DEVELOPMENT OF THE VACCINE BASED ON THE RECOMBINANT ANTIGENS OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Синегнойные инфекции широко распространены в стационарах различного
профиля. Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) стабильно занимает вто-
рое-третье место среди возбудителей оппортунистических инфекций, предпосыл-
ками для развития которых являются ослабление иммунной системы больного и
высокая резистентность патогена к широкому кругу химиотерапевтических средств,
применяемых в клиниках [2, 8]. Этими обстоятельствами объясняется низкая эф-
фективность антибиотиков третьего и четвертого поколения, а также высокая ле-
тальность при синегнойных осложнениях. Одним из путей решения этой проблемы
может явиться создание специфических иммунобиологических средств, в частнос-
ти, вакцин [1, 9].
Разработки антисинегнойных вакцин активно проводились с 70-х годов XX ве-
ка. В первую очередь, рассматривалась перспектива препаратов на основе цельных
инактивированных клеток. В качестве примера можно привести советскую вакцину,
содержащую семь штаммов, представителей основных иммунотипов P. aeruginosa,
циркулирующих в стационарах [7]. Однако, эти препараты не были внедрены в прак-
тику здравоохранения из-за высокой токсичности. Поэтому были созданы вакцины
на основе разрушенных микробных клеток [6, 12], которые, несмотря на высокую
иммуногенность, проявляли реактогенность, связанную с примесью липополисаха-
рида клеточной стенки бактерии. Обнадеживающие результаты были получены при
исследовании препаратов на основе очищенных белков наружной мембраны (outer
membrane protein — Opr) с молекулярной массой в пределах от 10 до 100 кДа, которые
обладали выраженным протективными свойствами и низкой токсичностью [3, 10, 12].
Значимыми, на наш взгляд, являются исследования по созданию препаратов ана-
токсина P. aeruginosa — химически детоксицированного экзотоксина А, одного из
основных факторов патогенности синегнойной палочки [9]. Анатоксин исполь-
зовали в клинике с целью получения донорской плазмы, которая оказалась высо-
коэффективной при лечении генерализованных форм заболеваний, вызываемых
P. aeruginosa [4, 5].
Следует подчеркнуть, что сложности в создании эффективных вакцин, предна-
значенных для профилактики синегнойной инфекции, связаны с наличием много-
численных факторов патогенности у возбудителя, среди которых выделить наиболее
значимые для формирования специфического иммунитета представляется сложной
задачей. Содержание белковых антигенов в бактериальной клетке достаточно мало,
процесс их очистки сложен, а в случае получения анатоксина остается вероятность
реверсии токсичности. Поэтому использование традиционных трудоемких техноло-
гий представляется мало приемлемым. Выходом из данной ситуации может явиться
использование генно-инженерных технологий, позволяющих получать рекомбинан-
тные белки. Соответственно, целью проведенных исследований явилось получение
и отбор рекомбинантных антигенов, способных стимулировать иммунные реакции
и защищать экспериментальных животных от вирулентной культуры P. aeruginosa. В
качестве кандидатных компонентов разрабатываемой вакцины выбраны антигены —
наиболее изученные поверхностные белки OprF, OprL и OprI, а также экзотоксин А.
На основе полученных продуктов предполагалось создать кандидатную синегной-
ную вакцину и изучить ее свойства.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Последовательности целевых генов амплифицировали с помощью ПЦР, ис-
пользуя специфические праймеры, подобранные на основе полноразмерной после-
довательности штамма P. aeruginosa PA-01, представленной в базе данных GenBank
[13]. В качестве матрицы использовали геномную ДНК, выделенную из штамма
P. aeruginosa РА-103.
Амплифицированные последовательности встраивали в плазмидные век-
торы, несущие регуляторные участки для экспрессии в клетках Escherichia coli,
используя рестриктазы, сайты которых были введены в концевые области прай-
меров для ПЦР. При встраивании использовали плазмиды pQE-30 (QIAGEN) и
рЕТ-28b(+) (Novagen). В первом случае рекомбинантными конструкциями транс-
формировали клетки E. coli штамма М15 (QIAGEN), а во втором случае — клетки
штамма BL21(DE3). Первичный отбор клонов проводили с использованием рест-
риктного анализа. Окончательно отбор проводился секвенированием по Сэнгеру.
Синтез рекомбинантных белков с использованием созданных продуцентов про-
водили путем индукции экспрессии с помощью изопропил-β-d-тиогалактопирано-
зида. Белковые продукты анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле
(ПААГ) по методу Лэммли [11].
Очистку рекомбинантных белков осуществляли методом хелатной хроматогра-
фии с использованием Ni-сефарозы (Amercham) в 8 М буферном растворе мочеви-
ны. Для перевода белков в нативное состояние использовали диализ против 50 мМ
раствора Tris-HCl (рН 9,0). Содержание белков определяли спектрофотометрически
при длине волны 280 нм. При расчете концентрации рекомбинантных белков ис-
пользовали коэффициенты экстинкции, рассчитанные в программе OMIGA.
Подлинность рекомбинантных белков подтверждали с помощью электрофореза
в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по методу Лэммли и имму-
ноблоттинга, проводимых в соответствии с общепринятыми методиками [11]. При
иммуноблоттинге использовали кроличьи сыворотки крови против цельноклеточ-
ной культуры P. aeruginosa.
Рекомбинантные белки для иммунизации животных разводили в фосфатно-
солевом буфере с добавлением гидроокиси алюминия из расчета 3 мг Al(OH)3 на 1
мг белка и проводили сорбцию в течение 12 часов при температуре 4°С. Препараты
вводили мышам весом 16-18 г внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл двукратно с двух-
недельным интервалом. Через две недели после курса иммунизации животным
вводили культуру P. aeruginosa (штаммы РА-170015, РА-103), либо рекомбинантный
экзотоксин А. ЛД50 вычисляли по формуле Кербера в модификации Ашмарина —
Воробьева: ЛД50=10^(lgA – lg2×(B1/C1 + B2/C2 + B3/C3 + B4/C4 + B5/C5 – 0,5); где А —
максимальная инфекционная доза в опыте, В — количество животных, павших в
группе, С — первоначальное количество животных в группе.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
В результате ПЦР синтезированы последовательности генов мембранных бел-
ков: oprF (размер 1053 н.п.), oprL (размер 507 н.п.), oprI (размер около 252 н.п.). Все
последовательности были встроены в полилинкер плазмиды pQE-30. В результате
экспрессии рекомбинантных генов синтезированы и очищены в колонках с никель-
активированным сорбентом специфические рекомбинантные продукты. При ана-
лизе в полиакриламидном геле выявили рекомбинантные продукты со следующими
примерными молекулярными массами: 40 кДа у OprF (расчетная масса 38,9 кДа),
20 кДа у OprL (расчетная масса 19,2 кДа) и 10 кДа у OprI (расчетная масса 10,1 кДа).
Все рекомбинантные белки проявили высокую специфичность при взаимодействии с
поликлональной иммунной кроличьей сывороткой к цельным клеткам P. aeruginosa.
Клонирование экзотоксиновой последовательности проводили, используя
плазмидный вектор рЕТ-28b(+). В первую очередь, была получена конструкция с
полноразмерным геном toxA (2 kb), продукт экспрессии которого (экзотоксин А)
оказался высокотоксичным для мышей. Далее с помощью специфических рестрик-
таз (HindIII и XhoI), вырезали из гена toxA фрагмент размером 1598 н.п., встроили
его в плазмиду рЕТ-28b(+). Синтезированные и очищенные рекомбинантные экзо-
токсин А (73,8 кДа) и анатоксин (65,8 кДа) оказались специфичными в иммуноблот-
тинге при реакции с кроличьей сывороткой против синегнойного анатоксина.
На первом этапе при исследовании защитных свойств мембранных белков
использовали живую вирулентную нетоксигенную культуру P. aeruginosa штамма
РА-170015, а при исследовании анатоксина — полученный рекомбинантный экзо-
токсин А P. aeruginosa. Иммунизацию мышей осуществляли, используя дозы реком-
бинантных белков с двукратным шагом от 6,25 до 50 мкг. Данные учета павших в
течение недели животных свидетельствовали о способности препаратов защищать
мышей от синегнойной инфекции. При заражении бактериальной культурой живот-
ным контрольных групп (интактные мыши той же партии) вводили от 25 до 400 мик-
робных клеток (м.к.), а иммунизированным мышам от 50 до 800 млн м.к. Индексы
эффективности (ИЭ) защитных свойств (отношение ЛД50 для иммунизированных
мышей к ЛД50 в контрольной группе) рекомбинантного белка OprF составляли от
1,6 до 3,3. Оптимальная иммунизирующая доза соответствовала 25 мкг препарата.
Для рекомбинантного белка OprL оптимальной иммунизирующей дозе также соот-
ветствовало 25 мкг белка с ИЭ равным 3,0. При оценке защитных свойств OprI, им-
мунизацию проводили с использованием доз 50 и 25 мкг и эффективной оказалась
только доза 50 мкг со значением ИЭ 2,0 (табл. 1).
Мыши, иммунизированные анатоксином, проявили высокую выживаемость
после введения полноразмерного рекомбинантного экзотоксина А. Рекомбинантный
экзотоксин А вводили иммунизированным животным в дозах от 6,25 до 100 мкг на
особь, а в контрольной группе — от 1,56 до 25 мкг. Оптимальная иммунизирующая
доза для рекомбинантного анатоксина соответствовала 50 мкг белка на особь с ин-
дексом эффективности 8,9 (табл. 1).
Далее представляло интерес исследо-
вать комплексное взаимодействие наибо-
лее эффективных антигенов, что можно
было достигнуть двумя путями: использо-
ванием комплексов отдельных белков или
созданием слитых белков.
При создании слитого белка OprF-OprI
последовательность гена oprI, кодирующую
192-342 аминокислотные остатки OprI,
встроили в рекомбинантную плазмиду,
несущую экспрессирующий ген oprF. При
создании слитого белка OprF-aTox после-
довательность гена oprF встроили в реком-
бинантную плазмиду для экспрессии ре-
комбинантного анатоксина. Далее с целью
получения слитого белка OprF-aTox-OprI
во вторую рекомбинантную конструкцию
встроили последовательность гена oprI.
По результатам электрофореза в по-
лиакриламидном геле выявлено, что полу-
ченные рекомбинантные белки соответс-
твовали расчетным данным: 46,8 кДа для
OprF-OprI, 103,6 кДа для OprF-aTox и 107,2 кДа для OprF-aTox-OprI. При анализе в
иммуноблоттинге слитые белки оказались специфичными при взаимодействии с сы-
воротками, иммунными к отдельным рекомбинантным белкам: OprF-OprI реагиро-
вал с сыворотками к OprF и OprI; OprF-aTox — с сыворотками к OprF и анатоксину;
OprF-aTox-OprI — со всеми тремя сыворотками.
При исследовании защитных свойств слитых рекомбинантных белков и комплек-
сов отдельных рекомбинантных белков в качестве материала для экспериментального
заражения использовали культуру P. aeruginosa штамма РА-103, который характеризу-
ется всеми основными факторами патогенности. Иммунизированным мышам вводили
от 12,5 до 100 млн м.к., а группе контрольных неиммунизированных животных той же
партии — от 6,25 до 50 млн м.к. живой вирулентной культуры P. aeruginosa. Наиболее
эффективными оказались препараты OprF-aTox-OprI и OprF-OprI, с оптимальными
дозами иммунизации в 50 мкг для первого слитого белка и 25 мкг — для второго.
При эксперименте по исследованию комплексов рекомбинантных белков изу-
чили следующие смеси: OprF + OprL, OprF + анатоксин и OprF + OprL +анатоксин.
Помимо группы интактных животных присутствовали еще три контрольные группы
животных, которых иммунизировали рекомбинантными белками по отдельности.
Рекомбинантные белки вводили с использованием оптимальных доз, подобранных
на первом этапе исследований: OprF и OprL вводили в дозе 25 мкг, а анотоксин в до-
зе 50 мкг. Из результатов эксперимента видно, что все рекомбинантные белки в ре-
зультате иммунизации в два раза увеличивали выживаемость мышей, инфицирован-
ных P. aeruginosa штамма РА-103. Тот же самый результат наблюдали при введении
смеси двух мембранных белков (OprF + OprL). В то же время, использование смесей
OprF + анатоксин и OprF + OprL +анатоксин приводило к аддитивному защитному
эффекту с индексом эффективности 3,0 (табл. 2).
В результате проведенных исследований получены штаммы-продуценты ряда
рекомбинантных белков наружной мембраны и анатоксина P. aeruginosa. Отработана
технология очистки белков (OprF, OprL, OprI, анатоксин) и изучены их иммуноген-
ные свойства. После иммунизации животных выявлены наиболее выраженные про-
тективные свойства от синегнойной инфекции у рекомбинантных белков OprF, OprL
и анатоксина. Рекомбинантный белок OprI обладал низкой иммуногенностью даже
при введении увеличенной дозы что, вероятно, связано с его малым молекулярным
весом. С целью исключения возможного влияния токсических факторов патогенности
возбудителя в экспериментах с мембранными белками использован штамм РА-170015,
характеризующийся отсутствием синтеза экзотоксина. При исследовании протектив-
ных свойств анатоксина использовали
рекомбинантный экзотоксин А или
штамм РА-103 P. aeruginosa, обладаю-
щий высокой токсичностью.
Ключевая цель при разработке ре-
комбинантной антисинегнойной вак-
цины заключается в создании препара-
та, который должен, с одной стороны,
вызывать иммунные реакции против
поверхностных антигенов возбудителя,
а с другой стороны, способствовать ней-
трализации одного из самых серьезных
факторов патогенности — экзотокси-
на А. Данную задачу можно решить дву-
мя путями: использованием комплекса
отдельных белков или получением сли-
тых вариантов, используя для заражения
культуру P. aeruginosa штамма РА-103.
При комплексном использовании
рекомбинантных белков OprF и ана-
токсина выявлен аддитивный эффект.
Включение в состав смеси компонента
OprL не приводило к усилению защит-
ных свойств.
Полученные слитные варианты рекомбинантных белков (OprF-OprI, OprFaTox,
OprF-aTox-OprI) также обладали более высокими иммуногенными свойствами
по сравнению с отдельными рекомбинантными белками. Среди слитых вариантов
наиболее выраженным защитным эффектом обладали OprF-OprI и OprF-aTox-OprI.
Таким образом, можно сделать вывод, что комплекс двух рекомбинантных белков
(OprF и анатоксина) и слитые рекомбинантные белки могут быть использованы при
создании антисинегнойной вакцины.
Кандидатная вакцина, полученная на основе комплекса рекомбинантных бел-
ков OprF и анатоксина, сорбированных на геле гидроокиси алюминия, в настоящее
время проходит доклинические испытания.

About the authors

N. A. Mihailova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

E. M. Zimina

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

A. V. Soldatenkova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

A. A. Kaloshin

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

References

Supplementary files