Метод определения sIgE к тиреопероксидазе в сыворотке крови больных с аутоиммунными и аллергическими заболеваниями

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Аутоиммунные заболевания щитовидной железы нередко сочетаются с бронхиальной астмой (БА) и хронической спонтанной крапивницей (ХСК) [6, 7]. При этом наиболее частым в этой ассоциации является болезнь Хашимото или аутоиммунный тиреоидит (АИТ). Болезнь поражает преимущественно женщин в возрасте 30— 50 лет и мужчин 40—65 лет. Но существуют также риски возникновения подобных эндокринных нарушений у молодых девушек (после беременности), у подростков и детей. Диагностируют заболевание у 3—5% людей в периоды гормональных сбоев и дисфункций щитовидной железы. Диагностика аутоиммунных заболеваний щитовидной железы выполняется с использованием клинических лабораторных иинструментальных методов анализа и содержит такие показатели, как изменение уровня гормонов, повышение концентрации антител к аутоантигенам щитовидной железы — тиреоглобулину (ТГ), тиреопероксидазе (ТПО) и рецептору тиреотропного гормона (рТТГ), а также оценивают гипоэхогенность железы методом УЗИ и клинические симптоматические признаки. В 85% случаев АИТ протекает бессимптомно в течение нескольких лет. Выявление аутоантител свидетельствует о наличии аутоиммунного процесса. При этом следует отметить, что развитие аутоиммунных реакций в щитовидной железе, прежде всего, связано с определением IgG-аутоантител, тогда как роль IgE-аутореактивности при этих заболеваниях до конца не изучена. В то же время, IgE-аутоантитела к соответствующим аутоантигенам как показатель сниженной функции регуляторного звена иммунитета определяются при многих аутоиммунных заболеваниях (системная красная волчанка, ревматоидный артрит, рассеянный склероз) [12], а также при тяжелых формах бронхиальной астмы [3] и атопическом дерматите[5]. В связи с этим целью работы явилось создание метода определения sIgE к ТПО в сыворотке крови и его апробация у пациентов с аутоиммунными и аллергическими заболеваниями. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалом для исследования служили сыворотки крови 25 больных АИТ, 94 пациентов с ХСК, 47 больных БА, аллергическим ринитом (АР) и 25 образцов сывороток крови здоровых лиц. Возраст пациентов варьировал от 17 до 65 лет. Антиген ТПО из ткани щитовидной железы получали из предварительно осажденной микросомальной фракции тиреоцитов путем солюбилизации с последующей очисткой методом аффинной хроматографии на колонке с CN-Br сефарозой 4B, конъюгированной с МкАТ к ТПО [2, 4]. На всех этапах выделения ТПО чистоту белка контролировали методами ИФА, электрофореза в ПААГ и иммуноблоттинга. По результатам проверки, чистота препарата составляла более 95%. Эпитопную специфичность выделенного антигена ТПО изучали методом конкурентного ИФА с использованием панели моноклональных антител [1, 2]. sIgE к ТПО в сыворотках крови определяли с помощью непрямого твердофазного ИФА. Для этого в лунки полистиролового планшета высокой сорбции производства «Nunc» (ThermoFisherScientific, США) вносили полученный нативный антиген ТПО в оптимальной концентрации 7,5 мкг/мл в 0,01 М карбонаsтном буферном растворе, рН 9,6. Выдерживали планшет в течение 18 часов при 4 о С. Затем после 3-кратной отмывки 0,01 М фосфатно-солевым буферным раствором с 0,05 % твин-20 рН 7,2 (ФСБ-Т) в лунки планшета вносили исследуемые образцы сыворотки крови человека в разведении 1:10 в ФСБ и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 о С, далее отмывали 3 раза ФСБ-Т. Выявление в сыворотке крови sIgE, связавшихся с ТПО, осуществляли с помощью моноклональных антител к IgE (8Е/4F4), конъюгированных с пероксидазой хрена (ООО «Полигност», Санкт-Петербург). Планшеты инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 о С, после отмывали 3 раза в ФСБ-Т. Ферментативную реакцию регистрировали по изменению окраски субстратно-хромогенной смеси (ТМБ) в течение 20 мин при комнатной температуре. Оптическую плотность раствора в лунках планшета измеряли на фотометре вертикального сканирования Anthos 2020 при длине волны 450 нм. Результаты считали положительными при значениях ОП, превышающих удвоенное значение ОП порогового уровня в лунках отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали пул сывороток здоровых доноров. Во всех исследованных образцах сыворотки больных и здоровых лиц исследовали уровень гормонов щитовидной железы (ТТГ, Т4 свободный, Т3) методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов реагентов производства фирмы «Алкор Био» (Россия).РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведенных экспериментов был получен высокоочищенный препарат ТПО (рис.), чистота >95 %, с ферментативной активностью 60±15 ед.акт./мг. По данным электрофореза и иммуноблоттинга визуализировался белок с м.м. 110 кДа. Полученный образец нативной пероксидазы щитовидной железы содержал пять иммунодоминантных участков, определенных при исследовании эпитопной структуры антигена [1]. Кроме того, ТПО содержала сложный конформационный эпитоп, образованный двумя линейными участками 606-617 а.о. и 706-720 а.о., к которому выявляются аутоантитела (IgG) у 82% больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы.

Электрофореграмма препаратов ТПО на стадии аффинной очистки в 10 % ПААГ (концентрация белка равнялась 10 мкг/трек): дорожка 1 — препарат ТПО, очищенный методом аффинной хроматографии; дорожка 2 — супернатант солюбилизированной МФТ.

На следующем этапе разработан иммуноферментный метод определения sIgE к ТПО в сыворотке крови человека, в основе которого — аффинно-очищенный белок ТПО и коньюгат моноклональных антител к IgE. Апробацию метода проводили с образцами 25 сывороток крови здоровых лиц, 25 больных АИТ, 94 пациентов с ХСК и 47 больных аллергическими заболеваниями. Все пациенты с установленным диагнозом АИТ (длительность заболевания более 10 лет) и повышенным уровнем IgG-аутоантител к ТПО находились на гормонозаместительной терапии, при этом уровень гормонов (ТТГ, Т3,Т4 свободный) находился в пределах нормы. Аллергические заболевания были представлены аллергическим ринитом (АР) интермитирующего и персистирующего течения (n=6) и БА среднетяжелого и тяжелого персистирующего течения с длительностью заболевания более 10 лет (n=41). Длительность заболевания ХСК составила от 1 года до 25 лет. У 34 (36%) больных ХСК с помощью кожного тестирования с аутосывороткой была подтверждена аутоиммунная форма заболевания (ХАК); у 60 — крапивница была идиопатической (ХИК). Определение sIgE к ТПО показало, что в сыворотке крови пациентов с ХСК аутоантитела выявляются у 17 (18%) из 94 человек. При этом sIgE к ТПО в сыворотке крови определялись как при аутоиммунной, так и при идиопатической форме заболевания и не были связаны с гендерным распределением и возрастом пациентов. Следует отметить, что sIgE-аутоантитела обнаруживали у больных ХСК с длительностью заболевания менее 4 лет. У больных аллергическими заболеваниями sIgE к ТПО выявлены у 1 из 6 пациентов с АР и у 9 из 41- с БА. Обращает на себя внимание отсутствие sIgE к ТПО в сыворотках больных АИТ, тогда как IgGаутоантитела определяли в диапазоне от 70 до 500 МЕ/мл при норме до 50 МЕ/мл. В сыворотке крови здоровых лиц sIgE к ТПО не были обнаружены.В последнее время все большее внимание привлекают исследования, посвященные изучению аутореактивности у больных с аллергическими и аутоиммунными заболеваниями. Снижение в ряде случаев регуляторных механизмов иммунитета может привести к нарушению толерантности к собственным аутоантигенам, циркулирующим в крови. Одним из таких аутоантигенов является ТПО. В нашей работе был разработан метод твердофазного ИФА определения аутоантител sIgE класса к ТПО в сыворотке крови больных с разными хроническими воспалительными заболеваниями. Был получен высокоочищенный препарат нативной ТПО, по своим характеристикам: чистоте, иммунологическим свойствам и ферментативной активности, не уступающий зарубежным аналогам. Проведенное нами ограниченное авторское испытание метода определения sIgE к ТПО с 25 образцами сыворотки крови больных АИТ, 94 образцами сыворотки больных ХСК, 47 образцами сывороток больных аллергией и 25 образцами сывороток здоровых лиц, позволило выявить в ряде из них наличие sIgE аутоантител. Появление sIgE к ТПО, также как и к другим тканевым аутоантигенам в сыворотке крови больных БА, отражает проявление аутореактивности у пациентов с более тяжелым и длительным течением заболевания [3]. В то же время, у больных ХСК эти антитела выявлялись у лиц с длительностью заболевания менее 4 лет. При АИТ не выявлялись sIgE к ТПО, что, может быть, связано как с наличием выраженного дозозависимого IgG иммунного ответа к ТПО при интерференции с IgE антителами, с одной стороны, так и с возможным снижением sIgE в циркуляции, связанным с высокой цитофильностью sIgE, с другой стороны. В этом наши результаты согласуются с данными зарубежных исследований. Так, Concha L.B. et al. показали, что в сыворотке крови 32 больных, содержащей IgG к антигенам щитовидной железы, только у 2 из 20 пациентов с ХСК были обнаружены IgE аутоатитела: у 1 пациента антитела выявлялись к ТПО и у одного — к ТГ. В то же время, у 12 лиц без крапивницы таковые не обнаружены [8]. Исследованию sIgE к антигенам щитовидной железы (ТПО, ТГ) у больных ХСК посвящены еще несколько работ. В двух из них авторам удалось выявить повышенный, более чем в 2 раза, уровень sIgE к ТПО в образцах сыворотки крови пациентов с ХСК в сравнении с образцами сывороток крови здоровых лиц [7, 14]. В двух исследованиях результаты детекции sIgE к ТПО были отрицательными [11, 15]. Как известно, аутоиммунное воспаление щитовидной железы начинается постепенно и протекает бессимптомно длительное время. При этом в сыворотке крови под влиянием различных стрессорных факторов, в том числе вирусных инфекций, появляются аутоантигены, стимулирующие иммунную систему. На минимальные дозы аутоантигенов иммунная система реагирует прежде всего IgE-аутореактивностью. По мере увеличения антигенной нагрузки (при более выраженном воспалительном повреждении ткани) иммунный ответ переключается на IgG. Данные о том, что IgE-аутоантитела, включая sIgE к ТПО, могут индуцировать симптомы ХСК, подтверждаются активацией тучных клеток и базофилов [10, 13, 14], а также эффективностью терапии омализумабом у пациентов с ХСК [9]. Таким образом, ранняя диагностика аутоиммунных процессов в щитовидной железе с использованием метода определения sIgE к ТПО, наряду с IgG-аутоантителами, у больных с иммуно-опосредованными заболеваниями, в том числе при ХСК, позволит своевременно диагностировать патологию щитовидной железы и обеспечить адекватную своевременную терапию.

Об авторах

А. В. Зубков

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru

Зубков Александр Владимирович - кандидат медицинских наук.

105064, Москва, М. Казенный пер., 5а, р.т. (495) 917-52-42

Россия

Н. С. Кузьмта

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru

Москва

Россия

С. А. Мазурина

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru

Москва

Россия

Л. Г. Бутова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru

Москва

Россия

Н. М. Рахматулина

Казанская государственная медицинская академия

Email: fake@neicon.ru
Россия

Н. А. Сибгатулина

Казанская государственная медицинская академия

Email: fake@neicon.ru
Россия

B. Б. Гервазиева

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru

Москва

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы