Получение конъюгатов на основе наночастиц коллоидного золота для быстрого выявления антител к вирусу гепатита Е

Полный текст

Введение

Вирус гепатита Е (ВГЕ) — частая причина вирусных гепатитов не только на территориях с низким уровнем водоснабжения и гигиены, но и в промышленно развитых странах [1]. Европейская ассоциация по изучению печени рекомендует следующие критерии для клинической диагностики случаев острого гепатита Е (ГЕ): одновременное присутствие в анализируемых пробах РНК ВГЕ и специфических IgM- и/или IgG-антител (IgM-AT, IgG-AT), повышение титров IgG-АТ на фоне присутствия IgM-АТ, выявление антигена (АГ) ВГЕ. Диагноз хронического ГЕ подтверждается обнаружением РНК ВГЕ и/или АГ-ВГЕ в течение более 3 мес. О перенесённой инфекции судят по присутствию в образцах специфических IgG [2]. Золотым стандартом диагностики острых и хронических случаев ГЕ остаётся полимеразная цепная реакция, позволяющая определять вирусную РНК на самых ранних стадиях заболевания и при отсутствии специфических антител у пациентов с иммунодефицитом при хроническом ГЕ. В ряде случаев более надёжными и специфичными являются серологические методы диагностики ГЕ [3], которые из-за короткого периода вирусемии при ГЕ в большинстве случаев не имеют альтернативы [4]. У каждого традиционно применяемого метода серодиагностики ГЕ есть ограничения, затрудняющие точное определение стадии заболевания. Из-за трудностей, связанных с культивированием вируса, в тест-системах для диагностики ГЕ используют в основном рекомбинантные АГ, реже — синтетические пептиды.

Проблему ускоренного получения результатов предварительной лабораторной диагностики ГЕ решает использование экспресс-тестов для выявления специфических IgG-, IgM-, суммарных АТ и АГ-ВГЕ. Как правило, такие тесты основаны на методе иммунохроматографического анализа (ИХА) с применением коллоидного золота, конъюгированного с рекомбинантными АГ или АТ к вирусным белкам и/или иммуноглобулинам человека или животных. Наряду с ускоренным проведением анализа (15 мин), большим преимуществом метода является возможность тестирования у постели больного в отсутствие специального оборудования и обученного персонала. Разработанные и выпускаемые зарубежными компаниями тест-системы в формате ИХА для выявления АГ-ВГЕ и АТ к нему показали хорошую воспроизводимость при достаточно высоких показателях чувствительности, специфичности и хорошей согласованности результатов с данными, полученными с помощью классического иммуноферментного анализа (ИФА). Ряд сравнительных испытаний показал, что ИХА-тесты для выявления IgM-АТ к ВГЕ, производимые в Китае («IgM antibody to hepatitis E virus (HEV-IgM) rapid test», «Wantai», кат № WJ-15) и Сингапуре («MP Diagnostics ASSURE HEV IgM Rapid Test», «MP Biomedicals Asia Pacific Pte. Ltd.», кат. № 43160-020), обладают даже более высокой чувствительностью, чем некоторые традиционные ИФА-тесты [5]. Канадские компании «Citest Diagnostics Inc.» и «BiogateLabs» выпускают иммунохроматографические тест-системы для одновременного определения IgG- и IgM-АТ к ВГЕ (кат № IHE-302, кат № RT-EV1112-C-1 соответственно) в сыворотке, плазме и цельной крови. В России и странах постсоветского пространства тест-системы для быстрого выявления серологических маркеров ГЕ методом ИХА не производятся, нет также сообщений о проводимых в этом направлении исследованиях.

Ключевыми компонентами диагностических экспресс-тестов, предназначенных для выявления серологических или биохимических маркеров различных заболеваний, наряду со специфическими АГ или АТ, являются конъюгаты коллоидных наночастиц с биологическими макромолекулами, применение которых позволяет проводить визуальный или цифровой учёт результатов реакции [6–9]. Известно, что уникальные оптические свойства наночастиц золота (НЧЗ) обусловлены явлением поверхностного плазмонного резонанса, что проявляется интенсивной полосой поглощения в видимой области спектра. Пики поглощения поверхностных плазмонов наблюдаются у синтезированных НЧЗ в области длин волн около 520 нм в зависимости от размера синтезированных НЧЗ [10]. К преимуществам применения конъюгатов на основе НЧЗ в методах экспресс-диагностики можно отнести возможность визуальной детекции результатов, что связано с высокими молярными коэффициентами поглощения [9, 11], а также их способность к полному восстановлению свойств после сорбции на мембране и последующего её высушивания [12, 13]. Диагностическая эффективность ИХА-тестов определяется способностью конъюгата НЧЗ специфически взаимодействовать с молекулами-мишенями, которая, с одной стороны, связана с физико-химическими свойствами НЧЗ, в частности, с их размером и формой, а с другой — с антигенной специфичностью сорбированных на них белков, выполняющих дополнительную функцию вторичной стабилизации коллоидных частиц в составе конъюгатов.

Все тест-системы для выявления АТ к ВГЕ основаны на применении в качестве антигенной основы капсидного белка ORF2, содержащего диагностически значимые эпитопы. Ранее нами был получен [14] рекомбинантный АГ (рекАГ) ORF2 ВГЕ 3-го генотипа, имеющего наиболее широкое географическое распространение в мире [15, 16] и доминирующего на территории России [17]. Данный рекАГ выбран нами в качестве основы для последующей разработки экспресс-теста для одновременного определения антител IgG и IgM к ВГЕ.

Цель данного исследования — получение конъюгатов НЧЗ нескольких размеров с рекАГ и оценка возможности их применения в иммуноанализе для выявления IgG-антител к ВГЕ.

Материалы и методы

Иммунореагенты

Использовали поликлональные АТ козы против IgG человека (GAHIss; «Имтек»), рекАГ ORF2 ВГЕ 3-го генотипа (НИИВС им. И.И. Мечникова) [18], поликлональные IgG-АТ кролика к рекАГ, полученные путём иммунизации кроликов и последующей аффинной очистки (НИИВС им. И.И. Мечникова); конъюгат моноклональных АТ мыши к рекАГ с пероксидазой хрена (НИИВС им. И.И. Мечникова), полученный методом перйодатного окисления [19].

Сыворотки крови людей с диагнозом острого вирусного ГЕ были предоставлены Национальным институтом общественного здоровья Министерства здравоохранения Киргизской Республики и Белорусским государственным медицинским университетом. По результатам тестирования в наборе реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-HЕV-G» (НПО «Диагностические системы») [20, 21] и разработанном в НИИВС им. И.И. Мечникова подтверждающем тесте для определения IgG-АТ к ВГЕ методом лайн-блота [22] сыворотки содержали (n = 17) и не содержали (n = 17) IgG-АТ к ВГЕ.

Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов или их законных представителей. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23.07.2010). Протокол исследования одобрен Локальным советом по этике НИИВС им. И.И. Мечникова (протокол № 4 от 22.02.2023).

Растворы наночастиц золота

НЧЗ с заданным размером частиц получали цитратным методом, используя в качестве прекурсора золотохлороводородную кислоту HAuCl₄×3H₂О («Aldrich») [11–13]. Учитывая, что средний диаметр частиц уменьшается при увеличении концентрации цитрата в реакционной смеси [12], для получения препаратов НЧЗ с разными размерами частиц использовали различные количества восстановителя. К 99 мл деионизированной воды добавляли 1 мл 1% раствора HAuCl₄×3H₂О, раствор при перемешивании нагревали до кипения, после чего добавляли различные объёмы 1% водного раствора цитрата натрия C₆H₅Na₃O₇×2H₂O («Merck»).

Раствор кипятили с обратным холодильником 20 мин при перемешивании, затем охлаждали до комнатной температуры и измеряли спектры поглощения в диапазоне длин волн 400–700 нм с помощью планшетного спектрофотометра «Multiskan GO» («Thermo Scientific»). Структуру НЧЗ исследовали на растровом просвечивающем электронном микроскопе «JEOL JEM ARM200F» атомного разрешения (HAADF-STEM), оснащённом системой энергодисперсионного анализа на основе спектрометра «GIF Quantum» с детектором «CENTURIO EDX» разрешающей способности 0,08 нм при ускоряющем напряжении 200 кВ в STEM-режиме («Jeol») [23, 24]. Препараты для исследования готовили путём нанесения образца, предварительно разбавленного до поглощения 1,0 опт. ед. при длине волны 520 нм, на покрытые плёнкой углерода медные сетки.

Синтез конъюгатов

Оптимальные условия получения конъюгатов НЧЗ с рекАГ подбирали в соответствии с рекомендациями [25, 26]. В лунки 1–11 вертикальных рядов 96-луночного полистиролового планшета («Greiner») вносили по 10 мкл раствора рекАГ с концентрацией 1–50 мкг/мл в фосфатном буфере. Затем в лунки А–Н горизонтальных рядов планшета вносили по 100 мкл растворов НЧЗ с рН 5,5–9,0 таким образом, чтобы каждый столбец соответствовал определённой концентрации рекАГ, а каждый ряд — значению рН раствора. Через 15 мин во все лунки добавляли по 20 мкл 10% раствора NaCl и спустя 10 мин измеряли оптическое поглощение растворов при длинах волн 520 и 580 нм (А₅₂₀, А₅₈₀). Стабилизирующую концентрацию рекАГ оценивали по разности «А₅₂₀ – А₅₈₀» [25].

Конъюгаты НЧЗ с рекАГ получали, добавляя по каплям 10 мл раствора НЧЗ с рН 8,0 к раствору рекАГ до концентрации рекАГ 25 мкг/мл для НЧЗ-1, до 30 мкг/мл для НЧЗ-2 и до 40 мкг/мл для НЧЗ-3. Далее смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 30 мин на приборе «Multi-Reax» («Heildorf»), вносили 10% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА; «Sigma») до конечной концентрации 0,25% и инкубировали 15 мин в прежних условиях. Затем раствор центрифугировали 30 мин при 4ºС и скорости 8–11 тыс. об/мин в зависимости от размера НЧЗ. Осадок суспендировали в 1 мл фосфатного буфера с 0,1% БСА, 10% сахарозы и 0,01% азида натрия и регистрировали спектры поглощения. Полученные конъюгаты НЧЗ с рекАГ хранили при 4ºС.

Результат посадки рекАГ на поверхность НЧЗ контролировали методом ИФА [25]. В лунках планшета сорбировали поликлональные IgG-АТ кролика к рекАГ в концентрации 5 мкг/мл в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,6. Блокировку планшета осуществляли раствором 0,02 М фосфатно-солевого буфера рН 7,2 с 0,05% Твин-20 с 5% сахарозы, 0,09% казеината натрия. В лунки вносили по 100 мкл супернатантов, полученных после центрифугирования конъюгатов НЧЗ с рекАГ. В качестве конъюгата в ИФА использовали меченные пероксидазой хрена моноклональные АТ, в качестве хромогена — 0,5 мМ раствор 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина. Калибровочные образцы представляли собой серию разведений рекАГ (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,31, 0,15 мкг/мл) в надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования раствора коллоидного золота. Концентрацию рекАГ в исследуемых образцах определяли по калибровочному графику зависимости значений оптической плотности при длине волны 450 нм от концентраций рекАГ в калибровочных образцах.

Реакция дот-иммуноанализа

Для проведения дот-иммуноанализа в сэндвич-формате на дисках нитроцеллюлозной мембраны (0,45 мкм) диаметром 13 мм сорбировали АТ в количестве 0,1; 0,05; 0,025 и 0,0125 мкг, в качестве отрицательного контроля наносили 0,1 мкг раствора БСА в 0,02 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2. Свободные участки мембран блокировали 0,09% раствором казеината натрия в фосфатно-солевом буфере. Мембраны инкубировали с сывороткой, содержащей специфические IgG-АТ, в течение 1 ч в термошейкере («Eppendorf») при 37ºС, затем 30 мин — с растворами конъюгатов НЧЗ с рекАГ (А₅₂₀ = 0,5 ед. опт. пл.) при комнатной температуре. Интенсивность окрашивания опытных и контрольных пятен на мембранах оценивали визуально.

Иммунохроматографический анализ

Растворы антител наносили на мембраны для иммунохроматографии с помощью автоматического диспенсера «IsoFlow» («Imagene Technology»): поликлональные IgG-АТ кролика к рекАГ — в контрольной зоне, АТ — в аналитической (тестовой) зоне, — со скоростью 0,2 мкл на 1 мм длины мембраны. На стекловолоконной мембране сорбировали конъюгат НЧЗ с рекАГ в оптимальной концентрации А₅₂₀ = 4 ед. опт. пл., которую определили, меняя разведения конъюгатов в интервале значений А₅₂₀ = 2–8 ед. опт. пл. на 3 положительных образцах сывороток для каждого разведения.

Сборку мультимембранного композита и нарезку тест-полосок осуществляли с помощью ручного ламинатора «MTB 300» («Kinbio Tech Co. Ltd.») и резака гильотинного типа «Cutter ZQ2002» («Kinbio Tech Co. Ltd.»). При проведении ИХА 20 мкл сыворотки крови наносили на участок иммунохроматографической тест-полоски для образца, далее край полосы опускали в 80 мкл фосфатно-солевого буфера, через 2–3 мин тест-полоску выкладывали на горизонтальную поверхность и через 15 мин оценивали результат, который учитывали как положительный при окрашивании любой интенсивности контрольной и аналитической зон и как отрицательный при отсутствии окрашивания аналитической зоны. В случае отсутствия окрашивания контрольной зоны результат не учитывали.

Для цифровой оценки результатов анализа тест-полоски сканировали на приборе «Gel Doc XR» («Bio-Rad») с программным обеспечением «Image Lab Software». Коэффициент позитивности (КП) рассчитывали по отношению интенсивности окрашивания аналитической зоны к фоновому окрашиванию тест-полоски.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ R и «MS Excel 2013».

Результаты

Методы получения коллоидного золота описаны в научной литературе достаточно подробно [11, 26–29]. С учётом приведённых рекомендаций, опирающихся в основном на модификации цитратного метода Френса, для получения НЧЗ диаметром 15–40 нм, оптимальным для эффективной сорбции антител, были синтезированы препараты НЧЗ со средним размером частиц 16 нм (НЧЗ-1), 25 нм (НЧЗ-2) и 41 нм (НЧЗ-3). Синтез НЧЗ проводили, добавляя в реакционную среду (к 50 мл 0,01% HAuCl₄×3H₂О) 1% раствор цитрата натрия в объёме 1, 0,75 и 0,5 мл. На магнитной мешалке устанавливали температуру 300ºС и режим перемешивания 375 об/мин, скорость перемешивания усиливали до 500 об/мин при появлении красного окрашивания [27]. Избыток цитрат-анионов на поверхности НЧЗ стабилизирует золь золота, не препятствуя в дальнейшем взаимодействию НЧЗ с макромолекулами белка при получении иммунометрических конъюгатов. Проверка стабильности коллоидных растворов показала, что они сохраняли свои характеристики при хранении в темноте при 4ºС в течение не менее 6 мес.

Важными характеристиками НЧЗ являются положение и конфигурация полосы поверхностного плазмонного резонанса, поэтому для всех препаратов НЧЗ исследовали спектры поглощения (рис. 1). Увеличение размера частиц сопровождалось ростом интенсивности окрашивания растворов и смещением максимума поглощения в область более длинных волн: для НЧЗ-1 — 518 нм; НЧЗ-2 — 522 нм; НЧЗ-3 — 528 нм.

 

Рис. 1. Спектры поглощения растворов НЧЗ-1, НЧЗ-2, НЧЗ-3 и их конъюгатов с рекАГ.

Fig. 1. Absorption spectra of GNP-1, GNP-2, GNP-3 solutions and their conjugates with recAg.

 

Средний размер и форму НЧЗ оценивали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рис. 2). На снимках с высоким разрешением заметна относительная гомогенность частиц по форме и размерам в каждой группе. Более мелкие частицы имеют преимущественно сферическую форму, в препарате образца НЧЗ-3 отмечается присутствие наночастиц, отклоняющихся по форме от правильной сферической, что согласуется с классификацией строения наночастиц в зависимости от их размера [30].

 

Рис. 2. Фотографии НЧЗ, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

а — НЧЗ-1; б — НЧЗ-2; в — НЧЗ-3.

Fig. 2. Photographs of GNP obtained by means of TEM.

а — GNP-1; b — GNP-2; c — GNP-3.

 

Величина среднего размера частиц, оцененная с помощью просвечивающей электронной микроскопии, составила 16, 25 и 41 нм для НЧЗ-1, НЧЗ-2 и НЧЗ-3 соответственно, что хорошо согласовывалось со значениями, заданным условиями синтеза, и свидетельствовало о высокой технологичности и воспроизводимости использованного метода.

Настоящее исследование ограничивалось получением НЧЗ трех размеров с целью сопоставления результатов с данными, приведёнными в литературе [31–33].

Три группы НЧЗ были охарактеризованы с использованием пакета программ R с построением диаграмм размаха (функции Box Plot) (рис. 3). Степень дисперсии максимальна для частиц самого большого размера НЧЗ-3 (30–56 нм). Для НЧЗ-1 разброс минимален (14–18 нм), размеры для НЧЗ-2 находились в интервале 20–37 нм. Количественные данные проверяли на соответствие закону нормального распределения по критерию W Шапиро–Уилка (р ≤ 0,05) и положению медиан для НЧЗ-1, НЧЗ-2 и НЧЗ-3. Для всех препаратов НЧЗ распределение размеров немного отличалось от нормального.

 

Рис. 3. Распределение НЧЗ-1, НЧЗ-2 и НЧЗ-3 по размерам (функции Box Plot).

Fig. 3. Size distribution diagrams for GNP-1, GNP-2, and GNP-3 (Box Plot functions).

 

Получение маркеров на основе НЧЗ для использования в ИХА чаще всего базируется на нековалентной (адсорбционной) конъюгации белков с поверхностью наночастиц в связи с технологической простотой данного подхода, а также с сохранением нативной структуры и свойств макромолекул в составе получаемых комплексов, в частности, их иммунореактивности [27, 34, 35]. Нековалентные связи при этом образуются за счёт электростатических взаимодействий между отрицательно заряженной наночастицей и положительно заряженными участками на поверхности белка, гидрофобных притяжений между белком и поверхностью металла, донорно-акцепторных взаимодействий между металлом и электронами атомов азота и серы в составе белка [26]. Образование комплексов НЧЗ с белками сопровождается формированием стабилизирующей белковой оболочки вокруг них, что неоднократно подтверждено экспериментально [35, 36]. В настоящей работе для получения конъюгатов препаратов НЧЗ с рекАГ также была использована методика пассивной иммобилизации.

С целью получения устойчивого золя были оптимизированы условия адсорбции рекАГ на поверхности НЧЗ с учётом физико-химических свойств белка: молекулярной массы, растворимости, изоэлектрической точки (pI = 5,43) и концентрации, стабилизирующей коллоидную систему. Стабилизирующую концентрацию белка определяли в интервале значений рН 5,5–9,0 для НЧЗ всех трех размеров. На рис. 4 в качестве примера представлены кривые зависимости показателя А₅₂₀ – А₅₈₀ от концентрации белка при различных значениях рН для НЧЗ-2.

 

Рис. 4. Зависимость разности оптического поглощения А₅₂₀ – А₅₈₀ раствора НЧЗ-2 (25 нм) от концентрации рекАГ при разных значениях рН раствора.

Fig. 4. Dependence between the optical absorption difference A₅₂₀ – A₅₈₀ of the GNP-2 solution (25 nm) and the concentration of recAg at different pH values of the solution.

 

Добавление NaCl в растворы НЧЗ с низкими концентрациями рекАГ приводило к агрегации нестабилизированных белком НЧЗ, что отражалось в увеличении поглощения при λ = 580 нм. При этом происходило изменение окраски раствора с красного на серо-голубой. Достижение стабилизирующих концентраций рекАГ сопровождалось возрастанием и далее сохранением величины показателя А₅₂₀ – А₅₈₀, стабильностью золя и цвета раствора в присутствии электролита.

В кислой среде система была менее стабильна, что, возможно, обусловлено меньшей устойчивостью золей в растворах со значением рН, близким к изоэлектрической точке рекАГ (5,36). При рН ≥ 7 различие между полученными кривыми было незначительно, поэтому синтез конъюгатов НЧЗ с рекАГ проводили при рН = 8. Стабилизирующие концентрации рекАГ определялись значениями, при которых кривые выходили на плато (20 мкг/мл для НЧЗ-1, 25 мкг/мл для НЧЗ-2 и 30 мкг/мл для НЧЗ-3). С увеличением размера НЧЗ концентрация рекАГ, стабилизирующая коллоидную систему, возрастала. В дальнейшем, в соответствии с рекомендациями [34], для получения конъюгатов были использованы концентрации рекАГ, на 10–15% превышающие стабилизирующую.

Результат взаимодействия белка с НЧЗ при получении конъюгатов исследовали, сравнивая спектры поглощения НЧЗ и их конъюгатов с рекАГ. Связывание НЧЗ в растворе с молекулами белка приводит к достаточному для детекции смещению пика поверхностного плазмонного резонанса НЧЗ. Величина этого сдвига обусловлена размером частиц и может быть параметром при оценке связывающей активности адсорбированного белка [35]. В литературе описан метод определения состава конъюгатов НЧЗ с белками, основанный на оценке собственной флуоресценции несвязанных белковых молекул [36]. Белки могут быть по-разному ориентированы на поверхности НЧЗ в зависимости от их размера, что, в свою очередь, может приводить к различной биологической активности конъюгатов, и, таким образом, размер НЧЗ может влиять на реакционную способность адсорбированных белков. На полученных спектрах поглощения растворов конъюгатов НЧЗ с рекАГ максимум поглощения смещён в длинноволновую область, причём более выраженно для НЧЗ меньшего размера (рис. 1). Эффективность связывания макромолекул белка с поверхностью НЧЗ оценивали по остаточному белку в супернатантах после центрифугирования препаратов конъюгатов [25]. Концентрация остаточного белка в надосадочных жидкостях после 2 циклов центрифугирования для НЧЗ-1 в среднем составила 2,0 и 1,0 мкг/мл, для НЧЗ-2 — 3,0 и 0,8 мкг/мл, для НЧЗ-3 — 4,6 и 2,2 мкг/мл. Количество связавшегося рекАГ соответствовало 88% для НЧЗ-1, 87% — для НЧЗ-2, 84% — для НЧЗ-3, что свидетельствовало о высокой эффективности процесса.

Иммунореактивность конъюгатов подтверждали методом дот-иммуноанализа с образцами сывороток крови людей, содержащих IgG-АТ к ВГЕ. На всех мембранах наблюдалось окрашивание пятен с сорбированными АТ, его яркость несколько снижалась при последовательных разведениях сорбированных АТ (0,1; 0,05; 0,025 и 0,0125 мкг). Подтверждена реакционная способность всех полученных конъюгатов и возможность их применения с использованием нитроцеллюлозной мембраны в качестве твёрдой фазы (рис. 5). О специфичности конъюгатов свидетельствовало отсутствие окрашивания контрольного антигена (БСА).

 

Рис. 5. Результаты дот-иммуноанализа (A) с применением конъюгатов НЧЗ с рекАг (а — НЧЗ-1; б — НЧЗ-2; в — НЧЗ-3) и ИХА положительных (В) и отрицательных (С) образцов сывороток с применением НЧЗ-3, конъюгированных с рекАГ.

Fig. 5. Results of dot immunoassay using (А) GNP conjugated with recAg (a — GNP-1; b — GNP-2; c — GNP-3) and immunochromatographic analysis of positive (B) and negative (C) serum samples using GNP-3 conjugated with recAg.

 

Конъюгат НЧЗ-3 с рекАГ, при использовании которого имело место стабильное яркое окрашивание реакционной зоны в дот-иммуноанализе, был выбран для проведения модельных экспериментов по ИХА на положительных (n = 17) и отрицательных (n = 17) образцах сывороток крови, предварительно протестированных методом ИФА, по чувствительности, как правило, превосходящей ИХА. В качестве тест-системы сравнения был выбран набор реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-HЕV-G» (НПО «Диагностические системы») как один из лучших на мировом рынке наборов для диагностики ВГЕ [37].

Предварительно подобраны условия формирования контрольной и аналитической зон тест-полоски: концентрации сорбируемых АТ и поликлональных IgG-АТ кролика к рекАГ, скорости их нанесения и условия высушивания мембран. На основании полученных результатов было выбрано разведение конъюгата с А₅₂₀ = 4, при котором наблюдалось достаточно яркое окрашивание тестовой и контрольной полос и отсутствовало фоновое окрашивание мембраны в реакциях с образцами сывороток крови. При увеличении концентрации АТ в аналитической зоне (0,25; 0,5; 1 мг/мл) и поликлональных IgG-АТ кролика к рекАГ в контрольной зоне (0,5; 1; 2 мг/мл) происходило усиление окрашивания. При концентрациях АТ 0,5 мг/мл и поликлональных IgG-АТ кролика к рекАГ 2 мг/мл наблюдалось достаточное для визуальной детекции окрашивание контрольной и тестовой полос, поэтому они были выбраны как наиболее приемлемые. При этом учитывали, что при значительном увеличении концентрации сорбированных АТ существует вероятность их частичной десорбции и миграции с потоком по мембране [26, 28].

Аналитические характеристики полученных иммунохроматографических тест-полосок оценивали в реакциях с пробами сывороток крови, содержащими (n = 17) и не содержащими (n = 17) IgG-антитела к ВГЕ (рис. 5). На 34 исследованных образцах, результаты анализа которых представлены на рис. 5, показана 100% чувствительность и 100% специфичность тест-полосок. Все результаты были разделены на три группы по степени окрашивания аналитической зоны: «1+» (КП = 7,8–15,1; Me = 9,6); «2+» (КП = 26,7–35,1, Me = 31,0); «3+» (КП = 58,3–77,7, Me = 62,8). Для большинства (73%) положительных образцов интенсивность окрашивания составила «2+» и «3+», что соответствовало интенсивности окрашивания, удобной для визуальной детекции.

Обсуждение

ИХА основан на движении аналита вдоль мембраны, которое вызывает образование на определённых участках мембраны специфических иммунокомплексов, регистрируемых по окрашиванию. Наиболее часто в иммунохроматографических тестах применяют конъюгаты антигенов и антител с НЧЗ. Методы получения НЧЗ с различными размерами частиц и синтез на их основе конъюгатов с биологическими макромолекулами достаточно полно представлены в литературе [9, 12, 13]. Поскольку оптические свойства НЧЗ зависят от их размера и формы, в проведённом исследовании были синтезированы НЧЗ нескольких размеров, исследованы их физико-химические свойства, получены на их основе конъюгаты с рекАГ ВГЕ и проведена оценка реакционной способности полученных конъюгатов в дот-иммуноанализе и ИХА.

С увеличением диаметра частиц максимум поглощения несколько сдвигался в более длинноволновую область (518 и 522 и 528 нм для НЧЗ-1, НЧЗ-2 и НЧЗ-3 соответственно), что согласуется с данными, приведёнными в литературе [23], а цвет растворов, соответственно, менялся от оранжево-красного у наименьшего размера частиц до пурпурного у коллоидного раствора золота с размером частиц около 41 нм. Согласно данным литературы, увеличение размера частиц до 50 нм и более может приводить к снижению аналитического сигнала [32, 33], поэтому мы ограничились полученными НЧЗ трёх размеров: 16, 25 и 41 нм. Полученные НЧЗ по данным сканирующей электронной микроскопии имели размеры, сопоставимые с размерами, рассчитанными по методу Френса [11].

К настоящему времени предложен ряд методов для экспериментальной оценки количества макромолекул, которые сорбируются на поверхности наночастицы [35, 38], и расчёта концентрации белка для посадки на НЧЗ. При синтезе конъюгата НЧЗ с молекулами антигена важно решение двух основных задач: получение устойчивого золя и сохранение антигенной активности молекул белка. Нами были отработаны оптимальные условия синтеза с учётом влияния на стабильность золя концентрации антигена и рН раствора. Минимальную концентрацию белка, при которой не изменялся цвет смеси, рассматривали как стабилизирующую, т. е. определяющую границы устойчивости золя. Белковая оболочка вокруг коллоидных НЧЗ гидратирована, благодаря чему после нанесения на пористую стекловолоконную мембрану и сушки частицы при последующем взаимодействии с образцом и буфером снова переходят в раствор, не теряя своей реакционной способности. В результате проведённого эксперимента были получены стабильные в течение 6 мес препараты конъюгатов антигена с НЧЗ трёх размеров.

Первичную оценку способности полученных конъюгатов к специфическому взаимодействию с АТ выполняли методом дот-иммуноанализа в формате захвата, что позволило сделать вывод о высокой активности препаратов и их пригодности для использования в тестах с применением нитроцеллюлозных мембран в качестве твёрдой фазы. В реакциях ИХА при увеличении размера НЧЗ аналитический сигнал значительно возрастал, и самая яркая полоса в тестовой зоне наблюдалась при использовании конъюгата с размером частиц 41 нм, что подтверждало возрастание коэффициента экстинкции растворов НЧЗ с увеличением размеров частиц. Увеличение аналитического сигнала при использовании для приготовления конъюгата НЧЗ большего диаметра также может быть связано с тем, что человеческий глаз острее воспринимает более контрастный, характерный для них пурпурный цвет.

Заключение

В работе получены и охарактеризованы НЧЗ размером 16, 25 и 41 нм. Разработаны условия получения конъюгатов НЧЗ с рекАГ, показаны высокая эффективность и специфичность их взаимодействия с IgG-АТ к ВГЕ. Для конъюгата НЧЗ-3 с рекАГ подтверждена возможность использования в ИХА.

Полученный конъюгат планируется использовать при разработке тест-системы для быстрого одновременного определения IgG- и IgM-АТ к ВГЕ. IgG-АТ появляются в крови заболевших через несколько дней после появления IgM-АТ. Длительность персистенции IgM-АТ составляет 6–9 мес, IgG-АТ могут сохраняться в крови переболевших десятилетиями [16]. На ранних сроках заболевания одновременное выявление IgG- и IgM-АТ к ВГЕ является дополнительным инструментом диагностического алгоритма. Обнаружение IgG-АТ может свидетельствовать как об острой или перенесённой инфекции, так и о поствакцинальном иммунитете. Важная область применения экспресс-тестов для определения IgG — проведение эпидемиологических исследований при минимальной лабораторной оснащённости.

Данные результаты получены впервые и могут быть использованы при создании нового ИХА-теста для экспресс-диагностики ГЕ.

Об авторах

Галина Ивановна Алаторцева

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: alatortseva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9887-4061

канд. биол. наук, зав. лаб. клонирования вирусных геномов отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

Россия, Москва

Любовь Николаевна Нестеренко

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: innesterenko3001@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3825-3906

канд. хим. наук, в. н. с. лаб. клонирования вирусных геномов отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

Россия, Москва

Ирина Ильинична Амиантовa

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: amianti@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3483-0128

н. с. лаб. клонирования вирусных геномов отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

Россия, Москва

Людмила Николаевна Притворова

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: lexx294@yandex.by
ORCID iD: 0000-0002-2997-8892

канд. мед. наук, в. н. с. лаб. клонирования вирусных геномов отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

Россия, Москва

Вера Васильевна Доценко

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: verramal@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5866-944X

канд. биол. наук, с. н. с. лаб. клонирования вирусных геномов отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

Россия, Москва

Виталий Васильевич Зверев

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: vitalyzverev@outlook.com
ORCID iD: 0000-0002-0017-1892

д-р биол. наук, профессор, академик РАН, зав. отделом вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе, научный руководитель

Россия, Москва

Оксана Анатольевна Свитич

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389

д-р мед. наук, член-корр. РАН, зав. отделом иммунологии и аллергологии, директор

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы