Specific humoral immunity after immunization with vaccine contained Leningrad-3 (L-3) mumps virus strain of different potency

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Вспышки паротитно-вирусной инфекции (ПВИ) в популяции с уровнем охвата специфической иммунизацией — хорошо известный феномен [4, 5, 10, 14]. Дискутируется вопрос о снижении показателей поствакцинального иммунитета с течением времени, особенно в условиях уменьшения циркуляции «диких» штаммов вирусов паротита (ВП) и соответственно снижения их бустерного влияния [8-10, 13, 15]. Многолетние наблюдения за эффективностью иммунизации паротитной вакциной в разных странах свидетельствует о необходимости мониторинга функционального состояния специфического иммунитета [5, 6], т.к. лишь некоторая часть поствакцинальных антител (АТ) иммунологически функциональна [3, 5, 6, 10]. Наиболее точно отражает функциональную активность противопаротитных АТ реакция нейтрализации [5, 6, 10]. Некоторые исследователи сходятся во мнении, что несмотря на серологическую монотипичность ВП, при анализе протективности паротитной вакцины необходимо оценивать спектр нейтрализующей активности специфических АТ, предпочтительно к «диким» штаммам ВП, циркулирующим на данной территории [4, 5, 11]. Все производители живых вакцин, в состав которых входит паротитный компонент, гарантируют минимальное (не менее) содержание ВП в прививочной дозе, которое обеспечивает сероконверсию у реципиентов [Rubin S.A. et al., 2013]. В открытых источниках отсутствуют результаты сравнительных исследований показателей специфического иммунитета после иммунизации паротитной вакциной с разным содержанием ВП в прививочной дозе. В настоящем исследовании проведено сравнительное изучение показателей специфического иммунитета у здоровых добровольцев в течение трех лет после иммунизации сериями паротитной вакцины c разным уровнем специфической активности вакцинного штамма ВП в прививочной дозе. В динамике оценивали общий уровень, зрелость (авидность) и функциональную активность специфических АТ, т.е. спектр и уровень нейтрализующей активности к разным штаммам ВП МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследование было организовано как рандомизированное и слепое. Для участия в исследованиях приглашали здоровых (без хронических заболеваний) мужчин в возрасте 18-25 лет без вакцинации против эпидемического паротита и без паротит-но-вирусной инфекции в анамнезе. Все добровольцы дали письменное согласие на участие в исследованиях. Все исследования были согласованы с этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор». До начала исследований сыворотки добровольцев были проверены на отсутствие специфических антител (IgM и IgG) к ВП с использованием наборов ИФА (Enzygnost, Siemens Healthcare Diagnostics) и в реакции нейтрализации (РН) с ВП шести разных генотипов, включая вакцинный штамм «Л-3». В итоге, для дальнейших исследований были отобраны 60 человек с отсутствием специфического гуморального иммунитета к ВП. Добровольцы рандомизировано были разделены на две равные группы и привиты двумя разными сериями паротитной вакцины производства НПО «Микроген». Одна группа добровольцев была привита серией паротитной вакцины «Х» со специфической активностью ВП 4,82 lg ТЦД50 в одной прививочной дозе (по данным производителя).Вторая группа добровольцев была привита серией вакцины «Y» со специфической активностью ВП 5,23 lg ТЦД50 в одной прививочной дозе (по данным производителя). В течение 21 суток после вакцинации проводили ежедневный медицинский осмотр добровольцев. В течение последующих 3 лет в динамике на 1, 3, 6, 9, 12, 24 и 36 месяцы у добровольцев брали образцы сыворотки крови. Собранные образцы сывороток хранили при температуре — 80 °С до одномоментного проведения исследований. При исследовании образцов оценивали титр специфических АТ, их функциональную активность (уровень и спектр нейтрализующей активности), а также зрелость (авидность). Определение специфических АТ в сыворотке проводили с использованием наборов ИФА (Enzygnost, Siemens Healthcare Diagnostics). Использовали установленную производителем систему оценки результата: отрицательный ≤ 1:100, положительный ≥1:200, пороговый (равнозначный) < 1:200 и >1:100. Оценку авидности специфических АТ проводили по ранее описанной методике [14]. Индекс авидности (ИА) определяли как процентное соотношение показателя абсорбции до и после обработки 6М мочевиной. Использовали установленную систему оценки ИА для паротитных АТ: ИА≤31% — низкий, ИА ≥32% — высокий [Narita M. et al., 1998]. Реакцию нейтрализации (РН) проводили с вакцинными штаммами ВП: «Ленинград-3» («Л-3»), «Enders» (генотип А) и «Urabe» (генотип В), предоставленными Т.Н.Юнасовой (ФГБУ НЦЭСМП МЗ РФ), а также с «дикими» штаммами ВП: «Dragoon» (генотип «C», номер GenBank AY681495), «Petronov» (генотип «Н», номер GenBank AY669145) и «London-1» (генотип D), предоставленным доктором S. Rubin (FDA, США) по ранее описанной методике [4-6]. Отрицательный контроль (неиммунную сыворотку) использовали при проведении каждой РН. Титр 1:4 (2 -log2 ) был принят как пороговый в РН [Rubin S.A. et al., 2008]. Полученные в результате проведенных исследований нейтрализующие титры (НТ) были трансформированы в -log2 для статистической обработки. Средние значения титров АТ в группах выражали как среднее геометрическое (GM) ± стандартное отклонение (SD), а средние значения ИА в группах выражали как среднее арифметическое (M) ± SD. Статистический анализ проводили с вычислением Student’s t-test (two-tail, paired) при сравнении исследуемых показателей в динамике в одной группе и с вычислением Mann-Whitney U-test при сравнении аналогичных показателей между группами. Для проверки взаимосвязи между показателями рассчитывали ранговый коэффициент корреляции Спирмена (r). Статистическую достоверность определяли как р≤0.05. Было проведено прогнозирование уровнz специфических АТ по окончании периода наблюдения с помощью линейных трендов через функцию «предсказание» (Microsoft Excel 2010).РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Ни у одного привитого добровольца не было отмечено каких-либо поствакцинальных реакций. В течение 3 лет после проведенной вакцинации ни у одного участника не была зарегистрирована паротитно-вирусная инфекция. Результаты измерения специфических АТ и их авидности представлены на рис. 1 и 2. Через 1 месяц после вакцинации сероконверсия в ИФА была выявлена у семерых привитых в группе «Y» и четверых в группе «Х», а с 3 месяца все участники были серопозитивными. Далее динамика титра специфических АТ в ИФА была схожа вне зависимости от титра ВП в прививочной дозе (рис.1).

 

Рис. 1. Динамика специфических АТ в сыворотке крови вакцинированных добровольцев после однократной иммунизации паротитной вакциной сериями с разной специфической активностью ВП в прививочной дозе. 0 месяц — до вакцинации; «Х» — группа добровольцев, привитых серией вакцины со специфической активностью ВП 4,82 lg ТЦД50 в одной прививочной дозе; «Y» — группа добровольцев, привитых серией вакцины со специфической активностью ВП 5,23 lg ТЦД50 в одной прививочной дозе (здесь и на рис. 2, 3). Значения титров АТ в ИФА представлены, как GM±SD.

Рис. 2. Динамика ИА специфических АТ в сыворотке крови вакцинированных добровольцев после однократной иммунизации паротитной вакциной сериями с разной специфической активностью ВП в прививочной дозе. Значения ИА в ИФА представлены, как M±SD.

 

Рис. 3. Динамика титров нейтрализующих АТ к вакцинному штамму ВП «Л-3» в сыворотке крови вакцинированных добровольцев после однократной иммунизации паротитной вакциной сериями с разной специфической активностью ВП в прививочной дозе. Значения титров АТ в РН представлены, как GM±SD.

При сравнении титров специфических АТ между двумя группами привитых добровольцев статистическая разница не была выявлена на всем периоде наблюдения, U-test p> 0,05. Максимальный уровень специфических АТ наблюдался на 9 месяце после вакцинации. Затем на 36 месяце после вакцинации в крови добровольцев обеих групп отмечалось достоверное падение титра специфических АТ (t-test p< 0,004), хотя сами титры при этом оставались положительными (≥1:100). Максимальные средние значения ИА в обеих группах добровольцев наблюдались на 18 месяце и составляли в обеих группах (М) >32%, что свидетельствует о формировании зрелого специфического иммунитета. Достоверной разницы между группами по ИА не было выявлено, U-test p>0,05. Следует отметить, что после достижения максимальных значений ИА в обеих группах достоверного падения показателя не наблюдалось до конца наблюдения, t-test p>0,05. Ни в одной из групп не было выявлено корреляции между титром АТ и уровнем ИА. Через 3 месяца после иммунизации у всех участников отмечена сероконверсия в РН с вакцинным штаммом ВП «Л-3». Динамика НТ к штамму ВП «Л-3» была схожа в обеих группах добровольцев вне зависимости от титра ВП в прививочной дозе (рис.3). При сравнении НТ к штамму ВП «Л-3» в сыворотке крови привитых между группами достоверной разницы не выявлено ни на одной точке исследования (U-test p > 0,05). С 6 месяца после вакцинации и до конца строка наблюдения в сыворотке крови всех привитых добровольцев в обеих группах титры в РН к вакцинному штамму ВП «Л-3» были ≥ 3-log2. Максимальные титры нейтрализующих антител наблюдались на 12 месяце и сохранялись на 18 месяце (4,76±0,61-log2 и 4,86±0,66 -log2) в группе добровольцев «X» и «Y» соответственно. Затем к 36 месяцу отмечалось достоверное падение НТ к штамму ВП «Л-3» в обеих группах (t-test p<0,05). С 6 месяца после вакцинации привитые в обеих группах обладали НТ в полном спектре, т.е. ко всем 5 гетерологичным штаммам ВП, использованным в нашем исследовании. Максимальные НТ к гетерологичным штаммам ВП наблюдались через 12 месяцев и сохранялись через 18 месяцев в обеих группах, и составляли >2 -log2, min 2,42±0,5 -log2, max 3,07±0,63-log2 (табл.).. При сравнении НТ к соответствующим гетерологичным штаммам ВП между двумя группами привитых добровольцев достоверная разница не выявлена (U-test p>0,4). Ожидаемо НТ к данным штаммамВП в обеих группах добровольцев были достоверно ниже, чем НТ к вакцинному штамму ВП «Л-3» (U-test р<0,005) в течение всего периода наблюдения (табл.). При сравнении НТ к разным штаммам ВП минимальная разница у добровольцев обеих групп наблюдалась между НТ к вакцинному штамму ВП «Л-3» и НТ к штаммам ВП генотипов «А», «В» и «D» (1,3-1,4 раза, t-test p<0,05), а максимальная разница наблюдалась между НТ к вакцинному штамму ВП «Л-3» и НТ к штаммам ВП генотипов «С» и «H» (1,6-1,9 раза, t-test p<0,005). У всех привитых добровольцев на протяжении всего периода наблюдения не выявлена корреляция между титрами специфических АТ и НТ к штамму «Л-3» (r= -0,23-0,031), также как и между титром специфических АТ в ИФА и титрами в РН со всеми 5 штаммами ВП была крайне слабой. Отмечена положительная корреляция между НТ к штамму «Л-3» и НТ к 5 гетерологичным штаммам ВП (r=0.63-0.79) у добровольцев обеих групп на протяжении периода c 12 по 24 месяц после вакцинации. Однако на 36 месяце наблюдения корреляция между НТ к штамму «Л-3» и НТ к ВП генотипов «C» и «H» достоверно упала до r=0.42-0.46 (p<0.05). В целом, соответствующие коэффициенты корреляции между НТ специфических АТ у привитых добровольцев обеих групп не отличались (p>0,03). При проведении математического прогнозирования с помощью расчета линейного тренда средние геометрические титры (СГТ) специфических АТ в сыворотке крови опустились бы ниже пороговых значений (1:100) в группе привитых серией «Х» через 6 лет после иммунизации, а в группе привитых серией «Y» через 8 лет после иммунизации. При аналогичном расчете линейного тренда НТ к вакцинному штамму ВП «Л-3» опустились бы ниже порогового уровня (<1:4) в группе добровольцев с серией «X» через 7 лет после иммунизации и через 9 лет после иммунизации в группе добровольцев с серией «Y». При расчете линейного тренда НТ к штаммам генотипов C и Н опустились бы ниже уровня пороговых значений через 5 лет после иммунизации у добровольцев обеих групп; НТ к остальным гетерологичным штаммам ВП опустились бы ниже порогового уровня через 6 лет в обеих группах добровольцев. Следует учесть, что данный математический прогноз был проведен для однократно привитых добровольцев без учета вероятности встреч реципиентов с «дикими» штаммами ВП и соответственно их бустерного влияния. В представленном исследовании обе группы добровольцев имели сходные демографические и анамнестические характеристики. Ни у кого из 60 привитых добровольцев не было выявлено каких-либо значимых поствакцинальных реакций. Полная сероконверсия с учетом не только уровня специфических АТ в ИФА, но и НТ к вакцинному штамму ВП «Л-3» была зарегистрирована у всех добровольцев обеих групп через 3 месяца после вакцинации. Полный спектр нейтрализующих АТ в РН с 5 гетерологичными штаммами ВП был отмечен в сыворотке добровольцев через 6 месяцев после вакцинации. Максимум «функциональной» активности специфических АТ в соответствии с полученными показателями ИА и уровнем НТ в РН с 6 штаммами ВП наблюдался на 12-18 месяцы после вакцинации, при этом сам уровень специфических АТ в ИФА снижался с 12 месяца. Отсутствие корреляции между уровнем специфических АТ, измеренным в ИФА, и уровнем НТ в РН с вакцинным штаммом ВП, продемонстрированное в настоящем исследовании, было также ранее показано другими исследователями [2, 3, 11]. Данный феномен объясняется, прежде всего, использованием разных антигенов ВП в серологических методиках. Некоторые исследователи предлагают использовать один и тот же антиген ВП и в ИФА, и в РН для определения уровня протективности паротитной вакцины [2, 3, 14]. На наш взгляд, наиболее целесообразно использовать именно вакцинный штамм ВП как в ИФА, так и в РН. Такой универсальный подход позволил бы более объективно оценить уровень поствакцинального иммунитета. На данном этапе отсутствует единое мнение относительно уровня протективности специфических АТ к ВП [3]. Большинство исследователей расценивает именно НТ ≥ 3-log2 , как «вероятно протективные» [7, 11]. В нашем исследовании НТ к вакцинному штамму ВП на уровне ≥ 3-log2 обеспечивали полный спектр нейтрализующей активности (к 5 гетерологичным штаммам ВП) на уровне НТ ≥ 2-log2 в обеих группах привитых добровольцев. Нейтрализующая активность специфических АТ была разной в зависимости от штамма ВП, используемого при проведении РН. Аналогичные результаты были продемонстрированы ранее [2, 7]. Известно, что вспышки ПВИ среди вакцинированного молодого населения объясняются не только падением иммунитета, но и существующей разницей в антигенной структуре между вакцинным штаммом и циркулирующими «дикими» штаммами ВП [12]. Нейтрализующая активность специфических АТ к наиболее генетически отдаленным штаммам ВП в нашем исследовании была статистически ниже нейтрализующей активности АТ к вакцинному штамму ВП. Поэтому ожидаемо, что при отсутствии контактов НТ с «дикими» штаммами ВП упадут ниже протективного быстрее, чем НТ к вакцинному штамму ВП в РН. При математическом расчете трендов в нашем исследовании оказалось, что НТ специфических АТ к «диким» штаммам ВП оказались бы ниже порогового уровня практически в одно время в обеих группах добровольцев, т.е. независимо от титра ВП в прививочной дозе. Некоторые исследователи [3, 13] предлагают дополнительно исследовать нейтрализующую активность сыворотки к «диким» штаммам ВП, т.к. именно способность специфических АТ нейтрализовать «дикие» штаммы ВП является маркером протективности паротитной вакцины. На наш взгляд, целесообразно проводить комплексное исследование поствакцинального иммунитета, включая титр специфических АТ в ИФА и их нейтрализующую активность с использованием антигена вакцинного штамма ВП в обоих методах исследования, а также дополнительно определять спектр и уровень нейтрализующей активности специфических АТ к циркулирующим «диким» штаммам ВП. Такое комплексное исследование поствакцинального иммунитета позволит объективно оценить его протективный уровень и даже прогнозировать ситуацию по эпидемическому паротиту в регионе. В представленном исследовании серии паротитной вакцины, несмотря на значительную разницу в специфической активности штамма ВП «Л-3» в одной прививочной дозе (2,76 раза, U-test p>0,005), обеспечивали формирование специфического иммунитета (по 8 показателям) на одинаковом уровне у 60 однократно привитых добровольцев. Относительно высокая специфическая активность ВП в прививочной дозе может явиться причиной трансмиссии вакцинного штамма ВП, а в некоторых случаях причиной повышенной «реактогенности» самой вакцины для «чувствительного» реципиента [1, 6]. Производители вакцин против ВП чаще всего гарантируют минимальный эффективный уровень специфической активности ВП в вакцине, не ограничивая ее верхний предел. Исходя из полученных результатов, а также данных ранее проведенных исследований [1, 2, 6] представляется целесообразным контролировать или ограничивать верхний предел специфической активности ВП в прививочной дозе паротитной вакцины. Мониторинг поствакцинального иммунитета после двукратной иммунизации с использованием предложенного в нашем исследовании комплексного подхода позволит сделать более определенный вывод о целесообразности ограничения верхнего предела специфической активности ВП в прививочной дозе паротитной вакцины. Такое ограничение, на наш взгляд, позволит снизить количество неблагоприятных событий после иммунизации, в том числе трансмиссию вакцинного штамма ВП, а также сделать производство паротитной вакцины более экономичным.

About the authors

E. V. Оtmshevskaya

Scientific and Production Association for Immunobiological Preparations «Microgen»

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

Moscow

Russian Federation

M. V. Kulak

State Scientific Centre of Virology and Biotechnology «Vector»

Email: fake@neicon.ru

Koltsovo, Novosibirsk region

Russian Federation

E. K. Bukin

State Scientific Centre of Virology and Biotechnology «Vector»

Email: fake@neicon.ru

Koltsovo, Novosibirsk region

Russian Federation

G. M. Ignatev

Chumakov Federal Scientific Centre for Research and Development of Immune and Biological Products

Email: fake@neicon.ru

Moscow

Russian Federation

References

Supplementary files