DETERMINATION OF THE RABIES VIRUS-INFECTED VERO LINE CELL PORTION BY FLOW CYTOMETRY

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Вирус бешенства, относящийся к семейству Rhabdoviridae и роду Lyssavirus,
вызывает у человека и животных опасное инфекционное заболевание, нано-
сящее ущерб экономике и здравоохранению. На территории Российской
Федерации с 1 января 2015 г. действует межгосударственный стандарт диа-
гностики бешенства, согласно которому выделение вируса осуществляют в
культуре клеток мышиной нейробластомы. Детекцию вируса бешенства в
инфицированных клетках (ИК) проводят методом флуоресцирующих антител
(МФА), и результат учитывают с помощью люминесцентной микроскопии.
Указанная схема лабораторной диагностики бешенства представляет собой
альтернативу биопробе на белых мышах [2]. Люминесцентную микроскопию
широко используют также для определения активности вируса и антирабиче-
ских сывороток в тестах in vitro, подразумевающих использование клеточных
культур и рекомендуемых Всемирной Организацией Здравоохранения и
Всемирной Организацией по охране здоровья животных [14, 15].
Однако классический вариант постановки МФА с использованием люми-
несцентной микроскопии характеризуется длительностью, трудоёмкостью и
субъективностью. Он не способен точно определять относительное число
инфицированных вирусами клеток, в отличие от автоматизированного вари-
анта количественной оценки реакции иммунофлуоресценции на основе тех-
нологии импульсной проточной цитометрии (ПЦ) [10, 14]. Применение ПЦ
в микробиологии — это путь к дальнейшему совершенствованию диагности-
ки инфекционных болезней [4, 6], и в зарубежной печати имеются сообщения
о детекции с помощью ПЦ вируса бешенства в культурах клеток мышиной
нейробластомы (MNA), почки сирийского хомяка (ВНК-21) и глиомы крыс
(С6) [7, 14]. Клетки почечного эпителия зелёной мартышки (Vero) нашли при-
менение для обнаружения методом ПЦ опасных для людей вирусов Эбола [8],
Денге [12] и Зика [9], но не для детекции в них вируса бешенства.
Тем не менее, перевиваемую клеточную линию Vero успешно используют
для культивирования вируса бешенства в России [3], где ПЦ для обнаружения
вирусов в инфицированных клеточных культурах еще не применялась. На
сегодняшний день отсутствует также информация о возможности использо-
вания выпускаемых в России препаратов диагностических антирабических
флуоресцирующих антител в автоматизированном варианте постановки МФА
на базе ПЦ анализа.
Целью настоящей работы явилось экспериментальное обоснование воз-
можности определения в культуре доли инфицированных вирусом бешенства
клеток линии Vero с использованием ПЦ и выпускаемого в России диагности-
ческого флуоресцирующего антирабического иммуноглобулина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали клеточную линию Vero, полученную из коллекции
ООО «Биолот» (Санкт-Петербург), а также аттенуированный штамм вируса
бешенства «Москва 3253», полученный из коллекции Научного центра экс-
пертизы средств медицинского применения (Москва). Клетки Vero культиви-
ровали на среде Игла МЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого
скота («Биолот», Россия). Инфекционный титр вируса для клеточной линии
Vero предварительно определяли на 96-луночных планшетах. В каждую лунку
c серийными четырехкратными разведениями вируссодержащей суспензии
добавляли по 100 мкл среды, содержащей 1,2 — 2,0 х 104 клеток Vero. Клетки
инкубировали с вирусом в течение 48 ч при 37°С в 5% СО2, затем фиксирова-
ли ацетоном и окрашивали меченным ФИТЦ диагностическим антирабиче-
ским иммуноглобулином (ВНИИЗЖ, г. Владимир). По результатам учёта
фокусов флуоресценции с помощью люминесцентного микроскопа «Микромед
И-ЛЮМ» определяли инфицирующую дозу (ИД50) [1].
Для цитофлуориметрического анализа клетки Vero, предварительно вы-
ращенные в культуральных флаконах с площадью ростовой поверхности 25
см2 до состояния конфлюэнтного монослоя, открепляли от поверхности фла-
кона и ресуспендировали в 5 мл питательной среды, к которой добавляли
вирус в исходной дозе 0,3±0,11 lg ИД50 на клетку. Далее исследовали динами-
ку репродукции вируса бешенства в условиях in vitro путем сбора клеток через
24, 48 и 72 ч культивирования. В качестве контроля использовали интактную
клеточную культуру. В следующем эксперименте к клеткам добавляли деся-
тикратные разведения исследуемой вируссодержащей жидкости в пределах от
10-1 до 10-8. Накопление вируса в клетках оценивали через 48 ч после инфи-
цирования клеточной культуры.
Фиксацию и пермебиализацию клеток проводили с помощью набора
Суtofix/Cytoperm (BD Biosciences, USA) по методу, разработанному Vengate -
san D. et al. [14] для детекции вируса бешенства с помощью ПЦ в ИК мышиной
нейробластомы. Иммунофлуоресцентное окрашивание антигена в клеточной
цитоплазме осуществляли конъюгированным с ФИТЦ диагностическим анти-
рабическим иммуноглобулином. Для исследований методом ПЦ использова-
ли рабочее разведение указанного диагностического препарата, аналогичное
используемому разведению в экспериментах с применением люминесцентной
микроскопии и соответствующее рекомендациям производителя.
Образцы анализировали со скоростью около 500 клеток в секунду на ПЦ
СyAn ADP DakoCytomation c аргоновым лазером мощностью 20 mW при дли-
не волны эмиссии 488 нм. При создании протокола анализа с использовани-
ем программного обеспечения Summit 4.3 Built 2445 настройки устанавливали
таким образом, чтобы на цитограммах по параметрам интенсивности прямо-
го (FS) и бокового (SS) светорассеяния неповреждённые живые клетки Vero
отличались от клеточного дебриса и погибших клеток с характерными изме-
нениями клеточного размера и внутриклеточной структуры [5]. Область ин-
тенсивности флуоресценции, соответствующую ИК, идентифицировали в
окне Dot Plot SS/FITC FL [14] путём повышения высоковольтного напряже-
ния на фотодетекторе до величины 340 В. Значения интенсивности флуорес-
ценции в данной области составили более 10 условных единиц (каналов). Долю
ИК определяли как процентное отноше-
ние числа клеток, зарегистрированных в
этой области, к общему числу исследован-
ных клеточных элементов. Более того, из
частотных распределений отдельных кле-
ток по интенсивности их специфической
иммунофлуоресценции оценивали в об-
ласти, соответствующей ИК, среднюю
внутриклеточную вирусную нагрузку
(Mean) в используемых условных еди-
ницах измерения и определяли коэффи-
циент вариации (CV, в %), отражающий
степень неоднородности фракции ИК по
данному параметру [7, 10].
Статистический анализ результатов
проводили общепринятыми методами
[1].
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 в виде цитограммы представ-
лено характерное распределение отдель-
ных клеток Vero по объёму (прямое свето-
рассеяние, Forward Scatter (FS) и по
степени внутриклеточной гранулярности
(боковое светорассеяние, Side Scatter (SS)
в инфицированной вирусом культуре.
Результат анализа получен через 72 ч ин-
кубации, когда инфицированные культу-
ры были максимально неоднородны по
исследуемым клеточным показателям. На
цитограмме выделены три характерные
области: эллипсовидная область R1, соответствующая нормальным клеткам
с исходными морфологическими параметрами; область регистрации погибших
клеток с признаками апоптоза и некроза (R4); область, где по значению пара-
метра SS учитывались клетки с повышенной степенью внутриклеточной гра-
нулярности (R5). Статистический анализ цитограмм показал, что к 72 ч раз-
вития инфекции в условиях in vitro штамм фиксированного вируса бешенства
повреждал не более 20% клеток Vero (18,6±0,6%, при значении показателя в
контроле 2,9±0,3%, P<0,001, при n=3). Еще слабее повреждающий эффект
вируса в культурах клеток линии Verо был через 48 ч (7,8±1,2%, P<0,05) и от-
сутствовал на ранней стадии инфицирования, поскольку к 24 ч достоверных
различий с контролем по числу погибших клеток не было зарегистрировано.
Число клеток с повышенной степенью гранулярности в инфицированных
вирусом культурах увеличивалось к 72 ч инкубации до 10,3±1,1% относитель-
но исходного показателя 3,7±0,9% (P<0,05) в кон троле.
Иммунофлуоресцентный анализ больших статистических выборок от-
дельных клеток Vero в инфицированных вирусом культурах проводили в усло-
виях автоматического гейтирования гистограмм по области R1 (G1:R1). То
есть, детекцию вируса бешенства мы проводили только в живых, ещё непо-
вреждённых клетках линии Vero, попадающих по параметрам светорассеяния
в элипсовидную область R1. Гистограмма, представленная на рис. 2 В, иллю-
стрирует факт присутствия в культуре как инфицированных клеток в количе-
стве 33,98% (в области R2), так и не инфицированных вирусом бешенства
клеточных элементов. При исследовании контрольных проб, не содержащих
инфицированные вирусом клетки Vero, характерный пик ИК в области R2
отсутствовал (рис. 2 А).
Для всех контрольных образцов в наших исследованиях был характерен
стабильно очень низкий уровень подсчёта фоновых сигналов флуоресценции
в области R2 не более 2% (1,1±0,45%, при n=10). Аналогичные значения дан-
ного показателя (0,9±0,27%, P>0,05) имели место при анализе чистых проб с
физиологическим раствором или деионизованной водой, когда из проточной
системы прибора потоком жидкости в небольшом количестве смывались ранее
адсорбированные в ней окрашенные клетки.
Через 24, 48 и 72 ч в инфицированных культурах регистрировали выражен-
ные достоверные различия по относительному содержанию ИК: соответствен-
но 29,5±1,7%, 70,4±2,0 % и 88,3±1,3% (P<0,001, n=3). Хотя к 24 ч инкубации
доля ИК была минимальна, именно в этот срок мы регистрировали самую
высокую среднюю (Mean) вирусную нагрузку на ИК (73,5±1,3 усл. ед. интен-
сивности специфической иммунофлуоресценции), а также максимальные
значения коэффициента вариации (CV) по данному параметру, равные
115,6±0,8%. Для двухсуточных культур данные показатели были в 1,5 раза
ниже — соответственно 51,4±1,6 усл. ед. и 72,3±0,5% (P<0,001). К 72 ч снова
отмечали увеличение вирусной нагрузки на ИК до 66,2±0,8 усл. ед., а также
значений CV до 86,1±1,4% (P<0,05). Факт присутствия специфического анти-
гена в ИК подтверждали результаты люминесцентной микроскопии через 24,
48 и 72 ч (данные не представлены). Однако традиционный вариант МФА не
позволял определять процентное содержание ИК в популяции. С его помощью
проведение количественного мониторинга указанного показателя в процессе
культивирования не представляется возможным.
Детекцию вируса бешенства в клетках линии Vero ПЦ анализ обеспечивал
в наших исследованиях при 1000-кратном снижении исходной инфициру -
ющей дозы. Доля ИК была в этом случае 6,9±0,21% (P<0,001 при n=3). При
повышенных исходных вирусных нагрузках 1/100 и 1/10 относительное коли-
чество ИК в двухсуточных культурах увеличивалось соответственно до 38,5±1,5
и 67,2±0,8%. При дальнейших десятикратных снижениях исходной инфици-
рующей дозы метод ПЦ уже не выявлял вирус бешенства в клетках линии Vero
через 48 ч инкубации. Чувствительность классического варианта постановки
МФА также позволяла детектировать вирус в клетках Vero при 1000-кратном
снижении исходной инфицирующей дозы. Однако в полях зрения люминес-
центного микроскопа можно было наблюдать в этом случае только единичные
специфически флуоресцирующие клетки.
ОБСУЖДЕНИЕ
Автоматизация и стандартизация МФА на базе ПЦ технологии [13] по-
зволяет повысить эффективность диагностики инфекционных болезней че-
ловека и животных [4, 6], что уже убедительно доказано в зарубежных иссле-
дованиях на примерах детекции различных вирусов, в том числе и вируса
бешенства [7, 10, 12, 14]. В настоящей работе впервые на модели клеток линии
Vero и штамма фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в России
получены результаты, подтверждающие высокую эффективность использо-
вания ПЦ как инструмента для мониторинга изменений относительного ко-
личества инфицированных вирусами клеток в клеточных культурах, а также
установлен характер этих изменений в зависимости от исходной вирусной
нагрузки и срока инкубации.
Накопление вируса бешенства при его культивировании in vitro зависит
от выбора клеточной культуры [11]. С помощью ПЦ установлены различия
при исследовании репродукции вируса в культурах клеток MNA и ВНК-21.
Инфицирование вирусом бешенства более 70% клеток ВНК-21 имело место
только после 72 ч [7], в то время как в культурах MNA доля ИК резко увели-
чивалась до 75% уже к 48 ч инкубации [14]. Результаты наших исследований
свидетельствуют, что в клетках линии Vero вирус бешенства размножается
также быстро, как и в клетках MNA. Поэтому с точки зрения чувствительно-
сти детекции вируса в клеточных культурах и, как следствие, диагностики
бешенства использование клеток Vero представляется не менее эффективным,
чем клеток мышиной нейробластомы.
Наиболее интенсивное образование новых вирусных частиц в ИК линии
Vero регистрировали с помощью ПЦ через 24 ч, при этом изменения значений
показателей Mean и CV носили циклический характер. Увеличение числа по-
вреждённых и структурно изменённых клеток с аномальными морфологиче-
скими характеристиками к 72 ч инкубации указывает, вероятно, на усиление
в этот срок процесса выхода вируса во внеклеточное пространство.
Аттенуированный вирус бешенства оказывал на клетки Vero слабый цитопа-
тический эффект, что согласуется с литературными данными [14, 15].
На наш взгляд, определение методом ПЦ относительного содержания
клеток, инфицированных вирусом бешенства, позволит повысить точность и
эффективность анализов при определении активности вируса и уровня ней-
трализующих антирабических антител в сыворотках крови людей и животных,
что откроет новые возможности в совершенствовании диагностики бешенства.
Препарат диагностического антирабического флуоресцирующего иммуногло-
булина, созданный в России для классического варианта МФА с использова-
нием люминесцентной микроскопии, обладает по нашим данным достаточной
активностью для его эффективного применения в автоматическом (импульс-
ном) режиме количественного измерения интенсивности клеточной имму-
нофлуоресценции. Получение точной информации об особенностях культи-
вирования вируса, основанной на результатах количества ИК в культуре, в
дальнейшем позволит использовать ПЦ на этапах производства и контроля
разрабатываемых и выпускаемых в России антирабических препаратов [3].

About the authors

A. L. Kravtsov

Russian Research Institute for Plague Control «Microb»

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Saratov Russian Federation

S. V. Generalov

Russian Research Institute for Plague Control «Microb»

Email: fake@neicon.ru
Saratov Russian Federation

V. A. Kozhevnikov

Russian Research Institute for Plague Control «Microb»

Email: fake@neicon.ru
Saratov Russian Federation

Yu. K. Gavrilova

Russian Research Institute for Plague Control «Microb»

Email: fake@neicon.ru
Saratov Russian Federation

E. G. Abramova

Russian Research Institute for Plague Control «Microb»

Email: fake@neicon.ru
Saratov Russian Federation

A. V. Kochkin

Russian Research Institute for Plague Control «Microb»

Email: fake@neicon.ru
Saratov Russian Federation

A. K. Nikiphorov

Russian Research Institute for Plague Control «Microb»

Email: fake@neicon.ru
Saratov Russian Federation

References

Supplementary files