Biohazard caused by viable but nonculturable microorganisms

Full Text

Образование и свойства некультивируемых клеток микроорганизмов.
Жизнеспособными, но некультивируемыми клетками микроорганизмов (viable but
nonculturable VBNC, ЖНК) называются обратимо потерявшие способность расти
на традиционных питательных средах вследствие стрессовых воздействий [1, 2, 17].
Пока не ясно, является ли это некультивируемое состояние (НС) адаптацией к переживанию неблагоприятных условий в течение определенного времени или этапом отмирания культуры. Известны три наиболее рациональных предположения:
1) клетки спонтанно теряют способность давать колонии и подвергаются разрушению [33]; 2) существует программируемая смерть клеток [19]; 3) формирование
ЖНК является механизмом переживания неблагоприятных условий, сравнимым
со спорообразованием [17]. Вегетативные клетки микроорганизмов способны переходить в НС под действием большого числа факторов, в том числе считавшихся
ранее бактерицидными. К таким факторам относятся неоптимальная температура
[29] и давление [17], окислительный потенциал среды, [34], соли и ионы тяжелых
металлов [15], кислотность среды [45], высушивание [6],облучение светом различных длин волн [25], хлорирование водопроводной воды [11], применение антибиотиков [38], ультразвук [12], воздействие CO2 [50], лиофилизация [7] и дезинфектанты [17], биологические факторы (экзометаболиты зеленых водорослей, клеток
простейших) [1]. ЖНК Escherichia coli образуются под действием CO2 при высоком
давлении, причем больше образуется их при 37°С, чем при более низкой температуре, при которой выше отмирание бактерий [48]. Выявлено, что для нормального
образования ЖНК микроорганизмов важен весь комплекс стрессовых воздействий,
которым они подвергаются в окружающей среде [27]. В некоторых случаях показана
зависимость формирования ЖНК от источника выделения [3]. Так, выделенные из
пищевых продуктов штаммы E. coli, пропущенные и не пропущенные через пищеварительную систему мыши, имели разную степень образования ЖНК при повышенном осмотическом давлении (13% NaCl) и окислительном (0.05% H2O2) стрессе [3].
Штамм, прошедший через пищеварительную систему мыши, был более чувствителен к стрессу, чем родительский, выделенный из пищевого продукта, и полностью
переходил в НС под действием повышенной концентрации NaCl и перекиси водорода [3]. Для Vibrio vulnificus и V. parahaemolyticus показано, что ЖНК обладают
повышенной устойчивостью к широкому спектру неблагоприятных воздействий,
таких как антибиотики, токсичные соли тяжелых металлов, окислительный стресс,
повышенная температура, высокое и низкое содержание NaCl, кислотность, кон-центрация этанола [49]. Помимо водной среды для Serratia marcescens образованию
ЖНК может способствовать и нахождение микроба в аэрозоле [21]. Присутствие
некультивируемых микроорганизмов обнаружено на частицах пыли [20], где факторами для образования ЖНК могли быть высушивание и ультрафиолетовое излучение. Кроме патогенных микроорганизмов наличие НС с сохранением некоторого
уровня метаболизма показано, например, для пробиотического микроорганизма
Lactococcus lactis [18, 36]. Авторы показали, что при лимитировании по углеводам
исследуемые штаммы переходят в НС. При этом наблюдается штаммовое разнообразие по времени перехода к некультивируемости (от одной недели до 3 месяцев) в
зависимости от особенностей углеводного метаболизма.
Клетки микроорганизмов в НС уменьшаются в размерах, периплазматическое пространство более выражено, в нуклеоиде исчезают темные гранулы, уменьшается количество рибосом [48]. Внешняя мембрана ЖНК V. cholerae становится
волнистой, утолщается слой пептидогликана, снаружи появляется слой, похожий
на капсулу [24]. В клетках Vibrio parahaemolyticus цитоплазма разделяется на электронноплотный периферический слой и прозрачный центр [8]. Клеточная стенка
становится неплотной, гибкой, после чего следует синтез новой тонкой стенки [43].
Обнаружено, что изменение состава липидов мембраны в условиях стресса играет
роль в поддержании мембранного потенциала [35]. Также могут возникать серьезные
перестройки в пептидном составе клеточной стенки: у E. coli обнаружено, что количество связей между молекулами диаминопимелиновой кислоты увеличилось более
чем в три раза, а также повысилось количество мурамилпептидов [49]. Происходило
укорочение гликановых цепей по сравнению с клетками экспоненциальной фазы,
что обуславливает большую устойчивость микроорганизма к механическим воздействиям. Kusumoto A. et al. [26] установили, что в процессе потери культивируемости
Salmonella enterica снижается количество стрессового фактора σS
(RpoS) в клетках,
а мутанты с делецией в соответствующим гене переходят в НС быстрее, чем родительские штаммы. Активируется продукция гистоноподобного белка H-NS, который ингибирует продукцию RpoS. Метаболизм в ЖНК не прекращается. У ЖНК
происходит синтез de novo белков холодового шока и голодания [35]. Trevors et al.
(2012) показали меньшее содержание РНК в цитоплазме голодающих бактерий,
чем у нормальных микроорганизмов. Синтез белка также претерпевает изменения.
Так, у V. parahaemolyticus снижение синтеза одних белков и усиление синтеза других
подавляет переход клеток в стационарную фазу и способствует переходу в НС [27].
Уровень АТФ остается на высоком уровне, что подтверждает факт жизнеспособности таких клеток [19]. Количество 16S рибосомной РНК меняется незначительно, сохраняются редуктазная и эстеразная активность [28]. На нескольких штаммах Vibrio
vulnificus in vitro и in situ показано, что при нахождении клеток в НС сохраняется
экспрессия некоторых генов, таких как, например, rpoS и katG, хотя транскрипция
последнего идет на крайне низком уровне. Выявлено, что rpoS мутанты, не имеющие регуляторного пептида ppGpp, быстрее, чем дикий тип, переходят в НС. ЖНК
продолжают экспрессию RpoS. Показано, что мутанты без rpoS теряли культурабельность быстрее и отмирали раньше, чем родительские клетки. Поэтому сделан
вывод, что экспрессия гена rpoS способствовала персистированию ЖНК [49]. Таким
образом, хотя экспрессия и регуляция гена rpoS осложняет переход в НС, долговременное выживание популяции без его экспрессии невозможно. Имеется также
другая точка зрения: ppGpp, регулируемый белком RelA, может быть индуктором
НС и клетки, не имеющие ppGpp, становятся ЖНК с меньшей вероятностью [5].
Для ЖНК E. coli показано заметное усиление продукции белка внешней мембраны OmpW, который активирует альтернативный сигма-фактор σE (RpoE) [3]. Клетки E.
coli в НС устойчивы к ультразвуку [48]. Белковый состав клеток также меняется,
отмечено торможение синтеза одних белков и увеличение синтеза других. Lai C. J.
et al. [27] сравнили белковые профили клеток Vibrio vulnificus и V. parаhaemolyticus
в НС, в процессе перехода в НС и с блоком НС. В результате выявлен ряд генов,
для которых при переходе в НС наблюдали усиление транскрипции по сравнению
с клетками, у которых переход в НС заблокирован (например, факторы элонгации
EF-Tu и EF-G, рибосомальный белок S1 и др.). Показано, что при переходе в НС
rpoS транскрибируется активнее, чем в экспоненциальной фазе, а затем транскрипция затухает, но остается на детектируемом уровне [27]. Yaron and Matthews [46] показали экспрессию генов в E.coli, включая mobA, rfbE, stx1, stx2 и некоторых генов,
относящихся к синтезу 16s rRNA. Продолжающаяся экспрессия генов, контролирующих у ЖНК E.coli токсин Шига, гемолизин и адгезин, может приводить к диарее,
геморрагическому колиту и гемолитико-уремическому синдрому.
Использование различных методов измерения метаболической активности, а
также целостности мембраны позволяет установить жизнеспособность ЖНК [35].
Legionella pneumophila при обработке хлорноватистой кислотой переходит в НС.
Причем из двух субпопуляций, различающихся по уровню метаболизма, которые
выявляются в ранней стационарной фазе роста культуры, устойчивее оказалась
более активная субпопуляция. Она, переходя в НС, сохраняет свою активность
при небольших дозах кислоты. При формировании НС появляется субпопуляция
с очень низкой активностью метаболизма. С повышением концентрации кислоты
возрастает доля таких клеток, вплоть до 100% [16].
Выход микроорганизмов из некультивиремого состояния. Первыми термин «реанимация некультивируемых клеток» использовали Roszak et al. [40] для описания
реактивации ЖНК Salmonella enteritidis. Возможность их возврата к активному росту
и размножению является одним из свойств, полученных в периодической культуре
ЖНК или покоящихся клеток бактерий (ПК)[1]. Морфология клеток при реверсии
также восстанавливается [17]. Основной проблемой при реанимации покоящихся
клеток или ЖНК является доказательство того, что происходит реанимация, а не
рост недетектируемой активной части популяции [35]. Во многих случаях для успешного выхода микроорганизмов из НС достаточно снятия неблагоприятного
воздействия. Например, для Vibrio parahaemolyticus и Vibrio vulnificus, переходящих
в НС при низкой температуре, достаточно инкубации ЖНК при комнатной температуре с последующим посевом культуры на богатую среду [43]. Кроме того, например, для Vibrio vulnificus показано, что динамика увеличения числа КОЕ в условиях
инкубации при комнатной температуре и отсутствии питательных веществ отражает
именно возврат к росту некультивируемых клеток, поскольку увеличение численности с недетектируемого уровня до 5х104
за 1 час в данном режиме невозможно за
счет деления остаточных активных клеток [44]. Реактивация ЖНК может происходить с помощью видонеспецифичного аутоиндуктора по механизму quorum sensing:
добавление культуральной жидкости от Vibrio vulnificus и синтетического аутоиндуктора ускоряет выход вибрионов из НС, а ингибирование системы quorum sensing
замедляет рекультивацию [1, 4]. Однако rpoS мутанты не способны к реанимации с
помощью аутоиндуктора даже при добавлении экзогенного стимулирующего вещества. Значит, этот σ-фактор играет важную роль не только в персистировании ЖНК,
но и в их рекультивации. Ayrapetyan et al. [4] показали, что сигнальная молекула в
системе quorum sensing AI-2 может выводить ЖНК V. vulnificus из НС. Установлено
что клетки E. coli могут быть реанимированы на богатой среде при наличии в ней антиоксидантов (каталаза или пируват натрия) [38], Хотя существуют различные
точки зрения на использование антиоксидантов, Morishige Y. et al. [32] показали,
что клетки Salmonella enteritidis, введенные в НС с помощью H2O2, восстанавливают культурабельность после добавления пирувата натрия или его аналогов, доказывая, что пируват — одно из ключевых веществ, запускающих синтез макромолекул.
Staphylococcus aureus не реактивируется при добавлении в среду антиоксидантов,
но может быть реактивирован при повышении температуры. Для стафилококковых
биопленок реактивирующим фактором служила культуральная жидкость (добавка
50% жидкости к триптическому соевому бульону) от клеток экспоненциальной фазы того же штамма [38].Эффективными индукторами для выхода из НС оказались
фетальная сыворотка, ауксин, витамин К, почвенные вытяжки из живых и убитых
инфузорий [1]. Переход в активное состояние, возможно, связан с взаимодействием микроорганизмов с цитокинами организма хозяина [1, 2]. Для Legionella
pneumophila выявлено, что реанимация возможна при совместном культивировании
с Acanthamoeba castellani [16]. L. monocytogenes serovar Thompson предположительно
рекультивируется в кишечнике нематоды [22] Для ЖНК некоторых энтеропатогенных микроорганизмов (V. cholerae, E. coli, S. flexneri, S. enterica) недавно показана
реверсия в вегетативное состояние при совместном культивировании с культурами клеток эукариот, установлено, что такой реактивации способствует выделяемая
живыми эукариотическими клетками каталаза [41]. Известны работы по реверсии
к пролиферативной активности с использованием мышей [47]. Обнаружено, что у
многих бактерий присутствует белок Rpf (Reasucitation Promoting Factor). Выявлено,
что ЖНК S. enterica serovar Oranienburg могут быть стимулированы определенными концентрациями Rpf белка [49]. Пептидогликангидролазная активность белков
семейства Rpf предполагает, что восстановление ПК требует гидролиза клеточной
стенки, способствуя выходу из нее факторов, влияющих на пробуждение [23]. К настоящему моменту известно, что вирулентность реанимированных клеток сохраняется или восстанавливается. ЖНК различных микроорганизмов имеют ограниченный срок жизни и ограниченный во времени потенциал возврата к росту и размножению. Так, для Vibrio cholerae показано отсутствие возврата ЖНК в вегетативное
состояние после 91 дня наблюдений [41].
Опасность жизнеспособных некультивируемых микроорганизмов. Вопрос, являются ли ЖНК опасными, если они не обнаружены рутинными методами, изучен
недостаточно. Поскольку многие микроорганизмы способны сохранять активность факторов вирулентности и инфекционность, существует риск для здоровья человека, животных, растений [39]. Показано, что 80% вспышек заболеваний
вызваны неидентифицированными агентами, возможно ЖНК [49]. При этом, такие вспышки часто относят к вирусным инфекциям, т.к. бактерии не выделяются
[17]. Так, Vibrio cholerae в НС вызывал диарею у волонтеров [9]. Этот микроорганизм продолжал секрецию холерного токсина в течение 28 дней после перехода в
НС [10]. L. pneumophila в НС сохраняла способность проникать в клетки амебы-хозяина, впоследствии представляя опасность для теплокровных [49]. S. dysenteriae,
сохраняя сниженную токсичность и адгезивность для клеток HeLa, продуцировала
токсин Шига, находясь в НС. Существуют исследования, в которых инфицированные Shigella dysenteriae рыбы, не имевшие явного контакта с патогеном, не способным существовать в среде [39]. Highmore et al. [22] показали, что обработка хлором
Listeria monocytogenes и Salmonella enterica serovar Thompson как в жидкой среде,
так и на листьях салата приводит к быстрому, в течение нескольких минут, образованию ЖНК, которые сохраняют свою патогенность. Для перевода исследованных авторами микробов в НС на листьях требуется значительно больше хлора. Это, возможно, связано с расположением клеток в устьицах и вокруг них и образованием
биопленок совместно с автохтонной микробиотой листа. Патогенность ЖНК L.
monocytogenes зависит от примененного стрессового воздействия [22]. Для E. coli
показано формирование ЖНК при замораживании. Следовательно, микроб становится более опасным при наличии циклов замораживания — оттаивания пищевых
продуктов, т.к., ЖНК при этом продолжают синтезировать токсин [29]. Штаммы
Legionella в НС сохраняют инфекционность в отношении Acanthamoeba и макрофагов человека даже после года нахождения в голодной среде. На моделях макрофагов
показано, что легионеллы восстанавливали способность к размножению внутриклеточно [13]. При использовании медных водопроводных труб образуются ЖНК
P. aeruginosa, т.к. там присутствуют ионы меди в определенных концентрациях.
Клетки могут выходить из НС при снятии стресса, обусловленного медью, например, хелатирующим агентом, восстанавливать цитотоксичность и генотоксичность
в отношении клеток человека в течение 14 дней [15]. S. typhi также переходит в
опасное НС под воздействием ионов меди в течение 12 — 14 дней [47]. Это указывает на то, что при многих вспышках заболеваний не уделяется достаточного внимания существованию некультивируемых патогенов, особенно в виде биопленок
[2]. Логично предположить, что неудачи в выделении данного штамма E. coli O104:
H4 связаны с присутствием клеток возбудителя в НС. S. aureus может находиться в
НС в биопленках в присутствии ванкомицина хинопристин/дальфопристин и персистировать в составе биопленок, что предположительно сопряжено с рецидивирующими инфекциями [38]. Следовательно, при выборе дезинфицирующего агента
необходимо подбирать биоциды, работающие по нескольким направлениям, поскольку окислительные биоциды неэффективны в отношении биопленок. Одними
из наиболее действенных средств считаются соединения хлора, например HOCl,
для которого поазано, что инактивирующие дозы намного меньше, чем, например,
для H2O2 [17].
Для пивоваренной промышленности важны микроорганизмы Lactobacillus
lindneri и Lactobacillus harbinensis и другие представители рода Lactobacillus, наличие которых приводит к порче пива. Они могут переходить в НС при адаптации к
пиву, при его ферментации и хранении при низкой температуре или при тепловой
обработке. При этом сохраняется способность производить вещества, приводящие к
порче пива. Важную роль играет окислительный потенциал пива, в том числе бактерицидные вещества хмеля [30, 31]. Существование ЖНК обнаружено также у эукариотных микроорганизмов. Serpaggi et al. [42] показали, что эукариотные микроорганизмы — дрожжи Brettanomyces bruxellensis, вызывающие порчу вина, также могут
переходить в НС под действием метабисульфита натрия и сохранять свои свойства
по порче вина. Saccharomyces cerevisiae и Candida stellata способны переживать обработку сульфитами, переходя в НС [14].
По мнению Blinkova L.P. et al. [7] и Pakhomov et al. [37] ЖНК важны для определения истинной жизнеспособности вакцинных, пробиотических, музейных культур
как основных, так и их опасных контаминирующих микроорганизмов.
Таким образом, имеется возможность возникновения ситуации, когда заболевание вызывается жизнеспособными некультивируемыми микроорганизмами. В этом
случае затруднен поиск резервуара и возбудителя инфекции, поскольку традиционный культуральный метод выделения микроорганизмов из природных и антропогенных источников (почва, вода, продукты питания, клинические образцы и др.)
дает ложноотрицательный результат.

About the authors

Yu. D. Pakhomov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

Moscow

Russian Federation

L. P. Blinkova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru

Moscow

Russian Federation

References

Supplementary files