ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ГЕМОФИЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Фактические данные, накопленные в последние годы, свидетельствуют о том, что инфекции, вызываемые Н. influenzae, имеют широкое распространение на тер- ритории России и являются актуальной проблемой здравоохранения [4]. Для про- филактики инфекций, вызываемых капсульными штаммами (Hib), применяется ко- нъюгированная вакцина Акт-ХИБ (Авентис Пастер, Франция). Для профилактики инфекций, вызываемых бескапсульными штаммами (NTHi), вакцины не существует. Между тем, распространенность, частота генерализации, тяжесть течения заболева- ний и высокая летальность при инфекциях, обусловленных штаммами H.influenzae, принадлежащими к разным серотипам, требует разработки именно такой вакцины для специфической профилактики [8]. Описаны исследования, авторы которых химическим способом конъюгировали относительно консервативные детоксицированные липоолигосахариды с белками для формирования вакцин [7]. Эти конъюгаты были иммуногенны для мышей и кроликов и вызывали Т-зависимую иммунологическую защиту. Для создания ново- го вакцинного препарата, направленного на профилактику гемофильной инфекции, вызываемой как капсульными, так и бескапсульными штаммами H.influenzae, могут быть использованы липоолигосахариды, препараты, содержащие белки наружной мембраны, а также комбинация некоторых из них [5]. Основываясь на ранее про- веденных исследованиях, в НИИВС им. И.И. Мечникова проведена НИР по разра- ботке комплексного препарата, предназначенного для профилактики гемофильной инфекции. Целью настоящего исследования явилось изучение иммунобиологичес- кой активности разработанного препарата. МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы В работе использованы комплексный препарат, содержащий 1 мкг липоолиго- сахарида (ЛОС) и 10 мкг белоксодержащей фракции (БСФ), а также монопрепараты ЛОС, БСФ и препарат капсульного полисахарида (КПС). Препарат ЛОС получали экстракцией раствором хлорида натрия [1]. По данным субтипирования ЛОС при- надлежит к наиболее распространенному бескапсульному штамму (№45 NTHi). Белоксодержащую фракцию получали методом водной экстракции (БСФ-ВЭ) [3]. Метод экстракции дополняли этапом очистки от нуклеиновых кислот с последу- ющим диализом и очисткой от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией. Капсульный полисахарид H.influenzae получали из культуральной жидкости экстра- кцией цетавлоном. Все препараты получены из микробных культур штаммов-про- дуцентов H.influenzae в лаборатории иммунохимической диагностики НИИВС им. И.И. Мечникова. Монопрепараты использовали как препараты сравнения. Для изучения протективной активности комплексного препарата аутбредным мышам массой 14-16 г вводили однократно внутримышечно 0,5 мл (доза) препара- та. Через 10 дней животных заражали живыми культурами H.influenzae капсульного (№1095) и бескапсульных штаммов (№45, №58, №65) в дозе 5×109 микр.кл./мышь. Наблюдение за животными проводили в течение 7 дней, регистрируя смертность. Уровень специфических антител у иммунизированных животных выявляли в непрямом варианте ИФА. В качестве отрицательного контроля использовали сыво- ротки интактных животных. Для изучения влияния комплексного препарата на развитие инфекционного процесса иммунизированных мышей интраназально заражали культурами кап- сульного и бескапсульного штаммов H.influenzae [6]. Контрольной группе вводили физиологический раствор. Вскрытие животных проводили через 3, 24, 48 и 72 ча- са. Стерильно отобранный материал (ткань легкого) гомогенизировали, титровали и мерно высевали на чашки Петри с сердечно-мозговым агаром с добавлением 5% крови и через 18-20 часов культивирования в термостате при температуре 36,5 °С и 5% СО2 производили подсчет выросших колоний бактерий, после чего пересчиты- вали число бактерий на мышь. Р Е З У Л ЬТАТЫ ОБСУЖДЕНИЕ Исследования показали, что комплексный препарат обеспечивал защиту 90- 100% животных от штаммов возбудителя, использованных в опыте. ЛОС NTHi 45 также обладал достаточно высокой перекрестной протективной активностью и в до- зе 1 мкг защищал от заражения капсульным и бескапсульными штаммами (табл. 1). Добавление ЛОС к КПС стимулировало аналогичный уровень защиты (80-100%), в то время как введение мышам КПС создавало защиту только к капсульному Hib штамму. Белковый монокомпонент в дозе 10 мкг обладал меньшим протективным эффектом и защищал 50-60% мышей. Неожиданным обстоятельством явилось торможение протективных свойств варианта препарата, состоящего из белкового компонента и КПС Hib. Его протективная активность в отношении штамма Hib снижалась до 20-40% В отношении бескапсульных штаммов этот эффект был менее выраженным, но тоже достоверным (р<0,05). Иммунизация мышей комплексным препаратом приводила к значимому уве- личению уровня специфических антител, выявляемых в непрямом варианте ИФА (табл. 2). При иммунизации животных препаратами сравнения увеличение титров специфических антител зависело от использованного препарата. Высокий уровень IgG к ЛОС наблюдался при иммунизации ЛОС и исходной фракцией БСФ-ВЭ, что свидетельствовало о присутствии в последнем примеси липоолигосахарида. Иммунизация мышей БСФ-ВЭ приводила к образованию высокого уровня антител к ЛОС и БСФ-ВЭ. При этом уровень IgG к препарату БСФ был самым высоким. Высоким был уровень IgG к ЛОС при иммунизации животных смесью БСФ и ЛОС (ОП=2,6). Развитие инфекционного процесса, контролируемого по высевам бактерий из внутренних органов животных, протекало по-разному в контрольной и опытных группах (рис. 1, 2). В контрольной группе, начиная с третьих суток, наблюдалось размножение возбудителя в легких. При этом у иммунизированных мышей коли- чество бактерий, высеваемых из ткани легких, было незначительным в те же сроки наблюдения. Параллельно с высевами из легких, бактерии высевали из других ор- ганов (сердце, селезенка, печень, почки, лимфатические узлы брыжейки) Индекс обсемененности уже через три часа после заражения достигал единицы. Спустя 72 часа после заражения культурой штамма Hib 1095 обсемененность органов в опытных группах мышей резко снижалась, по сравнению с контролем; при за- ражении штаммом NTHi 45 возбудитель у опытных мышей не высевался. Через 144 часа наблюдения в органах мышей вновь обнаружен возбудитель в половине проб. Индекс обсемененности находился в пределах от 0,3 до 0,4. Практически у всех мышей контрольной группы возбудитель выделялся из лимфатических узлов, брыжейки, у иммунных мышей этот показатель был значимо ниже.

Рис. 1. Зависимость количества микробов в легких от времени наблюдения при заражении капсульным штаммом 1095. 1 — препарат, 2 — контроль.

 

Рис. 2. Зависимость количества микробов в легких от времени наблюдения при заражении бескапсульным штаммом No45. 1 — препарат, 2 — контроль.

Инфекции, вызываемые H. influenzae, являются важной причиной заболе- ваемости и смертности в экономически развитых и развивающихся странах, прежде всего, среди детей раннего воз- раста. Учитывая распространенность и тяжелое течение инфекций, вызывае- мых наиболее вирулентным капсуль- ным серотипом — Hib, нельзя недооце- нивать медико-социальную значимость заболеваний, вызываемых бескапсуль- ными штаммами гемофильной палочки. Основными факторами патогенности таких штаммов являются белки наруж- ной мембраны и ЛПС. Следует отме- тить, что штаммы не содержат полно- ценного липополисахарида, а содержат липоолигосахарид (ЛОС), лишенный длинных S-специфических цепей. При этом липоолигосахарид имеет уникаль- ную структуру, и среди бескапсульных штаммов обнаружено более 10 различа- ющихся по специфичности липоолиго- сахаридов. Поэтому сахарид-производ- ные препараты для профилактики гемо- фильной инфекции должны содержать множество углеводных структур, чтобы обеспечить адекватный охват штаммов, вызывающих инфекции. Вакцина, на- правленная на поверхностно-представ- ленные ЛОС, может быть возможным кандидатом для контроля NTHi инфек- ций. Однако детоксицированный ЛОС является Т-независимой молекулой, слабо иммуногенной in vivo. Вдобавок к слабой иммуногенности ЛОС гетеро- генность олигосахаридов и гомология между углеводными структурами на по- верхности бактериальных клеток и клеточных мембранах макроорганизма делает раз- работку NTHi-вакцин нелегким заданием. За рубежом разрабатываются вакцинные препараты на основе видовых белков наружной мембраны (БНМ) и ЛОС. Все раз- рабатываемые препараты относятся к типу конъюгированных вакцин, обладающих свойствами Т-зависимого антигена. На основании данных субтипирования нами вы- бран наиболее распространенный в популяции бескапсульный штамм H.influenzae — №45 NTHi [2]. ЛОС 45NTHi обладал наиболее выраженной специфической и пере- крестной активностью. Кроме того, методом водной экстракции нами получены бе- локсодержащие фракции (БСФ). Его производный — БСФ-ВЭ-3 хроматографически очищенный препарат обладал перекрестной серологической активностью, содержал в своем составе известные протективные белки наружной мембраны H.influenzae (Р2, Р5, Р6) и обладал низкой токсичностью (LD50~2,0 мкг). Препарат ЛОС защищал мышей от заражения летальными дозами гетерологичных бескапсульных штаммов. Добавление ЛОС к КПС стимулировало защиту (80-100%) от заражения капсульным и бескапсульными штаммами, в то время как введение мышам КПС создавало защи- ту только к капсульному Hib штамму. БСФ-ВЭ в дозе 10 мкг обладал протективным эффектом, защищая 50-60% мышей от заражения капсульным и бескапсульными штаммами H.influenzae. Изучение гуморального ответа на введение комплексного препарата и препаратов сравнения позволило прийти к заключению о том, что КПС Hib не стимулирует специфический иммунитет. Отсутствие антителообразования может свидетельствовать о необходимости замены вида экспериментальной модели. Кроме того, КПС Hib не стимулирует специфический иммунитет к гетерологичным штаммам NTHi. Иммунизация мышей ЛОС приводила к значимому (ρ<0,05) увели- чению уровня антител. Добавление ЛОС к КПС не усиливало антителообразование к КПС. Добавление к БСФ 1 мкг ЛОС усиливало перекрестную протективность обоих препаратов (80-100% мышей выживало). Высокий уровень IgG к ЛОС при иммуни- зации животных смесью БСФ и ЛОС (ОП=2,6) указывает на стимуляцию гумораль- ного иммунного ответа ЛОС и делает этот антиген значимым в составе комплексного вакцинного препарата, предназначенного для профилактики инфекций, вызываемых капсульными и бескапсульными штаммами гемофильной палочки. Развитие инфекционного процесса изучали на легочной модели заражения [6], так как по нашему мнению, она разработана с учетом органотропности H.influenzae к тканям дыхательных путей и легких. После заражения иммунизированных комп- лексным препаратом животных формирования инфекционного процесса напрямую зависело от развития иммунного ответа на введение комплексного препарата. Таким образом, препарат, содержащий 10 мкг БСФ и 1 мкг ЛОС, обладал перекрестной протективной активностью, защищая 80-100 мышей от заражения летальными до- зами капсульным и бескапсульными штаммами H.influenzae. Иммунизация мышей приводила к повышению уровня антител и к ЛОС, и к БСФ.

Об авторах

Н. Е. Ястребова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

М. М. Токарская

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

С. И. Елкина

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Н. Н. Овечко

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

С. А. Барановская

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Список литературы

Дополнительные файлы