Протеомное профилирование штаммов Yersinia pestis, циркулирующих на территории природных очагов чумы Северного Кавказа и Закавказья

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Создание базы данных масс-спектров штаммов Yersinia pestis, позволяющей дифференцировать штаммы основного и кавказского подвидов возбудителя чумы методом MALDI-TOF MS. Материалы и методы. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии было исследовано 50 штаммов Yersinia pestis, выделенных на территории 7 природных очагов чумы Кавказа и Закавказья в период 1950-2012 г. Снятие масс-спектров экстрактов клеток Y. pestis проводили с использованием масс-спектрометра Microflex LT «Bruker Daltonics». Результаты обрабатывали и анализировали в программах «FlexAnalysis» и MALDI Biotyper v. 3.0. Результаты. Показано, что масс-спектры имеют характерные особенности, позволяющие дифференцировать штаммы основного (pestis) и неосновного подвидов. Выявлены пики, характерные для каждого подвида, наличие у Y. Pestis подвида caucasica пиков, характерных для предковой формы — Y. pseudotuberculosis указывает на древнее происхождение этой группы, что согласуется в данными молекулярно-генетического и WGS анализа, приведенными в публикациях отечественных и зарубежных авторов. Заключение. Показана возможность применения метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для быстрой дифференциации штаммов чумы основного и неосновного подвида, имеющих разное значение в развитии и поддержании эпизоотического процесса в природных очагах чумы, а также разную вирулентность для человека. Идентификация штамма до уровня подвида требует проведения культуральных и биохимических тестов, которые могут занять несколько суток. Предлагаемый метод позволяет провести дифференциацию и получить результат уже через полчаса после получения чистой культуры.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Чума — зоонозная природно-очаговая бактериальная инфекция. На территории Российской Федерации находятся 11 природных очагов чумы. Общая площадь эн- зоотичной по чуме территории составляет 222,4 тыс. км2. Эпизоотии чумы в период с 2000 по 2015 годы зарегистрированы в 8 из 11 природных очагов, в которых выде- лено 1709 штаммов микроба чумы. С 2014 г. в России ежегодно отмечаются случаи заболевания человека чумой [2]. Устойчивая тенденция активизации ряда природ- ных очагов чумы указывает на необходимость усиления роли эпизоотологического мониторинга для предотвращения случаев заболевания. На территории Северного Кавказа и Закавказья циркулируют различные варианты Yersinia pestis. В Центрально-Кавказском высокогорном (01), Терско- Сунженском низкогорном (02), Дагестанском равнинно-предгорном (03), Прикаспийском Северо-Западном степном (14) и Прикаспийском песчаном (43) циркулируют штаммы Yersinia pestis subsp. pestis, а в Восточно-Кавказском высоко- горном (39), Закавказском высокогорном (04-06), Терско-Сунженском низкогорном (02) — штаммы Y. pestis subsp. caucasica. Дифференциация и типирование штаммов микроба чумы, выделенных на тер- ритории очагов, имеет большое значение для оценки степени напряженности эпи- зоотического процесса, выявления путей распространения возбудителя [13]. В последнее десятилетие в видовой идентификации микроорганизмов актив- но используется технология «мягкого» способа ионизации молекул исследуемого вещества, реализуемая в методе MALDI-TOF масс-спектрометрии. Данный метод позволяет проводить прямой масс-спектрометрический анализ белковой фракции микробных клеток (т.е. прямое белковое профилирование) и получать уникальные для каждого вида масс-спектры [5, 12, 14]. Для идентификации микроорганизмов необходимо наличие эталонных спектров данного вида, представляющих собой су- перспектры (усредненные серии единичных спектров), сравнение с которыми поз- воляет добиться большой точности и воспроизводимости анализа. Коммерческие базы данных для идентификации микроорганизмов методом MALDI-TOF масс- спектрометрии не содержат референс-спектров возбудителей особо опасных ин- фекций, в том числе референтных масс-спектров штаммов Y. pestis, что значительно ограничивает возможности использования данного метода. Поэтому очевидна не- обходимость создания базы масс-спектров штаммов Y. pestis, циркулирующих на территории природных очагов Северного Кавказа и Закавказья, где находится зна- чительная часть (5 из 11) природных очагов чумы в Российской Федерации. МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы Исследовано 50 штаммов Y. pestis, изолированных в период с 1950 по 2012 годы на территории 7 природных очагов Северного Кавказа и Закавказья (табл.). Все штаммы предварительно идентифицированы до подвида [3]. Штаммы Y. pestis выращивали на LB агаре (по Ленноксу) при температуре (28±1)0С в течение 24 ч. Обеззараживание штаммов Y. pestis и экстракцию кислоторастворимых белков про- водили по ранее предложенному методу [9]. Дополнительно лизат фильтровали че- рез PVDF фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Далее в фильтрат добавляли равный объем 50% ацетонитрила, после чего использовали для MALDI-TOF масс-спек- трометрического анализа. Для контроля специфической стерильности белковых экстрактов штаммов Y. pestis их нейтрализовали [7] и делали контрольные высевы каждого образца на 5 чашек с LB агаром, которые инкубировали в течение 5 суток при 28оС с ежедневным просмотром посевов. Во время проверки на специфическую стерильность образцы белковых экстрактов хранили при (-80 0С). В работе были использованы питательные среды: LB Broth (Amresco LLC), Tryptic soy broth (Liofilchem, Italy), Microbiology agar (Sigma, USA); реактивы: L-histidine (Amresco LLC), TWEEN-80, pure (AppliChem, Germany), TFA (trifluoroacetic acid spectroscopy grade, ultrapure) (AppliChem, Germany), Acetonitrile (HLPC-gradient grade), Bacterial Test Standart (Bruker Daltonics, Germany), α-цианогидроксикоричная кислота (CHCA) (Bruker Daltonics, Germany). Снятие масс-спектров экстрактов клеток Y. pestis проводили с использованием масс-спектрометра Microflex LT «Bruker Daltonics». Образцы в объеме 1 мкл наносили на поверхность 96-луночного MSP планшета и после полного высыхания на каждый образец наслаивали равный объем матрицы — насыщенной α-гидроксикоричной кислоты (CHCA). Насыщенный раствор CHCA готовили в объеме 1 мл: смешивали 475 мкл ультрачистой деионизованной воды, 25 мкл 100% TFA и 500 мкл ацетонит- рила и в раствор вносили 0,05 г α-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Измерение проводили в линейном режиме с ускоряющей мощностью 20 kV (источник ионов 1) и 18,7 kV (источник ионов 2). Способ ионизации — матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с линейным режимом положительных ионов. Напряжение на фокусирующей линзе 9 kV. Время задержки анализатора 150 нсек., частота лазера — 60 Гц. Масс-спектры получали в диапазоне 2000-20000 Да, но основная масса пиков регистрировалась в диапазоне 2500-10000 Да. В качестве калибранта использова- ли Bacterial Test Standart (Bruker Daltonics). Каждый образец наносили в 8 повторах. Бактериальный стандарт наносили в 5 повторах на одну мишень. Нами были подобраны параметры получения референсных масс-спектров штаммов Y. pestis: количество суммарных спектров — 40, количество спектров для создания библиотеки MSP — 20, мощность лазера — 30-40 %. Спектры каждого штамма обрабатывали и анализировали в программе «FlexAnalysis». Полученные масс-спектры накапливали и собирали в индивидуальный суперспектр данного штамма. Создание суперспектра проводили из 20 единичных масс-спектров в про- грамме MALDI Biotyper v. 3.0. по стандартному алгоритму. Штаммы Y. pestis выращивали на агаре Хоттингера (рН 7,2) в течение 24 ч при 28о С. Пробы ДНК штаммов микроба чумы готовили следующим образом: к ис- следуемому образцу добавляли мертиолат натрия до конечной концентрации 0,01 % и прогревали в микротермостате 30 мин. при 560 С. Далее 100 мкл образца пе- реносили в 1,5 мл пробирки содержащие 300 мкл 6М гуанидинизотиоционата и прогревали 15 мин. при 650 С. Выделение ДНК проводили набором «РИБО-преп» («Интерлабсервис»). Для проверки кластеризации спектров штаммов Y. pestis, относящихся к разным подвидам на MSP-дендограмме, параллельно было проведено генотипирование ис- следованных штаммов по системе, включающей 25 вариабельных хромосомных ло- кусов [10, 11]. В состав реакционной смеси входили следующие компоненты: 200 μm каждого dNTP, 1 U Tag ДНК полимеразы (Интерлабсервис), по 7,5 пмоль каждого праймера, 2,5 mM MgCl2, 5 мкл Ч5 ПЦР-буфера (Интерлабсервис). Общий объем реакционной смеси составлял 15 мкл, объем вносимой ДНК-матрицы — 10 мкл. Амплификацию проводили по программам, описанным в [10, 11] в термоциклере CFX Duo Fast 48/48 (Bio-Rad). Определение размера фрагментов продуктов ампли- фикации проводили с использованием автоматического анализатора Experion (Bio- Rad) и набора реагентов DNA 1K analysis Kit (Bio-Rad). Определение плазмидного профиля штаммов Y. pestis проводили, как описано ранее [15]. Для представления эволюционных отношений между исследованными штам- мами Y. pestis использовали программу START2 (www.pubmlst.org). При построении дендрограммы в программе START2 использован алгоритм UPGMA. Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е Создана база масс-спектров 50 штаммов Y. pestis подвидов pestis и caucasica, вы- деленных на территории природных очагов чумы Северного Кавказа и Закавказья, предназначенная для проведения идентификации культур возбудителя чумы на ба- зе программного обеспечения MALDI Biotyper v3.0, которая позволяет достоверно идентифицировать культуры чумного микроба с SV≥ 2,3-2,4 и дифференцировать их от культур близкородственных видов (Y. pseudotuberculosis). С целью анализа качества полученных масс-спектров и возможности сопоставления собственных данных с результатами других исследователей проанализированы пик-лис- ты всех изученных штаммов Y. pestis. Для каждого штамма выбраны сингалы с уровнем сигнал/шум ≥10%. В результате идентифицированы пики, характерные, по описанию [8], для разных уровней таксономической идентификации: семейство Enterobacteriaceae, род Yersinia, группа Y. pestis/pseudotuberculosis, вида Y. pestis, что свидетельствует о валиднос- ти используемых образцов и достоверности полученных результатов. Отсутствие одного из специфических пиков в единичных спектрах не оказывает, на наш взгляд существен- ного влияния на результаты. Ни для одного из образцов не было выявлено отсутствие сигнала более чем по одному биомаркеру (пику). Большинство этих маркеров относятся к фрагментам рибосомальных (50S и 30S) и структурных белков [8]. Показано, что использование MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа для идентификации культур возбудителя чумы позволяет не только проводить ви- довую идентификацию, но и дифференцировать штаммы основного подвида — Y. pestis pestis и подвида Y. pestis caucasica. При анализе пик-листов и масс-спектров у большинства штаммов идентифицирован пик 3065 Да, который ранее был описан как видоспецифичный для штаммов Y. pestis [8]. Данный пик — это пептид разме- ром 30 аа, который идентифицируется в базе данных UniprotKB как фрагмент белка активатора плазминогена, локализованного на плазмиде пестициногенности pPla (pPst). Высокая интенсивность специфического пика 3065 Да, обусловлена тем, что ген pla, кодирующий синтез белка-активатора плазминогена, является мультико- пийным. Как показали наши исследования, данный дифференцирующий маркер характерен только для штаммов Y. pestis основного подвида, вне зависимости от биовара, имеющих плазмиду pPla (pPst). Штаммы неосновного подвида, Y. pestis caucasica, не имеют пика 3065 Да, как и плазмиды pPla (pPst), что подтверждается результатами молекулярно-генетических исследований. Исследованные штаммы неосновного подвида, Y. pestis caucasica не имеющие плазмиды пестициногенности, при идентификации в программе MALDI Biotyper с использованием базы данных Biotyper и собственной базы масс-спектров чумного микроба, циркулирующих на территории Северного Кавказа, тем не менее, идентифи- цируются как штаммы Y. pestis и дифференцируются от штаммов Y. pseudotuberculosis с получением высоких значений коэффициента достоверности (Score). Проведенный анализ с использованием программного обеспечения Biotyper и FlexAyalysis показал, что основой такой дифференциации служат минорные пики, а также соотношение интенсивности родо- и группоспецифических пиков, представленных на спектре. Интересным является отсутствие видоспецифического пика 3065 Da у трех штам- мов основного подвида чумного микроба (Y. pestis С-231, С-702, С-822), что корре- лирует с данными молекулярно-генетического анализа об отсутствии у этих штаммов плазмиды pPST1. Тем не менее, по своим биохимическим, генетическим и биологичес- ким свойствам эти штаммы относятся к типичным представителям основного подви- да, что также отчетливо видно из MSP и MLVA 25 -дендрограммы. Пик 3065 Da, ука- зывающий на выработку штаммом белка-активатора плазминогена, обнаружен у 33 из 36 штаммов чумного микроба основного подвида и не идентифицирован ни у одного штамма кавказского подвида, что совпадает с результатами генетического скрининга на наличие плазмид и биохимическими свойствами изученных штаммов. У всех штам- мов кавказского подвида мы обнаружили пик 6474 Da, который в работе [8] описан как видоспецифический для Y. pseudotuberculosis. На наш взгляд, это служит косвенным подтверждением того, что штаммы кавказского подвида, наряду со штаммами линии 0.PE7 из Китая являются наиболее древними штаммами Y. pestis [1, 6], которые наибо- лее близко стоят к исходной предковой форме — Y. pseudotuberculosis. Как показывает анализ MSP-дендограммы штаммов Y. pestis, в структуре ден- дрограммы четко выделяются 3 основные ветви. Первая ветвь (нижняя), более многочисленная и структурированная, представлена штаммами основного подвида Y. pestis pestis которая имеет прикорневое деление на 2 основные ветви и далее де- лится на ветви более мелкого порядка, что зависит, в основном, от интенсивности пиков (соотношения m/z). Кластеризация штаммов не зависит от принадлежнос- ти к определенному природному очагу, что объясняется отсутствием специфичес- ких биохимических или фенотипических признаков, характерных для штаммов из конкретных очагов. Исключение составляют штаммы, выделяемые на территории Восточно-Кавказского высокогорного (39) и Закавказского высокогорного (04-06) природных очагов чумы. Эти штаммы относятся к неосновному подвиду Y. pestis caucasica и формируют на MSP-дендограмме две верхние прикорневые ветви. Четкое деление штаммов на 4 основные группы на основе кластеризации их MSP дендро- грамм дает основание предположить, что такое деление связанно с наличием или отсутствием определенных биохмических признаков, однако на основании данных основных биохимических тестов (ферментация сахаров, денитрификация, уреазная, фибринолитическая и коагулазная активность, ауксотрофность по некоторым ами- нокислотам) такую связь выявить не удалось. Деление на две основные ветви, соответствующее делению на основной и не- основной подвиды чумного микроба, происходит на основании наличия специфи- ческого белкового пика с молекулярной массой 3065 Да высокой степени интенсив- ности у штаммов Y. pestis pestis. Кроме того, масс-спектры основного и неосновного подвидов Y. pestis различаются по интенсивности ряда пиков в детектируемом диа- пазоне масс 2-20 кДа. Достоверность дискриминации штаммов чумного микроба до уровня подвида подтверждена кластерным анализом с использованием метода главных компонент. Для проверки качества полученных спектров и построенной на их основе MSP- дендограммы штаммов Y. pestis параллельно было проведено генотипирование ис- следованных штаммов по MLVA системе, включающей 25 вариабельных хромосом- ных локусов [1, 6]. Дендрограмма, представленная на рис., построена по результатам генетического типирования MLVA-25.

Филогенетические взаимоотношения штаммов Y. pestis, дендрограмма построна с использованием алгоритма UPGMA.

Как видно из представленной дендрограммы, в целом топология данного дерева повторяет топологию дерева, построенного на основе MS-спектров, сохраняя при- корневое деление на две основные ветви, соответствующие основному и неосновно- му подвидам чумного микроба. Таким образом, используя UPGMA алгоритм определения филогенетического родства штаммов микроорганизмов, нам удалось подтвердить высокую дифферен- цирующую способность полученных MS-спектров и возможность их использования при создании базы данных масс-спектров штаммов Y. pestis, циркулирующих на тер- ритории Северного Кавказа и Закавказья. База данных масс-спектров типичных и атипичных штаммов Y. pestis, выделен- ных из природных очагов чумы Северного Кавказа и Закавказья, зарегистрирована в Федеральной службе по интеллектуальной собственности (свидетельство о гос. регистрации базы данных № 2017620225) На основании масс-спектрометрической характеристики исследуемой выборки проведена дифференциация штаммов Y. pestis подвида pestis от штаммов подвида caucasica. Согласно полученным данным, масс-спектры штаммов Y. pestis подвида caucasica, циркулирующие на территориях Восточно-Кавказского высокогорного и Закавказского высокогорного природных очагов, имеют высокую степень сходства между собой. Они отличаются от штаммов Y. pestis подвида pestis, циркулирующих на территориях Центрально-Кавказского высокогорного, Дагестанского равнинно- предгорного и Прикаспийского песчаного природных очагов чумы. Главным отли- чием, позволяющим даже визуально на масс-спектре дифференцировать штаммы основного и кавказского подвидов, является наличие пика 3065 Да, который, яв- ляясь фрагментом белка-активатора плазминогена, указывает на наличие у штамма основных факторов вирулентности, характерных для подвида Y. pestis pestis. То, что у штаммов кавказского подвида имеется пик 6474 Да, ранее описанный как харак- терный для Y. pseudotuberculosis, на наш взгляд, косвенно подтверждает теорию о происхождении вида Y. pestis от возбудителя псевдотуберкулеза и более древнем происхождении штаммов кавказского подвида по сравнению с основным, что сов- падает с результатами WGS-анализа, описанными ранее [1, 6]. Простота и скорость пробоподготовки и выполнения анализа, низкая стоимость расходных материалов позволяют рассматривать метод MALDI-TOF масс-спектро- метрической идентификации как перспективный в лабораторной диагностике воз- будителя чумы и его дифференциации на подвиды.

×

Об авторах

Е. А. Котенева

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru

к.б.н.

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15, р.т. (8652)26-03-12

Россия

Е. С. Котенев

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Россия

А. В. Калинин

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Россия

Н. С. Царева

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Россия

Л. А. Кот

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Россия

Н. В. Жаринова

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Россия

А. А. Зайцев

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Россия

Г. А. Печковский

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Россия

Список литературы

  1. Ерошенко Г.А., Краснов Я.М., Носов Н.Ю., Куклева Л.М., Никифоров К.А., Оглодин Е.Г., Кутырев В.В. Совершенствование подвидовой классификации Yersinia pestis на основе данных полногеномного секвенирования штаммов из России и сопредельных государств. Проблемы особо опасных инфекций. 2015, 4: 58-64.
  2. Попов Н.В., Безсмертный В.Е., Матросов А.Н., Князева Т.В., Кузнецов А.А., Федоров Ю.М., Попов В.П., Вержуцкий Д.Б., Корзун В.М., Косилко С.А., Чипанин Е.В., Дубянский В.М., Малецкая О.В., Григорьев М.П., Зенкевич Е.С., Топорков В.П., Балахонов С.В., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Эпизоотическая активность природных очагов чумы Российской Федерации в 2015 г. и прогноз на 2016 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2016, 1: 13-19.
  3. МУ 4.2.2940-11 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики чумы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней». М., 2011.
  4. СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». М., 2013.
  5. Clark A., Kaleta E. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization—Time of Flight Mass Spectrometry: a Fundamental Shift in the Routine Practice of Clinical Microbiology. Clinical Microbiology Reviews. 2013, 3: 547-603.
  6. Cui Y., Yu C., Yan Y. et al. Historical variation in mutational rate in an epidemic pathogen Yersinia pestis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013, 110(2): 577-582.
  7. Lasch P., Nattermann H., Elchard M. et al. MALDI-TOF mass-spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Analytical chemistry. 2008, 80: 2026-2034.
  8. Lasch P., Drevinek M., Nattermann H. et al. Characterization of Yersinia using MALDI-TOF massspectrometry and chemometrics. Analytical chemistry. 2010, 82: 206 -210.
  9. Lasch P., Grunow R., Antonation K. et al. Inactivation techniques for MALDI-TOF MS analysis of highly pathogenic bacteria — A critical review. Trends in Analytical Chemistry. 2016, 1: 13-15
  10. Le Fléche P., Hauck Y., L. et al. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis. BMC Microbiology. 2001, 1: 23-34.
  11. Li I., Cui Y., Hauck Y. et al. Genotyping and Phylogenetic Analysis of Yersinia pestis by MLVA: Insights into the Worldwide Expansion of Central Asia Plague Foci. РLoS ONE. 2009, 4: 45-53.
  12. Panda A. MALDI-TOF mass spectrometry for rapid identification of clinical fungal isolates based on ribosomal protein biomarkers. Journal of microbiological methods. 2015, 109: 93-105.
  13. Salman M.D., Steneroden K. Important Public Health Zoonoses through cattle. Zoonoses-Infectioms affecting humans and animals. Springer Nethrlands. 2015, 1: 3-22.
  14. Van Veen S.Q., Claas E.C.J., Kuijper E.J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J. Clin. Microbiol. 2010, 3: 900-907.
  15. Woron A.M., Nazarian E.J., Egan C. et al. Development and evaluation of a 4-target multiplex real-time polymerase chain reaction assay for the detection and characterization of Yersinia pestis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2006, 56: 261—268.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Филогенетические взаимоотношения штаммов Y. pestis, дендрограмма построна с использованием ал- горитма UPGMA.

Скачать (168KB)
Метаданные

© Котенева Е.А., Котенев Е.С., Калинин А.В., Царева Н.С., Кот Л.А., Жаринова Н.В., Зайцев А.А., Печковский Г.А., 2019

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах