Manufacturing of hybridomas, producing monoclonal antibodies against Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei antigens

Full Text

Среди представителей рода Burkholderia особое место занимают B. mallei и B.
pseudomallei, относящиеся к микроорганизмам второй группы патогенности. В
национальных системах классификации особо опасных бактериальных патогенов
России, Великобритании, США и Канады возбудители сапа и мелиоидоза входят
в ведущие группы по степени опасности для человека [2]. В настоящее время заболевания, вызываемые B. mallei и B. pseudomallei, продолжают регистрировать в
Турции, Иране, Объединенных Арабских Эмиратах, Афганистане, Индии, Китае,
Монголии, на Филиппинах, а также в странах Африки и Латинской Америки [4].
Заболеваемость сапом и мелиоидозом среди людей носит, в основном, спорадический характер [2]. Актуальность создания эффективных средств диагностики сапа и
мелиоидоза определяется реальной угрозой их заноса на территорию России из эндемичных стран в связи со значительным ростом транспортных связей, возросшими
объемами грузоперевозок и пассажиропотоков, увеличением числа туристических
поездок российских граждан в эндемичные регионы, привлечением иностранной
рабочей силы и незаконной миграцией населения.
На сегодняшний день существующие методы обнаружения патогенных буркхольдерий оказываются недостаточно эффективными для экспресс-диагностики, а
идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза по-прежнему является трудоемкой
задачей. Традиционная лабораторная диагностика, направленная на выделение чистой культуры возбудителя с последующей ее идентификацией, позволяет дать положительный ответ лишь через 36-48 часов. Классические серологические методики
дают более быстрые результаты, но обладают относительно низкой чувствительностью и недостаточной специфичностью из-за возможных перекрестных реакций
с гетерологичными видами и антигенной вариабельности штаммов гомологичных
микроорганизмов. В настоящее время для детекции различных патогенов все более активно используют полимеразную цепную реакцию. Однако опыт зарубежных
исследователей свидетельствует, что молекулярно-биологические методы обнаружения патогенных буркхольдерий целесообразно включать в качестве подтверждающих тестов в схему лабораторной диагностики [5]. Многолетний опыт лабораторной диагностики различных инфекционных заболеваний свидетельствует о том, что иммунологические методы исследования в
силу своей достаточно высокой чувствительности и специфичности, относительной
методической простоты и невысокой себестоимости являются эффективным способом решения задач обнаружения и идентификации патогенных микроорганизмов.
Создание современных иммунобиологических средств, предназначенных для выявления возбудителей опасных инфекционных заболеваний бактериальной природы, невозможно без высокоактивных и специфичных антител. Такими свойствами
обладают моноклональные антитела (МКАТ), которые получают с использованием
гибридомной технологии. Применение МКАТ для создания иммунобиологических
средств позволяет значительно повысить их диагностические показатели.
Препараты для иммунизации мышей линии BALB/c готовили из смеси суспензий инактивированных культур B. mallei штаммов Ц-5, 11, 10230 и B. pseudomallei
штаммов C-141, Dalat, Duc-V. Иммунизацию осуществляли подкожно в дозах
2 млрд, 4 млрд, 8 млрд и 16 млрд микробных клеток (м.к.) на животное. Спе цифическую активность иммунных сывороток определяли методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА).
Животным с наибольшим уровнем сероконверсии вводили бустер-дозу (15 млрд
м.к.) антигенного препарата. На четвертые сутки с момента бустерной инъекции селезенку асептически извлекали, спленоциты получали путем перфузии. Процедуру
слияния B-лимфоцитов селезенки мыши и клеток миеломы SP2/0-Ag14 проводили
по методике G.Kohler и C.Milstein [6] в модификации De St.Fazekas и D.Scheidegger
[3]. Клонирование гибридных клеток проводили методом лимитирующих разведений из расчета одна клетка на лунку. Иммунологический скрининг гибридных
культур и их клонов проводили, начиная с 10 суток после гибридизации, трижды с
интервалом три дня методом непрямого ИФА.
С целью изучения культуральных свойств гибридом готовили разведения культур от 200 тыс. клеток в 1 мл до 6,25 тыс. клеток в 1 мл и засевали ими лунки 24-луночного планшета в объеме 1 мл. За минимальную посевную концентрацию принимали разведение, при котором на пятые сутки не наблюдали гибели клеток.
Изучение секреторных свойств полученных клонов проводили методом непрямого ИФА. Для исследования использовали культуральные и асцитические жидкости гибридом-продуцентов. Культуральные жидкости получали от гибридных культур
в логарифмической фазе роста. Для получения асцитических жидкостей в брюшную полость мышей линии ВАLВ/c вводили гибридные клетки в количестве от 1
млн до 2 млн на животное. В случае развития у мышей асцитических опухолей на
15-20 сутки производили забор перитонеального экссудата. Иммуноглобулины из
асцитической жидкости выделяли путем осаждения раствором сульфата аммония.
Фракционированные антитела очищали методом ионообменной хроматографии
[1]. Из очищенных иммуноглобулинов готовили конъюгаты с пероксидазой хрена
(Sigma-Aldrich, США) по методике периодатного окисления [7].
С целью обоснованного выбора МКАТ, позволяющих «сэндвич»-методом ИФА
выявлять микробные культуры возбудителей сапа и мелиоидоза, был проведен анализ различных сочетаний антител в качестве сенситина и в составе конъюгата. Для
этого планшеты сенсибилизировали очищенными иммуноглобулинами в концентрации 20 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали культуры B.
mallei штамма Ц-5 и B. pseudomallei штамма С-141 в концентрации 5 млн м.к./мл.
Иммунопероксидазные конъюгаты (ИПК) вносили в рабочем разведении. Реакцию
учитывали определением оптической плотности субстратно-индикаторной смеси
при длине волны 492 нм (ОП492). Результат считали положительным при ОП492≥ 0,3.
Изучение диагностических возможностей МКАТ проводили в ИФА с использованием микробных культур возбудителей сапа и мелиоидоза в диапазоне концентра-ций от 16 млн м.к./мл до 125 тыс. м.к./мл, а также близкородственных буркхольдерий
в концентрации 10 млн м.к./мл и гетерологичных микроорганизмов: Yersinia pestis
(1 штамм), Yersinia enterocolitica (3 штамма), Yersinia pseudotuberculosis (3 штамма),
Escherichia coli (1 штамм), Francisella tularensis (4 штамма), Brucella abortus (5 штаммов), Brucella melitensis (4 штамма), Brucella suis (5 штаммов), Legionella pneumophila
(3 штамма), Bacillus anthracis (3 штамма), Vibrio cholerae (1 штамм) в концентрации
100 млн м.к./мл. Постановку ИФА осуществляли, как описано выше.
Результаты исследования сывороток крови животных, иммунизированных антигенам B. mallei и B. pseudomallei, показали высокий уровень их специфической
активности в титрах антител в ИФА 1:40000 — 1:320000 и 1:5000 — 1:640000, соответственно. Животных с наибольшим уровнем сероконверсии использовали в качестве источника иммунных спленоцитов.
В ходе проведенных экспериментов по гибридизации миеломных клеток с Bлимфоцитами иммунных мышей и скрининга гибридных культур на специфическую антителопродукцию получили 17 первично-позитивных гибридных клеточных линий, продуцирующих антитела к антигенам В. mallei и 20 — к антигенам
В. pseudomallei. Из дальнейшей работы исключили гибридные клеточные культуры,
характеризующиеся наименьшим уровнем продукции специфических антител по результатам трехкратного тестирования в ИФА. Оставшиеся первичные культуры клонировали, размножили путем последовательных пересевов и криоконсервировали.
Таким образом, получили 9 гибридом: 258F12H11, 292G4D4, 298С11Е11, 301Е5F10 —
специфичные к В. mallei и 253B4D4, 255A6F5, 255B6E1, 283B5H2, 298E9B4 — специфичные к В. pseudomallei.
Результаты исследования культуральных и секреторных свойств полученных
гибридом показали устойчивость пролиферативной и антителопродуцирующей активности на протяжении 10 пассажей in vitro и трех пассажей in vivo. При этом их
минимальная посевная концентрация составила 12,5 тыс. клеток в 1 мл и 25 тыс.
клеток в 1 мл, титр антител в культуральной жидкости находился в интервале от
1:160 до 1:5120, а в асцитической жидкости — от 1:160000 до 1:2560000.
Исследование различных сочетаний МКАТ в качестве сенситина и в составе ИПК показало, что сапные МКАТ гибридных клеточных линий 258F12Н11 и
298С11Е11 и мелиоидозные МКАТ гибридных клеточных линий 253B4D4, 255A6F5
и 255B6E1 обеспечивают наибольший сигнал иммуноферментной реакции при выявлении микробных культур В. mallei и В. pseudomallei, соответственно (ОП492>2,0).
Вышеуказанные гибридомы были взяты в опыт по оценке диагностических
возможностей МКАТ. Результаты опыта показали возможность выявления в ИФА
культур B. mallei и B. pseudomallei в диапазоне концентраций от 250 тыс. м.к./мл до
2 млн м.к./мл. При этом сочетания «сенситин-конъюгат» — «258F12H11-258F12H11»
и «255A6F5-255B6E1» обеспечивают наибольшую чувствительность ИФА. Все исследованные МКАТ не взаимодействовали в ИФА с культурами близкородственных
и гетерологичных микроорганизмов, что свидетельствует об их специфичности.
В ходе исследований по получению гибридом, продуцирующих моноклональные
антитела к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза, было проведено четыре эксперимента по гибридизации клеток мышиной миеломы с В-лимфоцитами мышей
линии BALB/с, иммунизированных инактивированными культурами B. mallei и B.
pseudomallei. В результате проведенных гибридизаций и последующих клонирований
получены гибридомы-продуценты моноклональных антител к антигенам B. mallei и
B. pseudomallei. Полученные гибридомы являются активными и стабильными антителопродуцентами специфических моноклональных антител. Показана принципиальная возможность создания иммуноферментных средств выявления возбудителей
сапа и мелиоидоза с использованием моноклональных антител, продуцируемых полученными гибридомами, с пределом обнаружения 250 тыс. м.к./мл и более.

About the authors

G. V. Kuklina

Branch of the 48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Kirov Russian Federation

G. D. Elagin

Branch of the 48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
Kirov Russian Federation

D. V. Pechenkin

Branch of the 48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
Kirov Russian Federation

O. O. Fomenkov

Branch of the 48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
Kirov Russian Federation

A. V. Eremkin

Branch of the 48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
Kirov Russian Federation

A. A. Kytmanov

Branch of the 48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
Kirov Russian Federation

S. A. Shurupov

Branch of the 48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
Kirov Russian Federation

S. S. Ipatov

Branch of the 48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
Kirov Russian Federation

References

Supplementary files