Characteristics of bifidobacteria biological properties in gut microflora disorders in HIV-infected children

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Бифидобактерии являются активными регуляторами кишечного микробиоценоза [1, 3]. Они осуществляют модуляцию состава и численности факультативной микрофлоры кишечника не только за счет формирования антагонистических
взаимоотношений с условно патогенной и патогенной микрофлорой, но и за счет
влияния на их свойства. Это реализуется за счет выделения экзометаболитов, подавляющих факторы персистенции условно патогенной микрофлоры (УПМ), что
повышает чувствительность этих бактерий к факторам естественной резистентности
макроорганизма [3, 14].
Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что микроэкологические нарушения кишечника чаще характеризуются снижением популяционного
уровня индигенных микроорганизмов и увеличением интенсивности колонизации
слизистой кишечника УПМ [4, 5]. У ВИЧ-инфицированных детей условно патогенные микросимбионты нередко являются причиной вторичных бактериальных
инфекций [10, 12, 13]. При этом практически отсутствуют данные о биологических
свойствах бифидобактерий при ВИЧ-инфекции, что не позволяет эффективно проводить коррекцию микроэкологических нарушений у данной категории пациентов
и предупреждать развитие у них осложнений.
Цель исследования — оценить биологические свойства бифидобактерий у ВИЧинфицированных детей при различных степенях дисбактериоза кишечника для определения направлений коррекции бифидофлоры при ВИЧ-инфекции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изучены биологические свойства 103 культур бифидобактерий, в том числе 58
от ВИЧ-инфицированных детей и 45 от детей группы сравнения. Диагноз ВИЧ-инфекция детям был поставлен на основании эпидемиологических, клинических и
лабораторных данных. Критерием включения в группу сравнения было отсутствие
у детей ВИЧ-статуса. Гендерные и возрастные характеристики сравниваемых групп
были сходными.
Забор материала и бактериологическое исследование содержимого толстой
кишки проведено в соответствии с действующими нормативными документами
[9]. Состояние микробиоценоза кишечника оценивали согласно [7]. Выделение и
определение количественного содержания бифидобактерий осуществляли методом серийных разведений с использованием Бифидум-среды (ФБУН ГНЦ ПМБ,
Оболенск). Для создания анаэробных условий применяли анаэростаты (BBL, США)
и газогенерирующие пакеты (НПО «Новое дело», Санкт-Петербург). Верификацию
бактерий на родовом уровне осуществляли по специфическому ферменту фруктозо-6-фосфат фосфокетолазе (Ф-6-ФФК). У бифидобактерий изучали адгезивную
способность (индекс адгезии микроорганизмов — ИАМ) [2], гидрофобность (Н),
кислотообразование [8], антиоксидантную активность (Еаоа — единицы антиоксидантной активности) [11], отсроченный антагонизм [6].
Для статистического анализа использовали программно-методический комплекс анализа данных IBM SPSS Statistics / PS IMAGO. Закон распределения исследуемых данных отличался от нормального, поэтому достоверность различий в парных
независимых совокупностях определяли с помощью непараметрических критериев
оценки достоверности (критерия U Манна-Уитни и критерия χ2 ). Различия считали
значимыми при p<0,05. Средние значения количественных показателей представлены в виде медианы и значений 25 и 75 процентилей — Me (LQ; UQ). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
У детей независимо от ВИЧ-статуса чаще регистрировали дисбактериоз кишечника II степени (41,5% у ВИЧ+ и 48,6% у ВИЧ- ) и III степени (33,8% у ВИЧ+ и
43,3% у ВИЧ- ) (p>0,05). Изменения кишечного микробиоценоза характеризовались снижением количественного уровня индигенной микрофлоры и повышением
содержания условно патогенных микроорганизмов. Уже при I степени дисбактериоза кишечника у ВИЧ-инфицированных детей отмечали дефицит бифидобактерий
(p<0,01). При этом титр типичных кишечных палочек у детей основной группы
превышал аналогичный показатель в группе сравнения практически на 2 lg КОЕ/г
(p<0,001) (табл.).
II степень микроэкологических нарушений кишечника у ВИЧ-инфицированных детей характеризовалась дальнейшим снижением уровня колонизации слизистой кишечника бифидобактериями (p<0,05). Количественный уровень типичных
кишечных палочек по сравнению с начальной степенью дисбактериоза снижался и
достигал нормальных значений. У детей с ВИЧ-статусом при II степени дисбактериоза кишечника регистрировали более высокие титры УПМ, в частности микроорганизмов рода Klebsiella и Staphylococcus (p<0,05).
При III степени дисбактериоза кишечника у ВИЧ-позитивных детей количественное содержание бифидобактерий, лактобацилл и типичных кишечных палочек
было достоверно ниже, чем у ВИЧ-негативных (p<0,05), тогда как титры УПМ не
отличались от детей группы сравнения (p>0,05).
Установлено, что при I степени микроэкологических нарушений у ВИЧ-инфицированных популяция бифидобактерий характеризовалась средними показателями гидрофобности Н составил 51,3% (40,3; 68,2) и специфической адгезии, ИАМ составил 2,64 (2,33; 3,25). У бифидобактерий, выделенных от детей группы сравнения, показатели, характеризующие колонизационный потенциал, были сходными
(p>0,05). Гидрофобность в среднем была равна 56,7% (43,2; 77,9), а ИАМ 3,17 (2,24;
4,17). При I степени дисбактериоза штаммы бифидобактерий от ВИЧ-позитивных
детей обладали средней кислотообразующей активностью, титруемая кислотность
в популяции бактерий в среднем составила 98,30
Т (71,4;127). Кислотообразование
бифидобактерий от ВИЧ-негативных детей характеризовалось как высокое и составило в среднем 1010
Т (86; 122,6) (p>0,05); 64,3% бифидобактерий при ВИЧ-инфекции проявляли антагонизм к облигатным представителям кишечного микробиоценоза. Антагонистические отношения в 57,1% случаев формировались с Escherichia
coli lac+, в 7,2 % случаев с Enterococcus faecalis. Частота формирования антагонизма
в популяции бифидобактерий от ВИЧ-негативных детей с I степенью дисбактериоза была выше и составила 72,7%, однако разница с основной группой была статистически незначима (χ2 =6,33; df=1; p=0,56). Также, как у ВИЧ-инфицированных, в
54,5% случаев формировались антагонистические отношения с облигатными представителями кишечного микросимбиоценоза — с E.coli lac+ и E.faecalis. Однако в
18,2 % случаев у ВИЧ-негативных детей регистрировали антагонизм бифидобактерий к условно патогенным коккам и представителям семейства Enterobacteriaceae
(χ2 =7,5; df=1; p=0,02).
При II степени дисбактериоза у бифидобактерий от ВИЧ-инфицированных детей снижалась гидрофобность клеточной поверхности. Популяционный показатель
гидрофобности у них составил только 45,75% (33; 58,8). В группе ВИЧ-негативных
детей гидрофобность клеток по сравнению с I степенью дисбактериоза кишечника
практически не изменялась, составляя 58,15% (45,78; 88,58), что было статистически
выше, чем в группе ВИЧ-инфицированных (p<0,05).
У бифидобактерий от ВИЧ-позитивных детей снижалась способность к специфической адгезии до 2,5 (2,0; 2,9). У детей без ВИЧ-статуса с усугублением микроэкологических нарушений показатель специфической адгезии практически не изменялся и составлял 3,2 (2,9; 3,8). При этом различия среди бифидобактерий в способности
адгезироваться в группе ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных детей была статистически значимы (p<0,001). Изменение показателей специфической и неспецифической адгезии бифидобактерий при II степени дисбактериоза приводило у ВИЧ-инфицированных детей к снижению их количественного уровня до 8,7 lg КОЕ/г. У детей
группы сравнения показатель плотности колонизации бифидобактериями снижался не так значительно, как у ВИЧ-положительных детей — с 10,2 lg КОЕ/г до 9,3 lg
КОЕ/г. Несмотря на то, что у пациентов с ВИЧ-статусом при дисбактериозе II степени кислотообразование бифидобактерий падало до 67,30
Т (53,0; 97,4), тем не менее,
частота формирования антагонистических взаимоотношений сохранялась на уровне
68,9%. Это согласуется с данными литературы о том, что продукция органических
кислот является важным, но не главным фактором антагонизма у бифидофлоры [14].
При этом, в 37,8% случаев бифидофлора у ВИЧ-инфицированных детей проявляла
антагонизм к УПМ. Количество продуцируемых бифидобактериями кислот в группе ВИЧ-негативных детей статистически значимо отличалось от основной группы
(p<0,001). Кислотообразование характеризовалось как высокое и составляло 1030
Т
(81; 125,5). Также как в группе ВИЧ-инфицированных, в 70% случаев бифидобактерии проявляли антагонизм к кишечной микрофлоре, при этом в 50% случаев это был
антагонизм по отношению к УПМ (χ2 =3,06; df=1; p=0,08).
При III степени микроэкологических нарушений штаммы бифидобактерий,
изолированные от ВИЧ-позитивных детей, в 58,9% случаев характеризовались как низкогидрофобные, значение Н не превышало 22,7% (15,8; 46,6). При этом в группе сравнения гидрофобность бифидобактерий была в 2 раза выше и составляла
54,58% (36,85; 76,63), разница была статистически значима (p<0,001). Показатель
специфической адгезии бифидобактерий в группе ВИЧ-позитивных детей при
III степени дисбактериоза кишечника не отличался от аналогичного показателя при
микроэкологических нарушениях II степени и составлял 2,4 (1,92; 3,69). В группе ВИЧнегативных детей, специфическая адгезия бифидофлоры была статистически выше и
достигала 3,17 (2,24; 4,18) (p<0,01). Вследствие нарушения как специфической, так
и неспецифической адгезии количественный уровень бифидобактерий у ВИЧ-инфицированных был снижен до 7,5 lg КОЕ/г. Также у них при III степени дисбактериоза
относительно II степени не изменялась способность бифидобактерий к кислотообразованию — 66,30
Т (48,9; 94,9). Показатель статистически значимо отличался только от
показателя кислотности при I степени дисбактериоза в группе ВИЧ-положительных
пациентов (p<0,05). Кислотообразование бифидобактерий, изолированных от ВИЧнегативных детей, было статистически выше: 101,50
Т (86,1; 122,6) (p<0,001). Обращает
на себя внимание снижение у детей с ВИЧ-статусом при III степени микроэкологических нарушений в 2 раза частоты антагонизма (до 33,3%) бифидофлоры по отношению к другим членам микробиоценоза (p<0,05). При этом только в 12,8% случаев
бифидофлора проявляла антагонизм к УПМ. У ВИЧ-негативных детей с III степенью
микроэкологических нарушений кишечника, наоборот, происходило увеличение до
94% частоты антагонизма со стороны бифидофлоры. В 76,4% случаев антагонистические взаимоотношения формировались с УПМ (χ2 =1,4; df=1; p=0,02).
По данным литературы на всех стадиях ВИЧ-инфекции отмечают снижение
активности в сыворотке крови супероксиддисмутазы (СОД), снижение соотношения СОД/глутатионпероксидаза, которое коррелирует с развитием генерализованных осложнений [13]. В просвете кишечника при микроэкологических нарушениях
также регистрируют увеличение содержания в кишечнике токсических форм кислорода [4]. Это, в свою очередь, может являться одним из факторов, определяющих
количественное содержание бифидобактерий и УПМ в кишечнике. Способность
бифидобактерий инактивировать токсические формы кислорода связывают, прежде
всего, с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав их клеточной
стенки, и с продукцией серосодержащих аминокислот. Также у бифидобактерий
функционируют ферментные антиоксидантные системы — НАДН-оксидаза, НАДНпероксидаза, а некоторые виды бифидофлоры продуцируют каталазу [14]. В связи с
этим, мы изучили антиоксидантную активность бифидобактерий. Установлено, что
при I степени дисбактериоза антиоксидантные свойства штаммов в сравниваемых
группах были сходными (p>0,05). Антиоксидантная активность бифидобактерий у
ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных детей составила 1,5 Eаоа (1,1; 1,7) и 1,7 Eаоа (1,2;
1,7) соответственно. При II степени дисбактериоза у бифидобактерий от ВИЧ-инфицированных детей происходило снижение антиоксидантных свойств в 1,9 раза,
по сравнению с ВИЧ-негативными детьми (p<0,01). Антиоксидантная активность в
сравниваемых группах составляла 0,8 Eаоа (0,6; 1,0) и 1,5 Eаоа (1,3; 1,6) соответственно. Обращает на себя внимание, что показатели антиоксидантной защиты бифидофлоры при II степени дисбактериоза у ВИЧ-негативных детей сохранялись практически, как при I степени. При усугублении микроэкологических нарушений до III
степени у ВИЧ-инфицированных пациентов регистрировали дальнейшее снижение
активности антиоксидантных систем бифидобактерий, которая не превышала в
среднем 0,4 Eаоа (0,3; 0,6). У штаммов, выделенных от ВИЧ-негативных детей, антиоксидантная активность составляла 0,9 Eаоа (0,8; 1,1) (p<0,01).Частота микроэкологических нарушений кишечника с учетом степени тяжести
у ВИЧ-инфицированных детей не отличалась от аналогичного показателя в группе
ВИЧ-негативных детей (p>0,05). Чаще всего в сравниваемых группах регистрировали дисбактериоз кишечника II степени и III степени. У детей с ВИЧ-статусом
уже при I степени дисбактериоза отмечали снижение титров бифидобактерий до 8,7
(7,9: 9,1) lg КОЕ/г. В группе ВИЧ-негативных пациентов количественный уровень
бифидофлоры был статистически выше и достигал 10,2 (9,8; 11) lg КОЕ/г (p<0,05).
Бифидобактерии от ВИЧ-позитивных детей на начальной стадии дисбактериоза по
показателям специфической адгезии, гидрофобности, кислотообразованию, антиоксидантной активности не отличались от бифидофлоры детей без ВИЧ-статуса
(p<0,05). Однако они не проявляли антагонизма по отношению к УПМ. Несмотря
на то, что более половины штаммов бифидобактерий вступали в антагонистические
отношения с E. coli lac+, тем не менее, количественный уровень данных микросимбионтов превышал допустимые значения нормы и составлял 9,3 (8,5; 10) lg КОЕ/г. По
данным многочисленных исследований высокое количественное содержание представителей семейства Enterobacteriaceae, в том числе типичной кишечной палочки,
является маркерным признаком кишечного микробиоценоза при ВИЧ-инфекции,
т.е полученные данные согласуются с литературными [14]. Однако, формирование
«энтеробактериального» типа микробиоценоза при I степени микроэкологических
нарушений у ВИЧ-инфицированных происходит при сохранении регулирующего
влияния бифидофлоры.
При II степени дисбактериоза кишечника титры бифидофлоры у детей с
ВИЧ-статусом снижались до 7,9 (7,5; 8) lg КОЕ/г и отличались от титров в группе ВИЧ-негативных детей (p<0,05). У бифидобактерий ВИЧ-позитивных детей по
сравнению с ВИЧ-негативными пациентами отмечали статистически более низкие
показатели гидрофобности клеточной поверхности, адгезивной и кислотообразующей способности, антиоксидантных свойств штаммов (p<0,05). Несмотря на то,
что частота формирования антагонизма в сравниваемых группах бифидобактерий
не отличалась, тем не менее, бифидофлора у ВИЧ-позитивных детей в 1,5 раза реже
вступала в антагонистические взаимоотношения с УПМ. Поэтому при II степени
микроэкологических нарушений мы также как при I степени регистрировали высокий количественный уровень (6,4 lg КОЕ/г) энтеробактерий, в частности представителей рода Klebsiella (p<0,05). Кроме того, статистически значимые различия
регистрировали по среднему содержанию стафилококков, титры которых при ВИЧинфекции и II степени микроэкологических нарушений составляли 4 (3,2; 4,5) lg
КОЕ/г (p<0,05).
При III степени микроэкологических нарушений при ВИЧ-инфекции отмечали глубокий дефицит бифидофлоры, так как их средний количественный уровень
не превышал 7,5 (7,0; 8,0) lg КОЕ/г. Изменялись и биологические свойства бифидофлоры. Бифидобактерии у ВИЧ-инфицированных имели низкую гидрофобность,
тогда как в группе ВИЧ-негативных гидрофобность была в 2 раза выше (p<0,001).
Статистически значимые различия также наблюдали в отношении показателей кислотообразования и антиоксидантной защиты (p<0,001). При этом у бифидобактерий
в группе ВИЧ-негативных детей гидрофобность, специфическая адгезия, кислотообразование при III степени дисбактериоза не изменялись, а частота антагонизма
даже возрастала с 70 до 94%. Вероятнее всего, это является проявлением процесса
саморегуляции кишечного микробиоценоза, который реализуется путем компенсаторного повышения активности доминантных микросимбионтов. При ВИЧ-инфекции включение компенсаторных механизмов, направленных на стабилизацию микробиоценоза, не наблюдалось. Частота антагонизма бифидофлоры снижалась в 2
раза, по сравнению со II степенью дисбактериоза (p<0,05), и только 12,8% штаммов
бифидобактерий у ВИЧ-инфицированных проявляли антагонизм по отношению к
УПМ. Помимо бифидобактерий при III степени дисбактериоза у ВИЧ-позитивных
лиц были снижены титры лактобацилл и типичных кишечных палочек. В группе
сравнения дефицит лактобацилл и кишечных палочек наблюдался в 1,5 — 2 раза
реже (p<0,05).
Таким образом, у ВИЧ-инфицированных детей при I степени микроэкологических нарушений целесообразно проводить коррекцию количественного уровня
бифидобактерий. При II и III степенях дисбактериоза кишечника необходима разработка подходов, связанных с модуляцией биологических свойств бифидофлоры.
Основными точками приложения для коррекции свойств бифидобактерий при
ВИЧ-инфекции являются их поверхностные характеристики, антиоксидантная защита и активность сахаролитических ферментов.

About the authors

Yu. V. Zakharova

Kemerovo State Medical University

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

Захарова Юлия Викторовна - кандидат медицинских наук

650056, Кемерово, ул. Ворошилова, 22 А, р.т. (3842) 73-28-71

Russian Federation

L. A. Levanova

Kemerovo State Medical University

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

T. A. Shternis

Kemerovo State Medical University

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

A. S. Sukhikh

Kemerovo State Medical University

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

A. A. Marcovskaya

Kemerovo State Medical University

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

References

Supplementary files