Изучение влияния полиэлектролитов, обладающих противовирусным действием, на активность нейраминидазы вируса гриппа и процесс окислительного фосфорилирования в митохондриях клеток организма-хозяина

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ
Эффективность современных вакцин ограничивается постоянно меняющимся
антигенным разнообразием вируса гриппа. Поэтому при появлении нового штамма
необходимо создание новой вакцины, что экономически невыгодно. В связи с этим,
появление нового класса препаратов на основе ПЭ может решить данную проблему
66
за счет выраженного штамм неспецифичного ингибирующего действия в отношении нейраминидазы вируса гриппа. К таким препаратам, обладающих вирусингибирующим действием, можно отнести полиэлектролиты (ПЭ): полистиролсульфонат
со степенью полимеризации 8 (ПСС-8) и полиаллиламин с молекулярной массой
6 кДа (ПАА (6 кДа)). Для данных соединений было впервые выявлено повреждающее действие в отношении белков вируса гриппа гемагглютинина и нейраминидазы
[1, 4]. При этом механизм и кинетические характеристики ингибирования ПЭ нейраминидазы установлены не были. Однако использование данных препаратов может
оказывать негативное влияние на клетку, в частности, на процессы окислительного
фосфорилирования митохондрий с помощью ингибирования ферментов дыхательной цепи. В данной работе впервые определен неконкурентный тип ингибирования
данными соединениями нейраминидазной активности вируса гриппа и рассчитаны
константы ингибирования. Определены значения дыхательных коэффициентов
и отношения АДФ/O для митохондрий клеток скелетных мышц, в которых может
размножаться вирус гриппа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовались очищенные штаммы вируса гриппа: А/ВЧП/Вейбридж
(Н7N7), А/Маллард Пенсильвания/10218/84 (H5N2), A/NIBRG-14 (H5N1) с исходным
инфекционным титром 4,5 lg ТЦД50/мл. Растворы ПЭ полистиролсульфонат со степенью полимеризации 8 в концентрациях 0,5 — 4,0 мМ и полиаллиламин (6 кДа) в
концентрациях 0,5-4,0 мкМ.
Для определения активности нейраминидазы вируса гриппа использовали
штаммы вируса гриппа после удаления низкомолекулярных ингибиторов нейраминидазы диализом против бидистиллированной воды. Субстратом нейраминидазы
являлся фетуин («Sigma», США) в конечных концентрациях от 0,052 до 1,2 мкМ
для ПАА (6 кДа) и от 0,052 до 1,2 мМ для ПСС-8. Для построения калибровочной
кривой готовили ряд пробирок, содержащих от 5 до 40 мкг N-ацетилнейраминовой
кислоты в 0,2 мл 0,2 М ФБР, рН = 6,0. Реакционную смесь охлаждали до комнатной
температуры, добавляли 0,1 мл перийодатного реагента, тщательно перемешивали и
инкубировали 20 мин при комнатной температуре. К смеси добавляли 1,0 мл арсенитного реагента и перемешивали до тех пор, пока выпавший в осадок йод не растворится вновь. К смеси добавляли 2,5 мл тиобарбитуратного реагента, перемешивали и помещали на 15 мин в кипящую водяную баню. При этом смесь становилась
темно-розовой, но при охлаждении бледнела. К смеси добавляли 4 мл бутанолового
реагента (N-бутанол, содержащий 5% по объему концентрированной HCl) и интенсивно встряхивали, чтобы экстрагировать окрашенное вещество. Пробирки центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге при комнатной
температуре, отбирали водную (нижнюю) фазу и определяли на спектрофотометре
Zenhit 200st (РФ) величину поглощения при длине волны 549 нм с соответствующим
контролем [5].
Определение типа ингибирования нейраминидазной активности вируса
гриппа ПЭ и расчет констант ингибирования проводили методом Диксона [3].
Митохондрии выделяли из скелетных мышц [2]. Значение дыхательного контроля
по Ларди-Вильману выражали через отношение (ДКл)=V3/V2 [7]. Данный параметр
часто называют коэффициентом усиления, поскольку он характеризует способность митохондрий отвечать на добавку АДФ ускорением своего дыхания и, следовательно, является как бы мерой сродства дыхательной цепи к этому нуклеотиду.
Значение дыхательного (акцепторного) контроля по Чансу-Вильямсу выражали через отношение (ДКч)=V3 /V4 [6]. Эта величина является показателем интактности
структур митохондрий и характеризует ингибирующий эффект наработанного АТФ
на перенос электронов по дыхательной цепи: АДФ/O=количество АДФ(нмоль)/ΔО
67
(потребленному за время фосфорилирования кислорода). Этот показатель, как известно, характеризует энергоэффективность окисления субстратов митохондриями
[2]. Все параметры определяли полярографическим методом с помощью электрода
Кларка. В качестве субстратов дыхания митохондрий использовали сукцинат калия
с конечной концентрацией в ячейке электрода Кларка 3 мМ, АДФ добавляли в конечной концентрации 200 мМ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С целью определения типа ингибирования нейраминидазной активности
ПСС-8 и ПАА (6 кДа) был использован метод Диксона. Исходя из анализа полученных результатов, был сделан вывод о неконкурентном типе ингибирования
указанных ПЭ в отношении нейраминидазной активности вирусов гриппа (штамм
H5N2) с константами ингибирования КI = 1,6 ± 0,08 мкМ для ПАА (6 кДа) и
КI = 1,7 ± 0,085 мМ для ПСС-8. В данном случае неконкурентный механизм ингибирования нейраминидазной активности вирусов гриппа ПЭ объясняется конформационными изменениями в молекулах фермента и/или фермент-субстратного комплекса и соответственно структурно-функциональными изменениями его вторичной
структуры. Следует отметить, что данный тип ингибирования нейраминидазной активности был характерен для двух использованных в работе штаммов вируса гриппа.
Процесс ингибирования в данном случае связан с повреждающим действием ПСС-8
и ПАА (6 кДа) в отношении вторичных структур белковых молекул фермента. Важно
отметить, что в случае неконкурентного ингибирования константы ингибирования
являются также ингибирующими концентрациями, при которых активность фермента снижается в два раза, т.е. IC50.
Следующим этапом работы было выяснение возможности ингибирования полиэлектролитами ферментов дыхательной цепи митохондрий клеток, в которых
может размножаться вирус гриппа, так как наряду с ингибированием нейраминидазы может наблюдаться концентрационный эффект ингибирования и в отношении
ферментов клеток организма хозяина, необходимых для нормального функционирования организма, в частности, осуществления процессов тканевого дыхания.
С этой целью были определены основные количественные характеристики процесса окислительного фосфорилирования в митохондриях, выделенных из скелетной
мышцы, такие как дыхательные коэффициенты по Ларди-Вельману (ДКл) и ЧансуВильямсу (ДКч), и показатель сопряжения дыхания и фосфорилирования АДФ/O
после взаимодействия с ПСС-8 и ПАА
(6 кДа) в концентрациях 20 мМ и 10
мкМ, находящихся на верхнем пределе диапазона нетоксических концентраций, определенным нами ранее [4].
Были получены следующие значения
дыхательных коэффициентов и отношения для двух полиэлектролитов
АДФ/O (табл. 1,2).
Следует отметить, что при концентрациях ПЭ от 0,5 до 20 мМ для
ПСС-8 и от 0,5 до 10 мМ для ПАА (нетоксический диапазон концентраций
для обоих ПЭ) снижения показателей
окислительного фосфорилирования
не происходило.
Регистрируемое снижение показателей, характеризующих сопряжение процессов дыхания и фосфорилирования, позволяет говорить о наличии серьезных органических нарушений в дыхательной цепи митохондрий. Более выраженное
снижение дыхательного коэффициента по Чансу-Вильямсу указывает, что ухудшение тканевого дыхания вызвано нарушением интактности мембран митохондрий,
вызванное их взаимодействием с полиэлектролитами. Таким образом, в отношении
невирусных ферментов ингибирующие концентрации оказались достоверно выше.
Вследствие чего, можно заключить, что диапазон концентраций от 0 до 19 мМ для
ПСС-8 и от 0 до 9 мкМ для ПАА (6 кДа) является нетоксическим для организма, как
было показано ранее, но с сохранением выраженного противовирусного эффекта,
обусловленного ингибированием нейраминидазной активности вируса гриппа.

Об авторах

Н. А. Контаров

Первый московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова;
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru

Контаров Николай Александрович, к.б.н.

119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр. 2, р.т. (499)246-99-01

Россия

И. В. Погарская

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Н. В. Юминова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Список литературы

Дополнительные файлы