ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОЛИ ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ БЕШЕНСТВА КЛЕТОК ЛИНИИ VERO С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Экспериментальное обоснование возможности определения в культуре доли инфицированных вирусом бешенства клеток линии Vero с использованием проточной цитометрии (ПЦ) и диагностического антирабического иммуноглобулина (ДАИ), меченного ФИТЦ (ВНИИЗЖ, г. Владимир). Материалы и методы. Фиксацию и пермебиализацию клеток Vero, инфицированных вирусом бешенства «Москва 3253», проводили с помощью реагента Суtofix/Cytoperm (BD Biosciences, USA) по методу Vengatesan D. et al. (2006). и внутриклеточный антиген окрашивали ДАИ. Процент инфицированных клеток определяли с помощью ПЦ через 24, 48 и 72 ч., а также через 48 ч при инфицировании клеточных культур десятикратными разведениями вируссодержащей жидкости от 10-1 до 10-8.. Результаты. Доля инфицированных клеток возрастала в промежутке времени от 24 до 48 ч в среднем с 30 до 70%. При добавлении к клеткам вируссодержащей жидкости в разведении 10-3 методом ПЦ обнаружено 6,9 ± 0,21 % инфицированных клеток Vero (P<0,001, n=3). Заключение. ПЦ проявила себя как быстрый, чувствительный и надёжный метод определения относительного числа инфицированных вирусом бешенства клеток Vero. Препарат ДАИ обладал активностью, достаточной для его эффективного использования в автоматизированном варианте постановки МФА на базе метода ПЦ. Использование ПЦ возможно на различных этапах производства и контроля антирабических препаратов, а также перспективно с точки зрения дальнейшего совершенствования диагностики бешенства.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ
Вирус бешенства, относящийся к семейству Rhabdoviridae и роду Lyssavirus,
вызывает у человека и животных опасное инфекционное заболевание, нано-
сящее ущерб экономике и здравоохранению. На территории Российской
Федерации с 1 января 2015 г. действует межгосударственный стандарт диа-
гностики бешенства, согласно которому выделение вируса осуществляют в
культуре клеток мышиной нейробластомы. Детекцию вируса бешенства в
инфицированных клетках (ИК) проводят методом флуоресцирующих антител
(МФА), и результат учитывают с помощью люминесцентной микроскопии.
Указанная схема лабораторной диагностики бешенства представляет собой
альтернативу биопробе на белых мышах [2]. Люминесцентную микроскопию
широко используют также для определения активности вируса и антирабиче-
ских сывороток в тестах in vitro, подразумевающих использование клеточных
культур и рекомендуемых Всемирной Организацией Здравоохранения и
Всемирной Организацией по охране здоровья животных [14, 15].
Однако классический вариант постановки МФА с использованием люми-
несцентной микроскопии характеризуется длительностью, трудоёмкостью и
субъективностью. Он не способен точно определять относительное число
инфицированных вирусами клеток, в отличие от автоматизированного вари-
анта количественной оценки реакции иммунофлуоресценции на основе тех-
нологии импульсной проточной цитометрии (ПЦ) [10, 14]. Применение ПЦ
в микробиологии — это путь к дальнейшему совершенствованию диагности-
ки инфекционных болезней [4, 6], и в зарубежной печати имеются сообщения
о детекции с помощью ПЦ вируса бешенства в культурах клеток мышиной
нейробластомы (MNA), почки сирийского хомяка (ВНК-21) и глиомы крыс
(С6) [7, 14]. Клетки почечного эпителия зелёной мартышки (Vero) нашли при-
менение для обнаружения методом ПЦ опасных для людей вирусов Эбола [8],
Денге [12] и Зика [9], но не для детекции в них вируса бешенства.
Тем не менее, перевиваемую клеточную линию Vero успешно используют
для культивирования вируса бешенства в России [3], где ПЦ для обнаружения
вирусов в инфицированных клеточных культурах еще не применялась. На
сегодняшний день отсутствует также информация о возможности использо-
вания выпускаемых в России препаратов диагностических антирабических
флуоресцирующих антител в автоматизированном варианте постановки МФА
на базе ПЦ анализа.
Целью настоящей работы явилось экспериментальное обоснование воз-
можности определения в культуре доли инфицированных вирусом бешенства
клеток линии Vero с использованием ПЦ и выпускаемого в России диагности-
ческого флуоресцирующего антирабического иммуноглобулина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали клеточную линию Vero, полученную из коллекции
ООО «Биолот» (Санкт-Петербург), а также аттенуированный штамм вируса
бешенства «Москва 3253», полученный из коллекции Научного центра экс-
пертизы средств медицинского применения (Москва). Клетки Vero культиви-
ровали на среде Игла МЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого
скота («Биолот», Россия). Инфекционный титр вируса для клеточной линии
Vero предварительно определяли на 96-луночных планшетах. В каждую лунку
c серийными четырехкратными разведениями вируссодержащей суспензии
добавляли по 100 мкл среды, содержащей 1,2 — 2,0 х 104 клеток Vero. Клетки
инкубировали с вирусом в течение 48 ч при 37°С в 5% СО2, затем фиксирова-
ли ацетоном и окрашивали меченным ФИТЦ диагностическим антирабиче-
ским иммуноглобулином (ВНИИЗЖ, г. Владимир). По результатам учёта
фокусов флуоресценции с помощью люминесцентного микроскопа «Микромед
И-ЛЮМ» определяли инфицирующую дозу (ИД50) [1].
Для цитофлуориметрического анализа клетки Vero, предварительно вы-
ращенные в культуральных флаконах с площадью ростовой поверхности 25
см2 до состояния конфлюэнтного монослоя, открепляли от поверхности фла-
кона и ресуспендировали в 5 мл питательной среды, к которой добавляли
вирус в исходной дозе 0,3±0,11 lg ИД50 на клетку. Далее исследовали динами-
ку репродукции вируса бешенства в условиях in vitro путем сбора клеток через
24, 48 и 72 ч культивирования. В качестве контроля использовали интактную
клеточную культуру. В следующем эксперименте к клеткам добавляли деся-
тикратные разведения исследуемой вируссодержащей жидкости в пределах от
10-1 до 10-8. Накопление вируса в клетках оценивали через 48 ч после инфи-
цирования клеточной культуры.
Фиксацию и пермебиализацию клеток проводили с помощью набора
Суtofix/Cytoperm (BD Biosciences, USA) по методу, разработанному Vengate -
san D. et al. [14] для детекции вируса бешенства с помощью ПЦ в ИК мышиной
нейробластомы. Иммунофлуоресцентное окрашивание антигена в клеточной
цитоплазме осуществляли конъюгированным с ФИТЦ диагностическим анти-
рабическим иммуноглобулином. Для исследований методом ПЦ использова-
ли рабочее разведение указанного диагностического препарата, аналогичное
используемому разведению в экспериментах с применением люминесцентной
микроскопии и соответствующее рекомендациям производителя.
Образцы анализировали со скоростью около 500 клеток в секунду на ПЦ
СyAn ADP DakoCytomation c аргоновым лазером мощностью 20 mW при дли-
не волны эмиссии 488 нм. При создании протокола анализа с использовани-
ем программного обеспечения Summit 4.3 Built 2445 настройки устанавливали
таким образом, чтобы на цитограммах по параметрам интенсивности прямо-
го (FS) и бокового (SS) светорассеяния неповреждённые живые клетки Vero
отличались от клеточного дебриса и погибших клеток с характерными изме-
нениями клеточного размера и внутриклеточной структуры [5]. Область ин-
тенсивности флуоресценции, соответствующую ИК, идентифицировали в
окне Dot Plot SS/FITC FL [14] путём повышения высоковольтного напряже-
ния на фотодетекторе до величины 340 В. Значения интенсивности флуорес-
ценции в данной области составили более 10 условных единиц (каналов). Долю
ИК определяли как процентное отноше-
ние числа клеток, зарегистрированных в
этой области, к общему числу исследован-
ных клеточных элементов. Более того, из
частотных распределений отдельных кле-
ток по интенсивности их специфической
иммунофлуоресценции оценивали в об-
ласти, соответствующей ИК, среднюю
внутриклеточную вирусную нагрузку
(Mean) в используемых условных еди-
ницах измерения и определяли коэффи-
циент вариации (CV, в %), отражающий
степень неоднородности фракции ИК по
данному параметру [7, 10].
Статистический анализ результатов
проводили общепринятыми методами
[1].
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 в виде цитограммы представ-
лено характерное распределение отдель-
ных клеток Vero по объёму (прямое свето-
рассеяние, Forward Scatter (FS) и по
степени внутриклеточной гранулярности
(боковое светорассеяние, Side Scatter (SS)
в инфицированной вирусом культуре.
Результат анализа получен через 72 ч ин-
кубации, когда инфицированные культу-
ры были максимально неоднородны по
исследуемым клеточным показателям. На
цитограмме выделены три характерные
области: эллипсовидная область R1, соответствующая нормальным клеткам
с исходными морфологическими параметрами; область регистрации погибших
клеток с признаками апоптоза и некроза (R4); область, где по значению пара-
метра SS учитывались клетки с повышенной степенью внутриклеточной гра-
нулярности (R5). Статистический анализ цитограмм показал, что к 72 ч раз-
вития инфекции в условиях in vitro штамм фиксированного вируса бешенства
повреждал не более 20% клеток Vero (18,6±0,6%, при значении показателя в
контроле 2,9±0,3%, P<0,001, при n=3). Еще слабее повреждающий эффект
вируса в культурах клеток линии Verо был через 48 ч (7,8±1,2%, P<0,05) и от-
сутствовал на ранней стадии инфицирования, поскольку к 24 ч достоверных
различий с контролем по числу погибших клеток не было зарегистрировано.
Число клеток с повышенной степенью гранулярности в инфицированных
вирусом культурах увеличивалось к 72 ч инкубации до 10,3±1,1% относитель-
но исходного показателя 3,7±0,9% (P<0,05) в кон троле.
Иммунофлуоресцентный анализ больших статистических выборок от-
дельных клеток Vero в инфицированных вирусом культурах проводили в усло-
виях автоматического гейтирования гистограмм по области R1 (G1:R1). То
есть, детекцию вируса бешенства мы проводили только в живых, ещё непо-
вреждённых клетках линии Vero, попадающих по параметрам светорассеяния
в элипсовидную область R1. Гистограмма, представленная на рис. 2 В, иллю-
стрирует факт присутствия в культуре как инфицированных клеток в количе-
стве 33,98% (в области R2), так и не инфицированных вирусом бешенства
клеточных элементов. При исследовании контрольных проб, не содержащих
инфицированные вирусом клетки Vero, характерный пик ИК в области R2
отсутствовал (рис. 2 А).
Для всех контрольных образцов в наших исследованиях был характерен
стабильно очень низкий уровень подсчёта фоновых сигналов флуоресценции
в области R2 не более 2% (1,1±0,45%, при n=10). Аналогичные значения дан-
ного показателя (0,9±0,27%, P>0,05) имели место при анализе чистых проб с
физиологическим раствором или деионизованной водой, когда из проточной
системы прибора потоком жидкости в небольшом количестве смывались ранее
адсорбированные в ней окрашенные клетки.
Через 24, 48 и 72 ч в инфицированных культурах регистрировали выражен-
ные достоверные различия по относительному содержанию ИК: соответствен-
но 29,5±1,7%, 70,4±2,0 % и 88,3±1,3% (P<0,001, n=3). Хотя к 24 ч инкубации
доля ИК была минимальна, именно в этот срок мы регистрировали самую
высокую среднюю (Mean) вирусную нагрузку на ИК (73,5±1,3 усл. ед. интен-
сивности специфической иммунофлуоресценции), а также максимальные
значения коэффициента вариации (CV) по данному параметру, равные
115,6±0,8%. Для двухсуточных культур данные показатели были в 1,5 раза
ниже — соответственно 51,4±1,6 усл. ед. и 72,3±0,5% (P<0,001). К 72 ч снова
отмечали увеличение вирусной нагрузки на ИК до 66,2±0,8 усл. ед., а также
значений CV до 86,1±1,4% (P<0,05). Факт присутствия специфического анти-
гена в ИК подтверждали результаты люминесцентной микроскопии через 24,
48 и 72 ч (данные не представлены). Однако традиционный вариант МФА не
позволял определять процентное содержание ИК в популяции. С его помощью
проведение количественного мониторинга указанного показателя в процессе
культивирования не представляется возможным.
Детекцию вируса бешенства в клетках линии Vero ПЦ анализ обеспечивал
в наших исследованиях при 1000-кратном снижении исходной инфициру -
ющей дозы. Доля ИК была в этом случае 6,9±0,21% (P<0,001 при n=3). При
повышенных исходных вирусных нагрузках 1/100 и 1/10 относительное коли-
чество ИК в двухсуточных культурах увеличивалось соответственно до 38,5±1,5
и 67,2±0,8%. При дальнейших десятикратных снижениях исходной инфици-
рующей дозы метод ПЦ уже не выявлял вирус бешенства в клетках линии Vero
через 48 ч инкубации. Чувствительность классического варианта постановки
МФА также позволяла детектировать вирус в клетках Vero при 1000-кратном
снижении исходной инфицирующей дозы. Однако в полях зрения люминес-
центного микроскопа можно было наблюдать в этом случае только единичные
специфически флуоресцирующие клетки.
ОБСУЖДЕНИЕ
Автоматизация и стандартизация МФА на базе ПЦ технологии [13] по-
зволяет повысить эффективность диагностики инфекционных болезней че-
ловека и животных [4, 6], что уже убедительно доказано в зарубежных иссле-
дованиях на примерах детекции различных вирусов, в том числе и вируса
бешенства [7, 10, 12, 14]. В настоящей работе впервые на модели клеток линии
Vero и штамма фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в России
получены результаты, подтверждающие высокую эффективность использо-
вания ПЦ как инструмента для мониторинга изменений относительного ко-
личества инфицированных вирусами клеток в клеточных культурах, а также
установлен характер этих изменений в зависимости от исходной вирусной
нагрузки и срока инкубации.
Накопление вируса бешенства при его культивировании in vitro зависит
от выбора клеточной культуры [11]. С помощью ПЦ установлены различия
при исследовании репродукции вируса в культурах клеток MNA и ВНК-21.
Инфицирование вирусом бешенства более 70% клеток ВНК-21 имело место
только после 72 ч [7], в то время как в культурах MNA доля ИК резко увели-
чивалась до 75% уже к 48 ч инкубации [14]. Результаты наших исследований
свидетельствуют, что в клетках линии Vero вирус бешенства размножается
также быстро, как и в клетках MNA. Поэтому с точки зрения чувствительно-
сти детекции вируса в клеточных культурах и, как следствие, диагностики
бешенства использование клеток Vero представляется не менее эффективным,
чем клеток мышиной нейробластомы.
Наиболее интенсивное образование новых вирусных частиц в ИК линии
Vero регистрировали с помощью ПЦ через 24 ч, при этом изменения значений
показателей Mean и CV носили циклический характер. Увеличение числа по-
вреждённых и структурно изменённых клеток с аномальными морфологиче-
скими характеристиками к 72 ч инкубации указывает, вероятно, на усиление
в этот срок процесса выхода вируса во внеклеточное пространство.
Аттенуированный вирус бешенства оказывал на клетки Vero слабый цитопа-
тический эффект, что согласуется с литературными данными [14, 15].
На наш взгляд, определение методом ПЦ относительного содержания
клеток, инфицированных вирусом бешенства, позволит повысить точность и
эффективность анализов при определении активности вируса и уровня ней-
трализующих антирабических антител в сыворотках крови людей и животных,
что откроет новые возможности в совершенствовании диагностики бешенства.
Препарат диагностического антирабического флуоресцирующего иммуногло-
булина, созданный в России для классического варианта МФА с использова-
нием люминесцентной микроскопии, обладает по нашим данным достаточной
активностью для его эффективного применения в автоматическом (импульс-
ном) режиме количественного измерения интенсивности клеточной имму-
нофлуоресценции. Получение точной информации об особенностях культи-
вирования вируса, основанной на результатах количества ИК в культуре, в
дальнейшем позволит использовать ПЦ на этапах производства и контроля
разрабатываемых и выпускаемых в России антирабических препаратов [3].
×

Об авторах

А. Л. Кравцов

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru

д.б.н.,

410005, Саратов, ул. Университетская, 46

(8452)26-21-31

Россия

С. В. Генералов

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Email: fake@neicon.ru
Саратов Россия

В. А. Кожевников

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Email: fake@neicon.ru
Саратов Россия

Ю. К. Гаврилова

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Email: fake@neicon.ru
Саратов Россия

Е. Г. Абрамова

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Email: fake@neicon.ru
Саратов Россия

А. В. Кочкин

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Email: fake@neicon.ru
Саратов Россия

А. К. Никифоров

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Email: fake@neicon.ru
Саратов Россия

Список литературы

  1. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962.
  2. ГОСТ 26075-2013 Животные. Методы лабораторной диагностики бешенства. М., Стандартинформ, 2014.
  3. Генералов С.В., Абрамова Е.Г., Матвеева Ж.В., Жулидов И.М., Лобовикова О.А., Свинцов Р.А., Комиссаров А.В., Киреев М.Н., Никифоров А.К. Культуральный антиген в технологии получения антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади. Проблемы особо опасных инфекций. 2012, 4 (114): 65-68.
  4. Кравцов А.Л. Совершенствование диагностики инфекционных болезней, связанное с использованием технологии импульсной проточной цитометрии. Биотехнология. 2013, 3: 8-23.
  5. Сибиряк С.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях. В: Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение. Челябинск, 2008.
  6. Alvarez-Barrientos A., Arroyo J., Canon A.R. et al. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin. Microbiol. Rev. 2000, 13 (2): 167-195.
  7. Bordignon J., Ferreira S., Caporale G. et al. Flow cytometry assay for intracellular rabies virus detection. J. Virol. Methods. 2002, 105 (1): 181-186.
  8. Halfmann P., Kim J. H., Eblhara H. et al. Generation of biologically contained Ebola viruses. PNAS. 2008, 105 (4): 1129-1133.
  9. Hanners N.W., Eitson J.L., Usui N. Western Zika virus in human fetal neural progenitors persists long term with partial cytopathic and limited immunogenic effects. Cell Reports. 2016, 15 (11): 2315-2374.
  10. McSharry J.J. Detection and quantitation of human immunodeficiency virus-infected peripheral blood mononuclear cells by flow cytometry. J. Clin. Microbiol. 1990, 28: 724-733.
  11. Rudd R. J., Trimarchi C.V. Comparison of sensitivity of BHK21 cells and murine neuroblastoma cells in the isolation of a street strain rabies virus. J. Clin. Microdiol. 1987, 25: 1456-1458.
  12. Sydow F., Santiago M.A., Neves-Souza P.C. et al. Comparison of Dengue infection in human mononuclear leukocytes with mosquito C6/36 and mammalian Vero cells using flow cytometry to detect virus antigen. Memento Instituo Oswaldo Cruz. 2000, 5:483-489.
  13. Steen H.B., Boye E., Starsted K. et al. Applications of flow cytometry on bacteria: Cell cycle kinetics, drug effects and antibody binding. Cytometry, 1982, 2 (4): 249-256.
  14. Vengatesan D., Raj G.D., Raja A. et al. Detection of rabies virus antigen or antibody using flow cytometry. Cytometry. 2006, 70B (5): 335-343.
  15. Woldeheiwet Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clin. Chem. Acta. 2005, 351: 49-63.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Кравцов А.Л., Генералов С.В., Кожевников В.А., Гаврилова Ю.К., Абрамова Е.Г., Кочкин А.В., Никифоров А.К., 2018

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах