Mass spectrometry analysis of protein blood extracts of animals with experimental brucellos

D. V. Ulshina; Ульшина Д. В.; D. A. Kovalev; Ковалев Д. А.; D. G. Ponomarenko; Пономаренко Д. Г.; D. V. Rusanova; Русанова Д. В.; T. V. Berdnikova; Бердникова Т. В.; A. Yu. Evchenko; Евченко А. Ю.; O. V. Bobrysheva; Бобрышева О. В.; Yu. V. Siritsa; Сирица Ю. В.; S. V. Pisarenko; Писаренко С. В.; A. M. Zhirov; Жиров А. М.; I. V. Kuznetsova; Кузнецова И. В.; N. G. Varfolomeeva; Варфоломеева Н. Г.; A. N. Kulichenko; Куличенко А. Н.

doi:10.36233/0372-9311-2019-4-11-18

Масс-спектрометрический анализ белковых экстрактов крови животных при экспериментальном бруцеллезе

Авторы: Ульшина Д.В.¹, Ковалев Д.А.¹, Пономаренко Д.Г.¹, Русанова Д.В.¹, Бердникова Т.В.¹, Евченко А.Ю.¹, Бобрышева О.В.¹, Сирица Ю.В.¹, Писаренко С.В.¹, Жиров А.М.¹, Кузнецова И.В.¹, Варфоломеева Н.Г.¹, Куличенко А.Н.¹
Учреждения:
1. Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
Выпуск: Том 96, № 4 (2019)
Страницы: 11-18
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 31.08.2019
Дата принятия к публикации: 31.08.2019
Дата публикации: 31.08.2019
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/424
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-4-11-18
ID: 424

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Изучить возможность прямого выявления возбудителя бруцеллеза в биоматериале в условиях эксперимента методом MALDI-TOF MS с использованием ресурсов программы MassUp и комплекса пакетов для статистического программного обеспечения с открытым исходным кодом R. Материалы и методы. В качестве моделей использовали лабораторных мышей, зараженных возбудителями бруцеллеза (штаммы B. melitensis 548, B. abortus 544, B. suis 1330). Белковое профилирование проводили на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex «Bruker Daltonics». Результаты. Используемый биоинформационно-статистический подход для анализа MALDITOF масс-спектров позволил проводить прямое выявление бруцелл в биоматериале с последующим определением их видовой принадлежности на основании выявления группы биомаркеров. Заключение. Экспериментально подтверждено, что белковые профили экстрактов крови зараженных животных содержат 11 маркеров, в том числе 6 родоспецифичных для микроорганизмов рода Brucella spp., которые могут быть ассоциированы с бруцеллезной инфекцией.

Ключевые слова

Brucella spp., MALDI-TOF MS, белковое профилирование

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В настоящее время в работу бактериологических лабораторий активно внед- ряется технология MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Lazer Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry — матрично-активированная лазерная десорбция/ ионизация с времяпролетным разделением), характеризующаяся высокоточной экс- пресс-идентификацией микроорганизмов, возможностью анализировать материал, контаминированный посторонней микрофлорой и низкой стоимостью анализа. Для подавляющего большинства микроорганизмов: грамположительные, гра- мотрицательные, аэробные и анаэробные бактерии, дрожжи и плесень, сформи- рованы базы масс-спектрометрических данных (БД). С одной стороны, можно с уверенностью утверждать, что имеющиеся коммерческие БД позволяют обеспечить проведение рутинной идентификации патогенов, с другой, количество референ- сных масс-спектров различных видов микроорганизмов составляет лишь малую долю глобального микробного разнообразия, и поэтому имеющиеся базы данных нуждаются в пополнении. Возможности применения метода MALDI-TOF MS для точной идентификации микроорганизмов на основании анализа их белковых профилей отражены в статье Seng P. с соавторами [7]. По данным авторов диагностическая информативность ме- тода MALDI-TOF MS варьирует в пределах от 90 до 99,9%. По результатам ранее проведенных нами исследований была доказана эффек- тивность применения MALDI-TOF MS для индикации и межвидовой дифферен- циации культур бруцелл, выделенных бактериологическим методом из клиническо- го материала [2]. Можно ожидать, что в ближайшие годы MALDI-TOF MS будет использоваться в комплексе с основными методами лабораторной диагностики бруцеллеза благодаря возможности ее применения для экспресс-идентификации и типирования биологических агентов [3; Sali M. et al., 2018]. Известно, что для успешной идентификации культур микроорганизмов необ- ходимого качества масс-спектры могут быть получены при концентрации в исход- ном образце — не менее 104 м.к./мл [5]. Кроме того, присутствие различных веществ органической и неорганической природы в клиническом материале может также затруднить прямую индикацию бруцелл. В качестве решения указанной проблемы используют различные способы предварительной подготовки проб: фракциониро- вание, удаление мажорных фракций белков, селективное удаление небелковых при- месей и др. Использование MALDI-TOF MS для выявления возбудителей ООИ, в том числе бруцеллеза, в клиническом материале на настоящий момент включает необ- ходимый этап выделения культуры патогена бактериологическим методом, что за- трудняет внедрение подобного подхода в практику ввиду увеличения материальных затрат и продолжительности анализа [6]. Дополнительные временные затраты для реализации данного этапа существенно затрудняют возможность раннего назначе- ния адекватного антибиотика и могут приводить к использованию как недостаточно эффективных, так и избыточных режимов терапии. Применительно к рассматрива- емой проблеме сокращение времени инкубации высева первичной гемокультуры с применением специальных способов пробоподготовки позволяет проводить прямую идентификацию первичной гемокультуры, минуя этап субкультивирования [8]. Принимая во внимание все достоинства и возможности метода, наиболее ак- туальной представляется задача по выявлению на белковых профилях исследуе- мых культур групп специфичных фрагментов — маркеров с целью их дальнейшего поиска в спектрах образцов клинического материала или биоматериала от живот- ных [4]. В ходе проведенных исследований по изучению культур возбудителя бруцелле- за методом MALDI-TOF MS нами были выявлены группы бруцелла-специфичных фрагментов в диапазоне масс 2000 — 20000 Da (m/z, ±5 Da): 2422, 2581, 3025, 3268, 3336, 3523, 3696, 3754, 4545, 4770, 5036, 5170, 5360, 6672, 7048, 9085, 16068 [1]. Для изучения возможности и эффективности применения MALDI-TOF масс- спектрометрии для прямой детекции возбудителя бруцеллеза в биологических об- разцах необходимо экспериментальное моделирование инфекции на биомоделях. Цель работы — изучить возможность прямого выявления возбудителя бруцелле- за в биоматериале с использованием MALDI-TOF MS в условиях эксперимента. МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы В качестве биологических моделей использовали лабораторных мышей (n=20), зараженных возбудителями бруцеллеза (штаммы Brucella melitensis 548, Brucella abortus 544, Brucella suis 1330). В ходе эксперимента были сформированы четыре группы животных: группу № 1 заражали штаммом B.melitensis 548, № 2 — B. abortus 544, № 3 — B. suis 1330, № 4 — группа сравнения (животные, кровь которых была использована в анализе в ка- честве отрицательного контроля). Для моделирования инфекции мышам вводили подкожно в паховую область 0,5 мл суспензии соответствующего штамма бруцелл в концентрации 1105 м.к./мл в растворе 0,9% хлорида натрия, рН 7,2. Наблюдение за животными проводили в течение 21 сут после заражения. Через 21 сут после заражения биопробных животных умерщвляли путем хло- роформирования. У хлороформированных биомоделей производили взятие крови из сердца в объеме 1,0-1,5 мл. От зараженных животных производили посев па- ренхиматозных органов и лимфоузлов на агар Альбими, скошенный в пробирках. Посевы культивировали в термостате при температуре 37±1°С в течение 14 сут. От всех зараженных животных бактериологическим методом была выделена культура бруцелл. Биологическая безопасность работ с культурами возбудителя бруцеллеза была обеспечена в полном объеме в соответствии с требованиями СП 1.3.31.18-13 и МУК 3.1.7.3402—16. Культуры возбудителя бруцеллеза были выращены на агаре Альбими (рН 7,2 — 7,4, прочность 300 — 380 г по Валенту, содержание аминного азота 100 — 120 мг). Для проведения исследования использовались: вода ультрачистая, тип I по ASTM (система Millipore, США), спирт этиловый 96 % (ГОСТ Р 51723-2001), кис- лота муравьиная ~ 98% (Sigma-Aldrich, США), ацетонитрил, степень чистоты для ВЭЖХ-МС (Sigma-Aldrich, США), α-циано-4-гидроксикоричная кислота, степень чистоты для масс-спектрометрии (Sigma-Aldrich, США), трифторуксусная кислота > 99% (Sigma-Aldrich, США), бактериальный тест-стандарт MBT для внутренней калибровки масс-спектрометра (Bruker Daltonics, Германия). Принимая во внимание внутриклеточную локализацию возбудителя бруцеллеза, в качестве образца для белкового профилирования брали экстракт лейкоцитарной фракции крови, для чего осадок, содержащий форменные элементы крови, разбавляли многократно дистиллированной водой с последующей инкубацией (10 мин) и цент- рифугированием до полного удаления эритроцитов. Освобождение от эритроцитов проводили до полного обесцвечивания, получаемого в ходе промывки супернатанта. Суспензию отмытых лейкоцитов переносили в чистые микроцентрифужные пробирки и центрифугировали с удалением супернатанта при 15500 об/мин 10 мин. Обеззараживание образцов лейкоцитарной фракции осуществляли путем до- бавления к пробе 70% этилового спирта с последующей инкубацией при темпера- туре 30оС в течение 90 мин. После проведенной инактивации образцы суспензии центрифугировали и супернатант отбирали. Для полного удаления спирта процеду- ру центрифугирования повторяли. После обеззараживания часть осадка высевали на скошенный Бруцеллагар, посевы инкубировали в течение 7 дней при 37°C. Во время проведения контроля на специфическую стерильность образцы белковых экстрактов хранились при тем- пературе минус 18 — 20°С. При отсутствии специфического роста в пробирках с Бруцеллагаром исследуемый материал считали обеззараженным. Белковую экстракцию лейкоцитарной фракции производили смесью 70 % му- равьиной кислоты и ацетонитрила. Масс-спектры получали в линейном режиме на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics, Германия) в диапазоне масс 2000—20000 Da. Подготовленные вышеописанным способом пробы в объеме 1 мкл наносили на ячейки стального планшета для MALDI-TOF MS, в течение нескольких минут су- шили на открытом воздухе, затем сверху наслаивали раствор матрицы (α-циано-4- гидроксикоричная кислота в растворе, содержащем 500 мкл ацетонитрила, 475 мкл воды I типа и 25 мкл трифторуксусной кислоты). Плашку высушивали на воздухе в течение 5 минут до образования кристаллов. Масс-спектры получали в линейном режиме на MALDI-TOF масс-спектромет- ре Microflex при следующих параметрах: частота лазера 60 Гц, интенсивность лазера 10—50%, время задержки экстракции 110 нс PIE, напряжение первого источника ионов 19,4 kV, второго — 17,3 kV, напряжение фокусирующей линзы 8 kV, напряже- ние линейного детектора 2,500 kV, диапазон масс m/Z 2000—20000 Da. Внутреннюю калибровку диапазона m/Z проводили с использованием точных значений масс бактериального тест-стандарта MBT (Bruker Daltonics, Германия) в автоматическом режиме. Для управления масс-спектрометром, включая установку режимов работы и регистрации масс-спектров, использовали программный пакет Daltonics flexControl v.3.3.64 (Bruker Daltonics, Германия), для предварительной оценки интенсивности и разрешения пиков в спектре — flexAnalysis v 3.3.65. Формирование промежуточ- ных таблиц проводили с использованием программных ресурсов пакета Microsoft Office 2010. Статистический анализ и визуализацию полученных данных осущест- вляли с помощью интегрированных пакетов «MALDIquant», «MALDIquantForeign», «sda» (https://cran.r-project.org/web/packages/rgl/index.html), (http://strimmerlab.org/ software/maldiquant/) языка программирования R (https://cran.r-project.org/) и Mass- Up (http://sing.ei.uvigo.es). Полученные в ходе работы масс-спектры для каждого анализируемого образ- ца использовали для построения дендрограммы средствами программного пакета «MALDIquant», реализованного в среде R, представляющего альтернативу для ин- терпретации данных MALDI-TOF MS. Представление полученных масс-спектров в виде иерархической структуры позволило определить положение каждого отдельно- го спектра на основании величины сходства характеристик его пиков от средних значений характеристик в группе спектров. Результативность кластерного анализа достигается использованием метрики дистанций d (х, у), при этом расстояние меж- ду объектами одной группы в целом будет меньше «e», а между объектами из разных групп больше «e», где «e» > 0 — задаваемый уровень сходства. Построение собственного дерева для каждой повторной выборки с вычислени- ем частоты встречаемости всех фрагментов в сформированной последовательности производили с использованием бутстреп-вероятности BP. Гипотезу о существовании кластера считали достоверной, если с ветвями бутстрепного дерева связывалась ве- роятность, превышающая 70%. Построение дендрограммы проводили в евклидовом пространстве на основании данных матрицы признаков «featureMatrix». В качестве метода для создания классификаций масс-спектров использовали анализ главных компонентов (principal component analysis, РСА), основное преиму- щество которого заключается в том, что из совокупности характеристик объекта наблюдения (в данном случае — масс-спектр образца) выбирают наиболее вариа- бельные величины (с точки зрения исследователя), значения которых откладывают по осям трехмерной системы координат (главные компоненты) и на пересечении перпендикуляров из этих осей ставят точку. Используемое программное обеспече- ние позволило представить РСА-кластер в трехмерном пространстве. В качестве маркеров использовали сигналы, p-значение которых было меньше 0,05 (https://www.sing-group.org/mass-up/manual). Частоту встречаемости каждого потенциального маркера рассчитывали с использованием пакета прикладных про- грамм Statistica v 10.0. Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е Оценку особенностей белковых профилей экстрактов крови мышей, заражен- ных бруцеллами, проводили при сравнении с масс-спектрами отрицательного кон- троля (кровь мышей из контрольной группы). Каждый образец анализировали в четырех повторах. По результатам качественного и количественного анализа данных наименьшее количество пиков (40±2) содержали масс-спектры экстрактов крови животных, зара- женных B. suis 1330. Наиболее представительные спектры (79±3 и 69±3) были полу- чены для образцов крови мышей, которым вводили B. abortus 544 и B. melitensis 548, соответственно. На масс-спектрах белковых экстрактов крови мышей из групп сравнения ос- новное число сигналов было локализовано в двух областях значений масс рабочей области: 2,6—8,5 и 13,5—16,0 kDa. В результате сравнительного анализа белковых профилей образцов отрицательного контроля были установлены общие фрагменты, значения абсолютной интенсивности которых варьировало в диапазоне от 250 до 2,0 х 104 a.i. (m/z ± 5 Da): 2683, 2739, 2925, 3140, 3327, 4195, 4286, 5005, 5660, 6908, 7228, 7506, 11682, 14992, 15001. Разрешение для перечисленных сигналов находи- лось в диапазоне от 205 до 436, отношение сигнал/шум — от 6/1 до 19/1, ширина пика на полувысоте — от 11 до 52, частота регистрации составляла ≥0,99. Указанные значения параметров полученных масс-спектров являются приемлемыми для диф- ференциации аналитически значимых фрагментов из всего массива сигналов. При этом, области m/Z, содержащие сигналы с высоким значением абсолютной интен- сивности, перекрывались с областями значений масс, в которых регистрировались специфичные для представителей рода Brucella пики, что затрудняло выявление бруцелла-специфичных сигналов на масс-спектрах экстрактов крови мышей, зара- женных возбудителем бруцеллеза. Основное количество зарегистрированных пиков на масс-спектрах белковых экстрактов лейкоцитарной фракции крови мышей, зараженных возбудителем бру- целлеза, было расположено в интервале значений масс 2,0 — 8,3 и 14,5-1,6 kDa рабо- чей области. Анализ MALDI-TOF масс-спектров белковых экстрактов лейкоцитов крови инфицированных животных всех групп позволил выявить общие пики (m/z ± 5 Da): 2250, 2581, 3025, 3640, 3696, 3754, 4545, 6672, 7905, 8351, 14504 (курсивом отмечены родоспецифичные маркеры возбудителя бруцеллеза). Интенсивность ука- занных фрагментов находилась в диапазоне от 300 до 6000 a.i., разрешение — от 269 до 534, отношение сигнал/шум — от 8/1 до 24/1, ширина пика на полувысоте — от 6 до 59. Указанные параметры общих сигналов позволяют достоверно их дифференци- ровать от совокупности всех пиков. Частота регистрации шести родоспецифичных сигналов бруцелл, отличающихся по абсолютной интенсивности, составляла 0,98. В ходе сравнительного анализа белковых профилей экстрактов лейкоцитов крови мышей, инфицированных культурой B. abortus 544, были установлены специ- фичные для этой группы сигналы (m/z ± 5 Da): 2322, 2334, 4941, 6257, 10781, 10798, 11000, 12117, 13609. На масс-спектрах белковых экстрактов лейкоцитов крови жи- вотных, зараженных B. melitensis 548, было выявлено 2 общих сигнала (m/z ± 5 Da): 2264, 8378. Наибольшее количество уникальных фрагментов отмечено на белковых профилях экстрактов крови мышей 3 группы (B. suis 1330) (m/z ± 5 Da): 2133, 2422, 2455, 2545, 2754, 3050, 3107, 3268, 3842, 3885, 3902, 3927, 3970, 4067, 4796, 4856, 4871, 4896, 5114, 5219, 5235, 5250, 6621, 6640, 7106, 7155, 7172, 7336, 7360, 7386, 7550, 7777, 7854, 7992, 8917, 10289, 10332, 12699, 14256, 14346, 14362, 14468, 14698, 14864, 15858, 15904. Очевидно, что заражение модельных животных возбудителем бруцеллеза со- провождается появлением специфичных сигналов на соответствующих белковых профилях экстрактов крови. Визуализация данных, пост- роенная методом PCA с исполь- зованием ресурсов статистичес- кого программного обеспечения Mass-Up (рис. 1) отражает рас- пределение проб крови искусст- венно инфицированных живот- ных компактно и дискретно от крови мышей из группы сравне- ния в виде совокупности точек в пространстве (РСА-кластер).

Рис. 1. Диаграмма распределения масс-спектров экстрактов лейкоцитов крови мышей, зараженных культурами B. abortus 544, B. melitensis 548 и B. suis 1330, а также из группы сравнения на основании результатов анализа MS профилей методом PCA

На диаграмме можно отме- тить четкое разделение белковых профилей экстрактов крови мы- шей при остром бруцеллезе на две группы: первую образуют жи- вотные, зараженные культурами B. abortus 544 и B. melitensis 548, во вторую вошли животные, инфицированные B. suis 1330. Распределение образцов на ос- новании MS данных полностью совпадает с видовой принадлеж- ностью используемых при зара- жении штаммов бруцелл. Формирование отдельного кластера образцами лейкоцитарной фракции крови животных, зараженных B. abortus 544 и B. melitensis 548, на дендрограмме (рис. 2) в полной мере согласуется с общеизвестными данными о генетической близости представителей указанных двух видов бруцелл и с результатами на основании ана- лиза сходства белковых профилей их культур.

Рис. 2. Дендрограмма масс-спектров проб крови мышей из групп сравнения

Образцы отрицательного контроля формировали отдельную группу. Пробы крови животных, зараженных культурами B. suis 1330, также формировали компактную группу, по сравнению с образцами крови мышей, зараженных культурами B. abortus 544 и B. melitensis 548. Возможно, подобное расположение является следствием того, что белковые профили проб лей- коцитов крови животных, зараженных культурами B. suis 1330, характеризовались наименьшей представительностью (количество и интенсивность сигналов) по срав- нению с образцами от животных, зараженных B. abortus 544, B. melitensis 548. Таким образом, в ходе работы была подтверждена возможность прямого вы- явления специфичных маркеров возбудителя бруцеллеза в биоматериале методом MALDI-TOF MS без этапа выделения чистой культуры или накопления возбудителя в образце на стадии подроста гемокультур на питательных средах. В результате срав- нительного анализа белковых профилей экстрактов лейкоцитов крови животных при остром бруцеллезе описано 6 общих родоспецифичных сигналов Brucella spp. (m/z ± 5 Da): 2581, 3025, 3696, 3754, 4545, 6672, позволяющих достоверно опреде- лить образцы инфицированных бруцеллезом животных. Результаты MALDI-TOF MS исследования культур возбудителя бруцеллеза подтверждают сложность проведения межвидовой дифференциации близкородс- твенных видов бруцелл на основе данных белкового профилирования. Вместе с тем, на основании полученных данных, распределение спектров проб лейкоцитарной фракции крови животных, инфицированных разными видами бруцелл, на постро- енной дендрограмме полностью согласуется с видовой принадлежностью исследуе- мых штаммов. Присутствие различий на белковых профилях экстрактов лейкоци- тов крови мышей, инфицированных культурами возбудителя бруцеллеза, очевидно, обусловлено не только индивидуальными особенностями используемых культур бруцелл разных видов, но и их адаптивными изменениями в организме животных в условиях персистенции возбудителя. Следовательно, при нахождении в организме хозяина возбудитель инфекции подвергается воздействию иммунной системы, что, вероятно, обусловливает синтез патогеном определенных белков, экспрессия кото- рых вне организма хозяина отсутствует. Описанные родо- и видоспецифичные для бруцелл особенности масс-спектров экстрактов лейкоцитов крови при остром бруцеллезе могут быть использованы при разработке эффективного методического подхода для индикации и идентификации возбудителя бруцеллеза в клиническом материале и биоматериале от сельскохозяйс- твенных животных с использованием MALDI-TOF MS. Таким образом, результаты экспериментального исследования позволяют го- ворить о высокой диагностической информативности метода MALDI-TOF MS для прямого выявления белковых маркеров бруцелл в биоматериале и последующего определения их видовой принадлежности, что требует дальнейших исследований. Впервые охарактеризованы ассоциированные с бруцеллезной инфекцией 11 белко- вых маркеров, в том числе 6 родоспецифичные для микроорганизмов рода Brucella spp., которые могут быть использованы при разработке эффективного методическо- го подхода для диагностики бруцеллеза методом MALDI-TOF MS.