О ВАЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЭВОЛЮЦИОННО НАДЕЖНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ГЕНЕТИЧЕСКОГО СЕМЕЙСТВА LAM

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ
Характерной особенностью вида Mycobacterium tuberculosis является стро-
го клональная структура популяции как следствие отсутствия горизонтально-
го генетического переноса. Помимо общебиологического смысла такого хода
эволюции (обсуждение которого выходит за рамки данного сообщения), этот
факт имеет и прикладное, клиническое значение применительно к реализации
региональных программ борьбы с туберкулезом. В настоящее время общепри-
знано, что отдельные генотипы (генетические семейства, сублинии, клональ-
ные кластеры) M. tuberculosis отмечены повышенной вирулентностью, транс-
миссивностью, или способностью быстрого развития устойчивости к
противотуберкулезным препаратам. Структуру популяции возбудителя тубер-
кулеза в России и других странах постсоветского пространства часто воспри-
нимают через призму доминирования резистентных штаммов генетического
семейства Beijing. В целом обоснованный, такой подход упрощает реальность
как в количественном, так и в качественном аспектах. В том, что касается
собственно структуры популяции, штаммы генетического семейства LAM
(Latin American Mediterranean) также являются значимым компонентом по-
пуляции M. tuberculosis, особенно в Европейской части бывшего СССР, и
составляют до 30 — 40% локальных популяций, например, в центральной
России и Белоруссии [7, 15]. Более того, рассматривая патобиологические
особенности штаммов, нужно учитывать, что эмерджентные, потенциально
или актуально эпидемические геноварианты отмечены не только среди пред-
ставителей семейства Beijing, но также и LAM и еще одного (недостаточно
оцененного) генотипа Ural.
В свою очередь, это подчеркивает необходимость применения четких,
эволюционно надежных молекулярных маркеров для корректного определе-
ния таких генетических групп, имеющих клиническую и/или эпидемиологи-
ческую значимость. Эволюционно значимые геногруппы могут быть выявле-
ны: (1) на основе детекции валидированных специфических SNP (single
nucleotide polymorphism) или геномных делеций, представляющих уникальные
и однонаправленные эволюционные события; (2) посредством филогенети-
ческого анализа (кластеризации) на основе множества независимых и ней-
тральных эволюционных маркеров, к которым могут быть отнесены полно-
геномные SNP или локусы VNTR (variable number of tandem repeats).
Генетическое семейство LAM M. tuberculosis впервые было описано в 2001
году в результате филогенетического анализа относительно глобальной кол-
лекции сполигопрофилей [14]. Прототипным сполготипом LAM является
SIT42, в профиле которого отсутствуют сигналы 21-24 и 33-36. Последующее
применение эволюционно надежных маркеров подтвердило реальность LAM
и позволило более адекватно определить его филогенетические границы.
Также можно отметить, что LAM входит в крупную Евро-Американскую ли-
нию, хотя и определенную на основании SNP-анализа, но также имеющую
характерный маркер на основании сполиготипирования, а именно отсутствие
сигналов 33-36.
В наших предыдущих работах на коллекциях штаммов из различных ре-
гионов бывшего СССР (Северо-Запад РФ, Белоруссия, Казахстан) и Китая
были валидированы ранее описанные специфические SNP в генах Rv0129c и
Rv3062 для детекции штаммов LAM [8 — 11]. В настоящем исследовании мы
применили комплекс молекулярных маркеров для анализа штаммов LAM в
популяции M. tuberculosis в Омской области Западной Сибири, для которой
характерен высокий уровень заболеваемости резистентным туберкулезом [1,
2], и расширили их верификацию с использованием полногеномного секве-
нирования следующего поколения: WGS (whole genome sequencing)/NGS (next
generation sequencing).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы M. tuberculosis были выделены от больных туберкулезом легких,
постоянно проживающих в Омской области. ДНК выделяли стандартным
методом с использованием SDS, протеиназы К и цетилтриметиламмонийбро-
мида для клеточного лизиса.
Сполиготипирование проводили согласно стандартному протоколу с ис-
пользованием мембраны с иммобилизованными олигонуклеотидами на 43
спейсера локуса CRISPR M. tuberculosis, изготовленной в лаборатории моле-
кулярной микробиологии НИИЭМ им. Пастера. Профили сполиготипирова-
ния сравнивали с международной базой данных SITVIT_WEB (http://www.
pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/).
Анализ однонуклеотидного полиморфизма в гене Rv0129c 309G>A, спец-
ифического для семейства LAM, проводили методом ПЦР-ПДРФ [11].
Полногеномное секвенирование проводили с использованием платфор-
мы MiSeq (Illumina), используя реагенты для получения парных прочтений
длиной по 300 нуклеотидов. Для подготовки ДНК-библиотек для секвени-
рования использовали ультразвуковую фрагментацию ДНК и применяли
набор NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs).
Первичную обработку коротких нуклеотидных прочтений (fastq файлов)
проводили с использованием программы Trimmomatic (http://www.usadellab.
org/cms/index.php?page=trimmomatic) для удаления адаптеров и нуклеотид-
ных прочтений низкого качества. Полученные файлы использовали для
выравнивания на референсный геном M. tuberculosis H37Rv (NC_000962.3)
для дальнейшего поиска геномных вариантов. Нуклеотидные прочтения вы-
равнивали на референсный геном с использованием инструмента bowtie2,
после чего для идентификации и аннотации нуклеотидных полиморфизмов
использовали утилиты SAMtools (http://samtools.sourceforge.net). Онлайн-
ресурсы Phyresse (https://bioinf.fz-borstel.de/mchips/phyresse/), TGS-TB
(https://gph.niid.go.jp/tgs-tb/) и PhyTB (http://pathogenseq.lshtm.ac.uk/
phytblive/index.php) использовали для дополнительной классификации сек-
венированных геномов.
Дополнительно штаммы LAM были типированы на наличие специфиче-
ской инсерции IS6110 в определенной позиции в гене plcA (позиция 2630571
в геноме штамма H37Rv, номер доступа 00962.3 в GenBank), которая является
маркером подгруппы внутри LAM, ранее названной LAM-RUS [6].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изученная коллекция включала 207 штаммов M. tuberculosis, выделенных
в Омской области в 2015-2016 гг. В результате сравнения полученных профи-
лей сполиготипирования с базой данных SITVIT_WEB 11 штаммов (5,3%)
было отнесено к генотипу LAM. В то же время, в результате анализа филоге-
нетического SNP в гене Rv0129c к генотипу LAM было отнесено 30 изолятов
(14,5%) (табл.). Дополнительно все 30 изолятов LAM были определены как
LAM-RUS.
Для четырех изолятов, представляющих разные типы профилей внутри
изученной выборки LAM, проведено полногеномное секвенирование с ис-
пользованием технологии следующего поколения. Таким образом были изуче-
ны: штамм SIT42 (классический прототипный профиль для семейства LAM),
штамм SIT254 с протяженным блоком делетированных спейсеров, штаммы
SIT1451 и SIT_new с усеченными профилями гибридизации при сполиготи-
пировании (табл.). Сравнение с базой сполиготипов SITVIT_WEB корректно
отнесло первый из штаммов (SIT42) к LAM, в то время как штамм SIT254 был
отнесен к семейству T5-RUS1, а для двух последних штаммов их филогенети-
ческий статус в SITVIT_WEB определен не был.
Для указанных 4 штаммов проведено полногеномное секвенирование и
полученные файлы fastq были загружены в нуклеотидный архив NCBI, проект
PRJNA401339. В результате выравнивания на референсный геном M.
tuberculosis H37Rv для каждого штамма получен перечень геномных вариантов,
включающий однонуклеотидные полиморфмзмы и короткие инсерции и де-
леции (vcf файлы). Файлы fastq и vcf были проанализированы с использова-
нием онлайн-ресурсов Phyresse, PhyTB и TGS-TB, с помощью которых была
подтверждена принадлежность всех 4 штаммов к LAM. Кроме того, следует
отметить в изученной омской выборке штамм с профилем SIT264 с протяжен-
ным блоком из 12 делетированных сигналов, отнесенный к семейству T1 в
базе SITVIT_WEB. Однако ранее нами была показана принадлежность штам-
ма с таким сполигопрофилем, выделенного в Санкт-Петербурге, к генотипу
LAM на основании полногеномного анализа [8].
ОБСУЖДЕНИЕ
Ряд предыдущих исследований штаммов M. tuberculosis генетического се-
мейства LAM показал его клиническую и/или эпидемиологическую значимость,
ассоциацию с лекарственной устойчивостью, хотя данные по повышенной ви-
рулентности этих штаммов противоречивы [3, 7]. Тем не менее, в целом это
определяет важность корректной детекции штаммов LAM на основе эволюци-
онно надежных генетических маркеров (к которым сполиготипирование от-
несено быть не может). Полученные нами результаты показывают серьезную
ограниченность правил принятия решения (decision rules), имплементирован-
ных в SITVIT_WEB и описанных в работе Demay С. et al. [5] для определения
семейства LAM. В результате применения алгоритма SITVIT_WEB значительная
часть штаммов LAM в странах бывшего СССР или относится к семейству T, или
вообще остается неопределенной (из-за крайней усеченности сполигопрофиля
(штамм с профилем SIT1451, табл.). В настоящем исследовании только 5,3%
штаммов в Омской коллекции M. tuberculosis было отнесено к LAM в результа-
те сполиготипирования, в то время как в результате применения SNP/WGS
маркеров эта цифра выросла почти в 3 раза (до 14,5%).
Технология секвенирования следующего поколения становится все более
доступной для полногеномного секвенирования патогенных бактерий, и
M. tuberculosis не является исключением. Подход на основе WGS/NGS по-
зволяет выявить незначительные различия близкородственных геновариантов
и успешно применяется как для филогеномных, так и для молекулярно-
эпидемиологических исследований. Противоположным с точки зрения дис-
криминирующей способности является классический метод сполиготипиро-
вания. Практически единственным достоинством метода является его
техническая простота и, следовательно, возможность быстрого анализа боль-
ших коллекций, а также наличие больших баз данных, собранных в результа-
те 20 лет исследований. Прежде всего следует отметить глобальную базу данных
SITVIT_WEB, созданную в Институте Пастера Гваделупы [5]. Последняя (все
еще неопубликованная) версия этой базы (SITVIT2) содержит данные по бо-
лее чем 110 000 изолятам, согласно диссертации D. Couvin [4]. Известными и
серьезными ограничениями метода сполиготипирования являются как уни-
версальные для всех бактерий (единый локус CRISPR, следовательно, не не-
зависимая эволюция спейсеров и т.о. неадекватность филогенетических по-
строений на основе сполиготипов), так и специфические для M. tuberculosis
(возможная гомоплазия как результат конвергентной эволюции, неопределен-
ность интерпретации протяженных блоков делетированных сигналов).
Глобальной проблемой анализа сполигопрофилей является и догматическое,
некритическое восприятие крупных электронных ресурсов и баз данных.
Определение семейства LAM M. tuberculosis на основании сполиготипи-
рования (в особенности профилей с протяженными блоками делетированных
сигналов, например, SIT254, SIT264, SIT1451) имеет два существенных недо-
статка, как показано в настоящем и ряде предыдущих исследований в странах
бывшего СССР. Во-первых, наличие усеченных профилей сполиготипирова-
ния (SIT1451) или профилей с длинными блоками делетированных сигналов
(SIT264, SIT254) критически уменьшает количество признаков, пригодных
для анализа, и не позволяет делать вывод о генотипе (семействе) штамма даже
если алгоритм, применяемый в SITVIT_WEB, и позволяет (хотя и ошибочно)
отнести такой штамм, например SIT254 или SIT264, к какой-либо подгруппе
внутри семейства T (прежде всего к т.н. T5-RUS1, куда отнесены эти и близкие
им производные сполиготипы в SITVIT_WEB). Во-вторых, сполиготип SIT803
представляет пример гомоплазии сполиготипов как результат конвергентной
эволюции локуса CRISPR M. tuberculosis. В частности, как показано в данном
исследовании (на основании полногеномного анализа) и в опубликованных
работах по Северо-Западу России, Казахстану и Грузии (на основании анали-
за LAM-специфических SNP и мультилокусного VNTR-анализа) [11 — 13],
штаммы SIT803 определенно относятся к семейству LAM. В то же время,
анализ китайских штаммов с таким сполиготипом не выявил у них LAM-
специфического SNP [9]. На построенной нами дендрограмме профилей
24-MIRU-VNTR 186 референс-штаммов M. tuberculosis разных генотипов
(MIRU-VNTRplus.org) и 259 типов глобальной коллекции LAM [10] китайские
штаммы SIT803 занимали положение далеко за пределами ветви LAM и рас-
полагались на периферии ветви семейства S (древо не показано). Все это под-
черкивает необходимость осторожности в интерпретации сполигопрофилей
с небольшим количеством сигналов гибридизации.
В то же время, даже в настоящее время все более широкого применения
полногеномного анализа полезно сопоставлять новые данные со все еще при-
меняемыми старыми маркерами и схемами. Не все лаборатории, особенно в
странах с ограниченными ресурсами, могут использовать NGS в качестве
рутинного подхода. Конкретно для детекции штаммов LAM может быть ре-
комендован подход, включающий (1) первичное сполиготипирование, срав-
нение с SITVIT_WEB и обязательное уточнение интерпретации профилей в
свете экспертного знания; (2) детекцию LAM-специфического SNP (напри-
мер, с помощью PCR-RFLP).

Об авторах

И. В. Мокроусов

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru

д.б.н.,

197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14

(812)233-21-49

Россия

О. А. Пасечник

Омский государственный медицинский университет

Email: fake@neicon.ru
Россия

А. А. Вязовая

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Email: fake@neicon.ru
Санкт-Петербург Россия

А. И. Блох

Омский государственный медицинский университет

Email: fake@neicon.ru
Россия

Е. Н. Черняева

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: fake@neicon.ru
Россия

В. Л. Стасенко

Омский государственный медицинский университет

Email: fake@neicon.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы