КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БИОПЛЕНОК BORDETELLA PERTUSSIS НА АБИОТИЧЕСКОМ СУБСТРАТЕ

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ
Эпидемический процесс коклюшной инфекции, несмотря на высокий уровень
противококлюшной вакцинации, продолжается во многих странах мира. По данным
ВОЗ, в 2008 г. в мире было зарегистрировано 16 млн случаев заболевания коклюшем,
195 тысяч детей погибли от него. В 2011 г. в мире зарегистрировано 162 047 случаев
заболевания коклюшем, из них тяжелых 38 040 [1].
Исследования, проведенные во многих странах мира, показали, что основны-
ми причинами роста заболеваемости коклюшем является несоответствие генотипов
B. pertussis циркулирующих штаммов генотипам вакцинных штаммов B. pertussis,
вследствие адаптации бактерий к вакцинированной популяции, что привело к сниже-
нию иммунитета и возникновению вспышек заболевания коклюшем. Мутации в ге-
нах, кодирующих основные факторы вирулентности, аллельный полиморфизм и ре-
дукция генома B. pertussis привели к появлению циркулирующих штаммов B. pertussis,
несущих в генотипе ptxP3 аллель оперона коклюшного токсина, отличающийся
повышенной вирулентностью и ассоциирующийся с увеличением заболеваемости
коклюшем [9, 11]. При этом, одним из возможных факторов высокой вирулентности
циркулирующих штаммов может быть их повышенная способность к формированию
биопленок. Обсуждается также возможность продукции биопленочными формами
B. pertussis новых антигенов, не входящих в состав современных вакцин [6 — 8].
В настоящее время доказана роль микробных биопленок в развитии целого ряда
инфекций человека. Установлено, что различные виды бактерий формируют биоплен-
ки на любых биотических и абиотических субстратах. Биопленочные формы бактерий
отличаются от планктонных измененным спектром экспрессии генов и обладают по-
вышенной устойчивостью к факторам внешней среды (антибиотикам, дезинфектан-
там, иммунным факторам) [3]. Способность коклюшного микроба формировать био-
пленки в биотических и абиотических условиях, механизмы формирования биопле-
нок, их структура и функция изучены до настоящего времени недостаточно. Изучение
закономерностей формирования биопленок B. pertussis, анализ способности штаммов
коклюшного микроба с различными генотипическими характеристиками к формиро-
ванию биопленок может внести существенный вклад в изучение патогенеза коклюша
и совершенствование средств профилактики этой инфекции.
Цель работы заключалась в выборе оптимальных условий культивирования для
образования биопленок B. pertussis и сравнительная оценка способности разных
штаммов формировать биопленки.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Биопленочные формы B. pertussis культивировали в 96-луночных пластиковых
планшетах в соответствии с ранее описанным методом [10] в нашей модификации.
В опытах использовали вакцинный штамм № 475 (серовар 1.2.3) и селекциониро-
ванный из этого штамма штамм № 475а [5]. В качестве инокулята для получения
биопленок использовали ночную культуру штаммов, выращенных на плотной пита-
тельной среде («Бордетелагар», ГНЦПМБ, г.Оболенск) и жидкой (шуттелируемой)
синтетической питательной среде [4]. Концентрацию микробных клеток (МОЕ/мл)
определяли с помощью отраслевого стандартного образца мутности (ОСО42-28-85-
08 П, 10 МЕ, Научный центр экспертизы средств медицинского применения).
Культуры, выращенные на жидкой и плотной питательных средах, доводили до
концентрации микроорганизмов 20 МОЕ/мл. Затем коклюшные культуры титрова-
ли в пробирках с жидкой синтетической питательной средой начиная с 10 МОЕ/мл
до 0,01 МОЕ/мл с двукратным интервалом. Каждое разведение культур в объеме 200
мкл вносили в 4 — 8 лунок круглодонных 96-луночных планшетов (Nunc, Дания).
Дополнительно в 4 — 8 лунок вносили жидкую синтетическую питательную среду
в качестве негативного контроля. Планшеты накрывали крышкой и выдерживали в
термостате при 370С в течение 24 и 48 ч. После окончания культивирования бактерий
из лунок планшета осторожно удаляли питательную среду с планктонными клетка-
ми. Затем лунки с биопленками промывали 2-3 раза стерильным фосфатно-солевым
буферным раствором рН 7,2. После этого в каждую лунку добавляли по 200 мкл 0,1%
раствора генциан-фиолетового. Планшеты выдерживали с красителем в течение
10-15 минут при комнатной температуре, после чего удаляли из лунок несвязавший-
ся краситель, тщательно промывая планшеты водопроводной водой. Планшеты пе-
реворачивали на фильтровальную бумагу вверх дном и высушивали при комнатной
температуре. Затем в лунки добавляли 95% этиловый спирт в объеме 200 мкл. Через
2-3 мин содержимое лунок переносили в чистые 96-луночные плоскодонные план-
шеты («Linbro») и измеряли оптическую плотность (ОП) при длине волны 620 нм с
помощью вертикального спектрофотометра «Multiskan FC», Finland. Интенсивность
образования биопленок оценивали по показателям ОП окрашенного растворителя
по отношению к негативному контролю как плотные (t>4), умеренные (t≤4), слабые
(t≤2), отсутствие биопленок [2]. Статистический анализ проводили с использованием
пакета прикладных программ Excel (Microsoft, США) с применением параметричес-
ких методов сравнения при нормальном распределении (t-критерий Стьюдента).
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
На первом этапе исследований были разработаны оптимальные условия обра-
зования биопленок микробными клетками B. pertussis: интенсивность образования
биопленок при различных концентрациях клеток при засеве на 96-луночные поли-
стироловые планшеты, длительность культивирования. Также было проведено срав-
нительное изучение способности формирования биопленок культурами B. pertussis,
выращенными в жидкой и плотной питательных средах. Полученные результаты
приведены в табл. 1. Результаты опытов выявили существенные различия между ин-
тенсивностью образования биопленок культурами штамма № 475, выращенными в
жидкой и плотной питательных средах.
При этом культуры, полученные с плотной питательной среды, формировали
более выраженные биопленки, чем культуры с жидкой питательной среды. Суточные
культуры с жидкой питательной среды формировали умеренные биопленки в диапа-
зоне доз 5 — 1,25 МОЕ/мл при отсутствии роста на более низких дозах. Увеличение
срока культивированиия до 48 ч сопровождалось некоторым увеличением интен-
сивности образования биопленок. Плотные биопленки формировались при дозах
5-1,25 МОЕ/мл, а умеренные в дозах 0,625 — 0,157. Суточные культуры с плотной
питательной среды формировали плотные биопленки при посевных дозах от 5 до
0,625 МОЕ/мл, а умеренные в дозах 0,313-0,079 МОЕ/мл. При увеличении срока
культивирования до 48 ч были получены плотные биопленки при всех испытанных
посевных дозах (5-0,04 МОЕ/мл). Таким образом, оптимальный срок культивиро-
вания, позволяющий оценить интенсивность образования биопленки B. pertussis,
составил 24 ч.
После отработки условий культивирования мы провели сравнительное изуче-
ние способности образования биопленок двумя штаммами B. pertussis: вакцинным
штаммом № 475 и селекционированным из него штаммом № 475а. Полученные
с плотной питательной среде культуры штаммов выращивали в полистироловых
планшетах фирмы Nunc в течение суток. Приведенные в табл. 2 данные указыва-
ют на значительные различия между исследованными штаммами по интенсивности
образования биопленок. Исходный штамм № 475 формировал плотные биопленки
при посевной дозе в диапазоне от 10 до 1,25 МОЕ/мл, умеренные от 0,625 до 0,157
МОЕ/мл и слабые биопленки в дозе 0,079 МОЕ/мл. При более низкой посевной
дозе формирования биопленок не происходило. Селекционированный штамм отли-
чался от исходного повышенной способностью образования биопленки. Плотные
биопленки формировались при посевной дозе в диапазоне от 10 до 0,4 МОЕ/мл и
только при дозе 0,02 МОЕ/мл формировались умеренные биопленки.
Таким образом, нами был разработан достаточно простой и воспроизводимый
метод, позволяющий оценивать способность штаммов B. pertussis формировать био-
пленочные культуры на абиотическом субстрате. Установлено оптимальное время
культивирования, проведено сравнительное изучение интенсивности образования
биопленок культурами, выращенными на жидкой и плотной питательных средах.
Более интенсивной рост биопленок культур, полученных с плотной питательной
среды, по сравнению с планктонными культурами, может быть обусловлен особен-
ностью экспрессии поверхностных структур, ответственных за адгезию микробных
клеток на субстрате. Важное значение имеют выявленные нами выраженные отли-
чия между штаммами № 475 и № 475а по способности к формированию биопленок.
Штамм № 475а был селекционирован из исходного штамма № 475 и отличался от
него повышенной вирулентностью и повышенным уровнем продукции коклюшно-
го токсина [5]. Таким образом, прослеживается определенная связь между интен-
сивностью формирования биопленок и вирулентностью исследованных штаммов.
Повышенная способность к образованию биопленок селекционированным штам-
мом может быть связана с изменением экспрессии факторов, обеспечивающих
прикрепление микробных клеток к субстрату и межклеточные взаимодействия.
Полученные результаты открывают новые возможности в исследовании механизмов
формирования биопленок B. pertussis, вирулентности штаммов с различными гено-
типическими характеристиками и факторов, влияющих на эти процессы.

Об авторах

Е. М. Зайцев

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

М. Б. Брицина

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

М. Н. Озерецковская

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Н. У. Мерцалова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

И. Г. Бажанова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Список литературы

Дополнительные файлы