнюю и нижнюю составляющие части центрифужного ультрафильтра помещали в дезраствор в соот-ветствии с СП 1.3.3118-13. С полученным фильтратом работали как с обеззаражен-ным материалом.Обеззараженный образец в количестве 1 мкл помещали на пластину-мишень MS 96 spot Micro SCOUT Plate (Bruker Daltonics, Германия) и высушивали на воз-духе. Затем на высушенный образец наносили 1 мкл матрицы, состоящей из α-ци-ано-4-гидроксикоричной кислоты в растворе, содержащем 500 мкл ацетонитрила,475 мкл ультрачистой воды и 25 мкл трифторуксусной кислоты, и сушили на возду-хе. Таким образом, достигалась гомогенность полученных образцов, что обеспечило высокую воспроизводимость (> 95%) при получении масс-спектров в автоматичес-ком режиме.Масс-спектры получали в линейном режиме на MALDI-TOF масс-спектромет-ре Microflex (Bruker Daltonics, Германия) при следующих параметрах: частота лазе-ра 60 Гц, интенсивность лазера 10—50%, время задержки экстракции 110 нс PIE, напряжение первого источника ионов 19,4 kV, второго — 17,3 kV, напряжение фо-кусирующей линзы 8 kV, напряжение линейного детектора 2,500 kV, диапазон масс 2000—20000 Da. Внутреннюю калибровку ранее указанного диапазона проводили с использованием точных значений масс бактериального тест-стандарта MBT (Bruker Daltonics, Германия). Каждый масс-спектр генерировали из 500 лазерных выстрелов (10×50 лазерных выстрелов с разных позиций каждой капли мишени). Для управле-ния масс-спектрометром, включая установку режимов работы и регистрации масс-спектров, использовали программный пакет flexControl v.3.3.64 (Bruker Daltonics, Германия), для предварительной оценки интенсивности и разрешения пиков в спектре — flexAnalysis v 3.3.65. Формирование промежуточных таблиц проводили с использованием программных ресурсов пакета Microsoft Office 2010. Визуализацию и анализ полученных масс-спектров осуществляли с применением прикладных па-кетов в статистическом программном обеспечении R (https://cran.r-project.org/) и Mass-Up (http://sing.ei.uvigo.es).В качестве маркеров использовали сигналы, p-value которых было <0,05 (Randomization Test of Independence) на основании 10 000 повторений. Различия между выборками считали достоверными при p<0,05. Разделительную способность модели оценивали перекрестной валидацией.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕВ ходе настоящего исследования были получены и исследованы масс-спектры 32 штаммов B. anthracis.Необработанные масс-спектры для каждого анализируемого бактериального образца в формате исходного расширения преобразовывали, используя пакет для анализа данных спектрометрии MALDIquant, реализованный в среде R, представ-ляющий альтернативу для интерпретации данных MALDI-TOF MS [5]. По ито-гам преобразований была построена бинарная матрица, учитывающая значение m/Z и интенсивность для каждого сигнала, на основании которой была проведенаиерархическая кластеризация штаммов сибиреязвенного микроба для двух форм. Используемое ПО позволяет обнаруживать потенциальные биомаркеры, разрабаты-вать модели для автоматической классификации исследуемых культур на основании выявления различий в соответствующих спектрах.Предварительная обработка масс-спектров заключалась в преобразовании интенсивности a.i. (square root method), сглаживании (метод Savitzky-Golay), кор-рекции базовой линии (метод SNIP), нормализации интенсивности пика (total ion current, TIC), при отношении сигнал-шум равное 3. Выравнивание значений m/Z сигналов проводили на основании пяти реплик каждого образца (intra-sample). В качестве дополнительного этапа фильтрации значимых сигналов от ложных все реп-лики каждого образца были слиты в единый «суммарный» спектр. Таким образом, из 320 спектров было получено по 32 преобразованных спектра, по одному на каждый образец для споровой, а также для вегетативной формы соответственно.Воспроизводимость масс-профилей отдельных образцов культур B. anthracis была подтверждена серией повторных измерений. При проведении масс-спектро-метрического анализа проб, хранившихся до 3 сут при температуре минут 18 °С, из-менений основных характеристик сигналов масс-спектров не выявлено.В данном исследовании мы экспериментально подтвердили предположение о том, что белковые профили экстрактов культур сибиреязвенного микроба споровой и вегетативной формы существенно отличаются, и это различие можно использо-вать для поиска потенциальных маркеров каждой из форм.Визуализация данных, основанная на использовании метода главных компонент (PCA, principal component analysis) (рис. 1) позволяет группировать анализируемые нами объекты с учетом следующих исходных признаков: отсутствие/присутствие, m/Z и интенсивность сигнала (3-мерное пространство первых трёх главных компо-нент). Этот метод является одновременно методом понижения размерности (коли-чества измерений) данных. Построенные плоскости проектирования — трехмерный экран нами были расположены таким образом, чтобы обеспечить картину данных с наименьшими искажениями.В результате применения метода главных компонент к данным MALDI-TOF MS была сформирована таблица, где каждый штамм возбудителя был охарактеризо-ван по трем важным признакам, называемых главными компонентами. Полученная таблица преобразована в график, на котором каждый штамм B. anthracis представ-лен точкой, а вегетативная форма возбудителя (характеризующаяся близкими зна-чениями главных компонент) расположена относительно споровой компактно и дискретно.Использование 3D-моделирова-ния средствами PCA для пространс-твенной визуализации представите-лей B. anthracis на основании сходс-тва/различия их белковых профилей имеет важное преимущество — рас-пределение изучаемых объектов в трехмерном пространстве с возмож-ностью динамического изменения угла обзора. В построенной системе координат между представителями штаммов возбудителя в вегетативной форме почти отсутствует дистанция, что привело к их объединению в «об-лако», напротив, для представителей споровой формы можно отметить рассредоточенность в пространстве. Полученное распределение в полной мере согласуется с результатом ана-лиза с использованием интегриро-ванных инструментов программногопакета MALDI Biotyper и обусловлено, главным образом, существенно более высо-ким уровнем представительности и вариабельности белковых профилей кислотных экстрактов споровых форм B. anthracisпо сравнению с вегетативными.В ходе анализа полученных результатов было показано, что к общим фрагмен-там для вегетативной и споровой формы можно отнести 6 пиков (m/Z ± 5 Da): 2229, 2285, 3348, 3590, 4033, 6444. Для вегетативной формы сибиреязвенного микроба бы-ли определены следующие сигналы (m/Z ± 5 Da): 2011, 2482, 2600, 2728, 2859, 3149, 3188, 3263, 3320, 3433, 3557, 3652, 3691, 3901, 4210, 4623, 4759, 4829, 4884, 5204, 5460, 5634, 6278, 6378, 6524, 6869, 7116, 7384, 7802, 8088, 9227, 9659, 9755. В качестве ана-литически значимых сигналов споровой формы B. anthracis выступали следующие фрагменты (m/Z ± 5 Da): 2024, 2131, 2354, 2503 [6], 2528 [4], 3116, 3376, 3679, 4055, 4086, 4397, 4791, 6698 [6], 6726, 6897, 7479, 9829.Максимальное количество пиков отмечено при масс-спектрометрии вегетатив-ных клеток — всего 39, из них характерных только для этой формы B. anthracis было 33. Анализ масс-спектров экстрактов спор позволил обнаружить 23 пика, из кото-рых спороспецифичных было 17. Общие для вегетативной и споровой формы пики составляли небольшую долю: 6 от общего количества — 56 пиков.По результатам масс-спектрометрии вегетативных и споровых форм штаммов возбудителя сибирской язвы проведен кластерный анализ (рис.2). В дендрограммах отчетливо видно разделение всех штаммов на две главные группы — A и B. Группу Рис. 2. Кластерный анализ результатов масс-спектрометрии вегетативных и споровых форм Bacillus anthracis. I — вегетативная форма, II — споровая форма.
72B составляют выделенные от людей, оленей и из материала из окружающей среды в 2016 году на Ямале штаммы. Независимо от формы, это разделение соответствует наблюдаемому при филогенетическом анализе на основании SNP и MLVA геноти-пирования выделенных на территории Российской Федерации штаммов B. anthracis. Кроме того, примечательно выделение всех вакцинных штаммов в отдельную под-группу A1 в составе главной группы A.Таким образом, успешно применен новый биоинформационно-статистический подход для анализа MALDI-TOF масс-спектров возбудителя сибирской язвы, ко-торый позволил дифференцировать споровую и вегетативную формы микроба на основании выявления соответствующих групп биомаркеров. Кроме того, он обеспе-чивает достаточную внутривидовую дискриминирующую способность, подтвержда-емую кластеризацией штаммов, соответствующей достигаемой при филогенетичес-кой оценке родства на основе генетического типирования.

About the authors

D. V. Ulshina

Stavropol Research Institute for Plague Control

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

E. I. Eremenko

Stavropol Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

D. A. Kovalev

Stavropol Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

A. G. Ryazanova

Stavropol Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

I. V. Kuznetsova

Stavropol Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

L. Yu. Aksenova

Stavropol Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

O. V. Semenova

Stavropol Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

O. V. Bobrysheva

Stavropol Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

Yu. V. Siritsa

Stavropol Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

A. N. Kulichenko

Stavropol Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

References

Supplementary files