ВЫЯВЛЕНИЕ АДЕНОВИРУСНОГО АНТИГЕНА МЕТОДОМ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ГКР-ДЕТЕКЦИЕЙ СИГНАЛА

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ
Разработка чувствительных и селективных методов выявления патогенных
вирусов является важной задачей здравоохранения и вопросом национальной
безопасности. Описан ряд подходов, основанных на ГКР-детекции результа-
тов иммунохимического анализа, которые пригодны для выявления биомар-
керов в клинических образцах, имеющих сложный состав.
Особый интерес представляет проведение анализа в планшетах из поли-
стирола и использовании ГКР-детекции окисленной формы 3,3',5,5'-тетра-
метилбензидина (TMB+). Такой подход описан в работах для детекции
респираторно-синцитиального вируса [4] и изоформы тропонина Т [5] с ис-
пользованием в качестве ГКР-субстрата серебряных и золотых наночастиц
соответственно. Метод является универсальным и позволяет использовать
материальное и приборное оснащение, а также реагентную базу твердофазно-
го иммуноферментного анализа.
В связи с этим, основная задача данного исследования состояла в изучении
возможности выявления аденовирусного антигена в фекальных образцах ме-
тодом, сочетающим иммуноферментный анализ и ГКР-детекцию сигнала.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3,3',5,5'-тетраметилбензидин (Fluka), пероксидазный конъюгат монокло-
нальных антител к гексону аденовируса с протексидазой (ООО «Предприятие
по производству диагностических препаратов», антитела мышиные монокло-
нальные к аденовирусу-МАТ (ООО «Биолекса»). Для приготовления растворов
использовали деионизированную воду (Milli-Q System, Millipore, США). Для
проведения ИФА использовались прозрачные 96 луночные планшеты
(Costar).
Панель клинических образцов (n=40) от детей в возрасте до 5 лет, госпита-
лизированных в стационар с острой кишечной инфекцией, и здоровых детей.
Образцы были охарактеризованы методом мультиплексной ОТ и ПЦР-РВ на
наличие нуклеиновых кислот 8 групп кишечных вирусов человека: аденови-
русов, ротавирусов группы А, энтеровирусов, норовирусов, астровирусов,
саповирусов, ортореовирусов, ротавирусов группы С [1]. В состав панели
включены образцы 1 — 10, содержащие ДНК аденовирусов со средним значе-
нием пороговых циклов (ПЦ) равном 22,5±4,9; образцы 11 — 20 — РНК ро-
тавирусов группы А (ПЦ=16,7±3,8); образцы 21 — 30 — РНК норовирусов
(ПЦ=21,3±3,2); образцы 31 — 40, образцы, в которых нуклеиновых кислот
кишечных вирусов не выявлено.
Для получения культуральных образцов аденовирусов культуру клеток
НеLa заражали лабораторными штаммами аденовирусов человека 3 и 7 типа,
после проявления выраженного цитопатогенного действия вирусный матери-
ал трижды замораживали-оттаивали в культуральном флаконе и осветляли
низкоскоростным центрифугированием. В качестве контрольных образцов в
ИФА использовали лабораторные штаммы аденовирусов с титром 5 — 6 lg
ТЦД50/мл.
Результаты ИФА регистрировали на планшетном фотометре BioRad Model
680. Инкубацию планшет проводили на шейкере (ELMI SkyLine). Для отмыв-
ки планшет использовали вошер (BioRad PW 40). Взвешивание реактивов
производилось на весах (OHAUS Discowery). Для контроля и коррекции pH
использовали pH-метр (Mettler Toledo MP220). Центрифугирование произво-
дили на центрифуге (Thermo Scientific MicroCL 17 centrifuge). Учет результатов
ГКР-анализа проводили на спектрометре (ИнСпектр MIXSplitter, ООО
«ИнСпектр», Черноголовка).
Для получения 10% фекальных экстрактов образцы собирали в стерильные
пробирки в количестве 1 грамм. Далее вносили 10,0 мл в 0,02 М фосфатного
буферного раствора рН 7,2 (ФБР), содержащего 0,2% БСА, 0,05% Твин-20,
перемешивали. Полученную взвесь центрифугировали при 3000 об/мин в
течение 30 мин. Для выявления антигена аденовируса использовали надоса-
дочную жидкость.
Синтез наночастиц серебра в водной среде проводили методом восстанов-
ления нитрата серебра борогидридом натрия в присутствии стабилизатора для
получения дисперсии наночастиц с содержанием серебра 100 мг/л (0,9 мМ).
К 100 мл раствора стабилизатора цитрата натрия в дистиллированной воде по
каплям при перемешивании прибавляли 50 мл раствора, содержащего 0,61 г
(3,6 ммоль) нитрата серебра. Через 15 минут к смеси по каплям при интенсив-
ном помешивании добавляли 50 мл водного раствора, содержащего двукрат -
ный избыток борогидрида натрия. Изучение распределения по размерам на-
ночастиц серебра в водных дисперсиях осуществляли на анализаторе
ZetasizerNano ZS с интегрированным He-Ne лазером с мощностью 4мВ и
длиной волны 633 нм («MalvernInstruments» ltd., Великобритания). Измерение
ζ-потенциала проводили путем наложения электрического поля на кювету с
дисперсией наночастиц серебра с использованием методики, основанной на
лазерной допплеровской анемометрии.
При проведении иммуноферментного анализа в лунки 96-луночного план-
шета вносили по 100 мкл моноклональных антител в концентрации 10 мкг/мл
в ФБР. Планшеты выдерживали в течение 19 — 22 часов при температуре 4
— 8°C и на 1 час вносили блокирующий раствор ФБР, содержащий 5% саха-
розы, 0,09% казеината натрия, 0,05% Твин-20. Для проведения исследования
в лунки планшета вносили по 100 мкл исследуемых образцов. После инкуби-
рования в течение 45 минут и режиме встряхивания при 500 оборотов/мин
проводили отмывку. Далее вносили по 100 мкл конъюгированных с перокси-
дазой антител мыши к аденовирусу в разведении 1:500. Повторяли этап инку-
бирования и вносили по 100 мкл 33мМ цитратного буферного раствора рН 4,0,
содержащего 0,01% перекиси водорода и 0,5мМ 3,3',5,5'- тетраметилбензиди-
на. Через 15 минут измеряли оптическую плотность (ОП) при длине волны
490 нм. Для измерения ГКР-спектра полученную реакционную смесь в полном
объеме переносили в чистый планшет для остановки ферментативной реакции.
Далее вносили наночастицы серебра в концентрации 72 мкМ и инкубировали
в течение 10 мин. Измерение проводили с использованием лазера с длиной
волны излучения 532 нм и мощностью 30 мВт, время экспозиции составляло
2000 мс.
На основании исследования выборки отрицательных образцов было рас-
считано пороговое значение для отсечения образцов содержащих антиген
аденовируса от отрицательных, определяемое по формулам: для фотометри-
ческой детекции: ОПпорог.= ОПср.К- + 3σ; для ГКР-детекции: Iпорог.=Iср.К-
– 3σ, где ОПср.К- и Iср.К- среднее арифметическое значение регистрируемых
сигналов для отрицательных образцов, σ — стандартное отклонение.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Выявления маркеров аденовирусной инфекции в образцах лабораторных
штаммов аденовирусов и клинических образцах основывалось на твердофаз-
ном иммуноферментном анализе «сандвич типа», включающем иммобилиза-
цию антител для иммунного захвата на твердой фазе, инкубацию с исследуе-
мым образцом и детектирующими антителами, меченными пероксидазой.
Результаты ферментативной реакции пероксидазы с перекисью водорода в
присутствии 3,3',5,5'- тетраметилбензидина оценивались фотометрически или
путем измерения ГКР-спектров после добавления наночастиц серебра. В ра-
боте использовались наночастицы со средним размером 7,5 нм и ζ-потенциа-
лом —31±1 мВ.
На рис. 1. представлены результаты ГКР-анализа продуктов ферментатив-
ной реакции, показывающие, что введение в систему наночастиц серебра
существенным образом увеличивает интенсивность комбинационного рас-
сеяния в областях 900 — 100, 1500 — 1600 см-1, кроме того в области 1300 — 1400
см-1 возникает интенсивный сигнал, отсутствующий в исходном спектре.
Линии при 1177 см-1, 1337 см-1, 1600 см-1 обусловлены связями группы CH3,
связями C–C внутри бензольного кольца и совокупностью связей C–H соот-
ветственно [3]. Для оценки результатов детекции использовалась интенсив-
ность пика при 1600 см-1.
Концентрация наночастиц серебра 72 мкМ была выбрана как оптимальная,
так как снижение концентрации приводило к уменьшению сигнала, а увели-
чение — к снижению воспроизводимости. Наночастицы серебра сохраняли
стабильность по крайней мере в течение 4 месяцев.
Разработку методики проводили на культуральных образцах, содержащих
аденовирус. На рис. 2 изображена зависимость интенсивности ГКР-спектров
от концентрации исследуемого антигена. По результатам была получена об-
ратная зависимость, и уменьшение концентрации аденовируса приводило к
увеличению интенсивности ГКР-сигнала. В диапазоне рабочих разведений
1:1 — 1:64 образца, содержащего аденовирус, была получена полиноминальная
зависимость интенсивности сигнала от количества аналита с коэффициентом
детерминации 0,997. Коэффициент вариации (КВ, %) находился в пределах
10 — 12% при ГКР-детекции и 7 — 8% для фотометрического метода.
В табл. представлены данные по определению антигена аденовируса в
фекальных экстрактах. Для дифференциальной диагностики на основании
исследования образцов, не содержащих аденовирус (№ 31 — 40), было уста-
новлено пороговое значение интенсивности сигнала с учетом обратной за-
висимости. Также было проведено исследование специфичности на образцах,
содержащих другие вирусные антигены.
ОБСУЖДЕНИЕ
Была показана сходимость результатов при определении аденовируса тре-
мя методами (табл.): твердофазным ИФА с классической фотометрической
детекцией, ГКР-детекцией сигнала и методом ПЦР на панели клинических
образцов, содержащих аденовирус, ротавирус и норовирус, а также на образцах
здоровых детей.
Следует отметить, что возможность использования ГКР-спектров окис-
ленной формы 3,3',5,5'-тетраметилбензидина обсуждается в ряде работ.
Описанные разными авторами данные с использованием наночастиц серебра
весьма противоречивы, получены для разного состава анализируемых образ-
цов и вызывают много вопросов. Полученные нами результаты также отлича-
ются от приведенных в работах [3, 4]. Так, в работе [3] авторы пытаются до-
казать пероксидазо-подобные свойства наночастиц серебра и их способность
разлагать перекись водорода и соответственно ставят под сомнение исполь-
зование наночастиц серебра в качестве ГКР-субстрата в присутствии пере-
киси водорода. Авторы [4], напротив, демонстрируют результаты, указываю-
щие на успешное использование ГКР-спектров окисленной формы
3,3',5,5'-тетраметилбензидина в присутствии наночастиц серебра для детекции
респираторно-синцитиального вируса. Однако отличием является ход зави-
симости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации определяемого ана-
лита. Так, на рис. 2 мы представили данные, показывающие обратную зави-
симость интенсивности ГКР-сигнала от концентрации определяемого
аналита, тогда как в работе [4] эта зависимость является прямой.
Для разрешения этих противоречий нами были проведены дополнитель-
ные исследования. Так, для изучения возможности использования наночастиц
серебра в качестве ГКР-субстрата в присутствии перекиси водорода были по-
лучены ГКР-спектры малахитового зеленого в тех же условиях в отсутствии и
присутствии перекиси водорода в концентрации, соответствующей субстрат-
ной буферной смеси. Отсутствие различия в интенсивности основных пиков
при 1171, 1288, 1359 и 1614 см-1 указывает на тот факт, что в условиях экспе-
римента перекись водорода не влияла на ГКР-свойства наночастиц серебра.
Далее необходимо отметить, что при изучении зависимости интенсивности
ГКР-сигнала от концентрации определяемого аналита в широком диапазоне
концентраций нами была получена колоколообразная зависимость: при низ-
ких концентрациях аналита наблюдался рост сигнала при увеличении кон-
центрации аналита, затем зависимость меняла свой ход. Подобная картина
делает затруднительным обоснование порогового значения интенсивности
сигнала при исследовании образцов, содержащих и не содержащих аналит.
При проведении экспериментов по выявлению аденовируса были подобраны
условия, позволяющие определять аналит в широком диапазоне концен-
трации.
Колоколообразную зависимость можно объяснить, основываясь на тех
фактах, что для получения интенсивного ГКР-сигнала необходима агрегация
наночастиц. Такая агрегация наблюдается в присутствие солей [2], а также
окисленной формы ТМБ [4]. Однако в соответствии с литературными и на-
шими данными усиление ГКР в присутствии солей зависит от их концентра-
ции, и при превышении оптимальной концентрации наблюдается снижение
сигнала, сопровождающее необратимое разрушение золя серебра. Мы пред-
полагаем, что накопление окисленной формы ТМБ аналогичным образом
влияет на агрегацию отрицательно заряженных наночастиц серебра и соот-
ветственно на интенсивность ГКР-сигнала.
Таким образом, на основании полученных данных показана возможность
высокоспецифичного выявления аденовируса в сложных биологических об-
разцах с использованием окисленной формы ТМБ и наночастиц серебра в
качестве ГКР-репортера и ГКР-субстрата соответственно.

Об авторах

А. М. Кудряшова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

А. Г. Галстян

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Е. Б. Файзулоев

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

А. Ю. Оленин

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Г. В. Лисичкин

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

В. В. Зверев

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

О. В. Борисова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru

к.х.н.,

105064, Москва, М. Казенный пер., 5а

(495)674-54-97

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы