Модели зависимости количества биомассы Streptococcus pneumoniae и его капсульного полисахарида от состава питательной среды

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В последние годы наблюдается постоянный рост числа случаев внебольничной пневмонии, 30—50% которых вызваны Streptococcus pneumoniae. Основной проблемой лечения является формирование устойчивости пневмококка ко многим классам антибиотиков, что влечет за собой значительное снижение эффективности лечебных мероприятий [2]. По этой причине, особую актуальность приобретает вакцинация в качестве методики борьбы с такими заболеваниями. Так как основной стадией производства вакцины является получение капсульного полисахарида, важно подобрать оптимальные условия культивирования штаммов-продуцентов S. pneumoniae. 70 Целью данного исследования явилась разработка полусинтетической питательной среды, обеспечивающей получение максимального количества капсульного полисахарида (КПС). Поскольку эмпирический подбор концентраций каждого компонента является трудоемким процессом, мы пребегнули к методам математического прогнозирования. Для этого была оценена степень их влияния на количество биомассы и КПС после суточного культивирования S. pneumoniae, путем проведения ряда опытов по плану полнофакторного эксперимента (ПФЭ). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследования была выбрана культура S. pneumoniae серотипа 23F шт. 521. Штамм выделен в естественных условиях из трахеального аспирата детей с заболеванием органов дыхания в лаборатории микробиологии НЦЗД РФ. В качестве минерально-солевой основы для питательной среды использовалась пропись Ледерберга (на 1 л среды): 7 г K2HPO4; 3 г KH2PO4; 0,1 г MgSO4; 1 г (NH4)2SO4; 6 г NaCl [4]. «Нулевые» концентрации для соевого пептона и глюкозы составляли 20 г/л и 12,5 г/л соответственно. Дополнительно вносилась смесь витаминов, содержащая 1,6 мг рибофлавина мононуклеотида; 1,6 мг никотиновой кислоты; 8 мг тиамин хлорида; 8 мг пиродоксина. Культивирование проводили в пробирках с 10 мл полисинтетической питательной среды определенного состава. Выращивание проходило при температуре 37°С в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (5%) в течение 24 часов. Оптическую плотность (ОП) проб определяли на фотоэлектрокалориметре при длине волны 530 нм. Количество полисахарида в пробах определялось с помощью ракетного иммуноэлектрофореза [3]. Построение моделей и сравнение влияния различных компонентов осуществлялось согласно методике, указанной в учебном пособии [1]. Расчет коэффициентов уравнения и оценка адекватности самих уравнений проводился с применением пакетов RStudio версии 1.0.153. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Данные, необходимые для построения модели и сравнения степени влияния различных компонентов, были получены в ходе проведения дробного факторного эксперимента, разбитого на два ПФЭ. В первой серии опытов варьировались концентрации пептона и глюкозы на двух уровнях: 10 и 30 г/л для пептона, 5 и 20 г/л для глюкозы. Дополнительно исследовался рост пневмококка при пептоне в концентрации 20 г/л, но при полном отсутствии глюкозы. Затем исследовалось изменение количества биомассы и КПС в зависимости от наличия или отсутствия холина (50 мг/л) и витаминов в среде. Все варианты концентраций компонентов представлены в табл. Так как количество микроорганизмов может различаться и, следовательно, ОП посевной культуры варьироваться, для построения адекватных моделей в качестве выходных переменных были выбраны натуральный логарифм отношения оптической плотности суточной культуры и в момент посева ln(N/N0) и корректированное количество полисахарида с учетом заданной начальной ОП, равной 0,2 (P·0,2/yнач). Этот выбор обусловлен линейной зависимостью ОП от концентрации биомассы и равной вероятностью деления каждой клетки во время процесса культивирования. В результате серии экспериментов были вычислены коэффициенты уравнений регрессии, оценена их значимость и построены модели зависимости продукции биомассы и КПС в зависимости от состава питательной среды. Адекватность коэффициентов была оценена с помощью критерия Стьюдента t (p = 0,05 при α = 0,95), а полученных уравнений — по критерию Фишера F. Отмечено, что количество биомассы и КПС в разной степени зависели от питательных веществ. Холин и витамины существенно повышали рост пневмококка. Предположительно, они не влияли на полисахарид, поскольку, согласно тесту Стьюдента для нескольких независимых выборок, средние значения выборок равны. Глюкоза менее значима, чем пептон, поскольку пневмококк хорошо рос в среде с пониженным ее содержанием. Однако полное отсутствие глюкозы существенно ухудшало рост, то есть ей нельзя пренебрегать при подготовке питательной среды. Выход КПС зависел только от начального содержания пептона, причем полиномиальная зависимость второй степени более точно описывала экспериментальные данные по сравнению с линейной. Для решения поставленной задачи, а именно нахождения состава оптимальной питательной среды для пневмококка, был проведен эксперимент согласно методу Бокса-Уилсона [1]. В качестве оптимизируемых параметров были выбраны концентрации пептона и глюкозы. Величина шага ΔSi в направлении увеличения градиента рассчитывалась, исходя из коэффициентов регрессионного уравнения. Одновременно с этим определялся точный характер зависимости. Исходя из полученного значения шага, проводилось культивирование на пяти питательных средах с соответствующими концентрациями пептона и глюкозы. Солевой состав аналогичен предыдущим средам. Данные опыта по уточнению зависимости образования продуктов при увеличении концентраций пептона и глюкозы по градиенту говорят о том, что в действительности обе зависимости не являются линейными и имеют максимумы в промежутке концентраций 26 — 32 г/л для пептона и 13,54 — 14,6 г/л для глюкозы. При более высоком содержании этих компонентов, предположительно, происходит ингибирование роста. Поэтому согласно результатам были построены новые модели, представляющие собой полиномы второй степени, которые более точно описывали экспериментальные данные. Зависимости прироста биомассы и образования КПС представлены на рис. 1 и 2 соответственно.

Рис. 1. Поверхность функции отклика ln(N/N0) от концентрации пептона и глюкозы

Рис. 2. Поверхность функции отклика количества КПС от концентрации пептона и глюкозы

 

В ходе анализа уравнений, полученных после обработки результатов эксперимента, были найдены экстремумы уравнений, соответствующие максимально возможному образованию продукта, и концентрации компонентов среды, при которых они достигаются. При значениях пептона и глюкозы, равных 24,6 и 13,4 соответственно, уравнение достигает экстремума, равного 1,0968. Учитывая, что ОП посевной культуры равна 0,2, предполагаемая ОП после суточного культивирования при данных концентрациях питательных веществ должна составлять 2,499. Оптимальные расчетные концентрации пептона и глюкозы, при которых образование КПС максимально, составляют 32,6 и 12,1 г/л соответственно. При этом прогноз выхода полисахарида составляет 239 мг/л. Таким образом, с помощью метода дробного факторного эксперимента были получены модели зависимости количества биомассы S. pneumoniae и его капсульного полисахарида от состава питательной среды. Были найдены оптимальные концентрации компонентов среды, которые позволяют увеличить по сравнению со стандартной прописью уровень образования биомассы на 10%, а КПС — в 1,5 — 2 раза.

Об авторах

А. О. Смирнова

Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева;
НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

С. А. Барановская

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

М. М. Токарская

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

С. И. Елкина

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Н. Е. Ястребова

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru

Ястребова Наталия Евгеньевна, д.м.н.

105064, Москва, М. Казенный пер., 5а, р.т. (495)917-07-41

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы