Молекулярно-генетическая характеристика уропатогенных Escherichia coli, выделенных при бессимптомной бактериурии у беременных

Полный текст

Введение

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одними из самых распространённых инфекционных заболеваний. Ежегодно в мире на их долю приходится до 150 млн случаев. По данным разных авторов, до 50–60% женщин хотя бы один раз в жизни сталкиваются с эпизодом ИМП [1, 2]. Клинические симптомы, связанные с ИМП, могут варьировать по степени тяжести в зависимости как от вирулентных свойств возбудителя, так и от восприимчивости организма к инфекции: от бессимптомного течения (бессимптомная бактериурия — ББУ) до клинически выраженного цистита, пиелонефрита, вплоть до тяжёлого уросепсиса¹. ББУ представляет собой бактериальную колонизацию мочевыводящих путей (МВП) при отсутствии клинических проявлений заболевания. Во время беременности ББУ на протяжении многих лет рассматривается как фактор риска развития пиелонефрита и неблагоприятных исходов беременности (преждевременные роды, рождение детей с низкой массой тела и др.) [3, 4]. Назначение антибактериальных препаратов для лечения ББУ во время беременности может сопровождаться нежелательными эффектами: изменением состава кишечного микробиома беременной, что впоследствии определяет и состав микробиоты новорождённого; нарушением развития иммунной системы ребёнка [5, 6]. Кроме того, антибактериальная терапия может приводить к элиминации потенциально протективных штаммов микроорганизмов, которые предотвращают колонизацию вирулентными уропатогенами, тем самым косвенно способствуя развитию симптоматических ИМП.

Среди возбудителей ИМП доминирующим бактериальным патогеном является Escherichia coli — грамотрицательная, подвижная, факультативно анаэробная палочка, относящаяся к порядку Enterobacteriaceae. E. coli является частью комменсальной микробной популяции кишечника человека и поддерживает стабильность и гомеостаз просветной микробиоты кишечника за счёт симбиотического взаимодействия с организмом человека. Штаммы E. coli, обладающие определёнными факторами вирулентности, способны адаптироваться к новым нишам и вызывать широкий спектр заболеваний кишечной и внекишечной локализации.

E. coli, ассоциированные с ИМП, известны как уропатогенные/uropathogenic E. coli (UPEC) [7]. UPEC обладают множеством как структурных, так и секретируемых факторов вирулентности, необходимых для реализации их патогенного потенциала в МВП. Экспрессия адгезивных органелл, таких как пили 1-го типа, P- и S-фимбрии, позволяет UPEC связываться с рецепторами на поверхности эпителиальных клеток МВП, колонизировать уроэпителий и проникать в клетки и ткани, а также активирует врождённый иммунный ответ. Кроме того, S-фимбриальные адгезины могут экспрессироваться сепсис- и менингит-ассоциированными (neonatal meningitis-associated E. coli — NMEC) E. coli. В патогенезе неонатального менингита также существенную роль играют инвазины, которые встречаются преимущественно у штаммов NMEC. Важным патогенным фактором являются токсины (гемолизин, цитотоксический некротизирующий фактор, вакуолизирующий аутотранспортный токсин, секретируемый аутотранспортный токсин), повреждающие клетки и нарушающие их метаболизм. Продукция сидерофоров (железопереносящих белков) определяет способность E. coli к захвату железа, что повышает жизнеспособность в МВП. Тяжесть симптоматических проявлений ИМП связана с приобретением и экспрессией генов вирулентности. При бессимптомной колонизации МВП UPEC не способны экспрессировать ключевые факторы вирулентности, что, вероятно, является механизмом адаптации к длительной персистенции мочевого пузыря [8].

На основании молекулярного анализа штаммы E. coli делят на филогенетические группы: A, B1, B2, C, D, E, F и G [9]. UPEC чаще всего относятся к филогруппам B2, D и в меньшей степени к группам E и F, тогда как комменсальные штаммы, считающиеся менее вирулентными, принадлежат преимущественно к филогруппам А или В1 [10].

По результатам многочисленных исследований показана связь между наличием генов вирулентности и филогруппами UPEC [11–13]. Однако количество исследований, направленных на изучение молекулярной характеристики и оценки генотипического разнообразия штаммов UPEC, выделенных при разных проявлениях ИМП (особенно при ББУ), ограничено. Генетические детерминанты вирулентности как критерий оценки и прогноза течения инфекционного процесса в настоящее время не используют. Таким образом, актуальным направлением молекулярно-генетических исследований является изучение патогенного потенциала изолятов UPEC, выделенных при ББУ у беременных женщин, для определения их клинической значимости, а также определение молекулярных основ патогенеза, разработка новых диагностических алгоритмов и эффективных методов лечения.

Целью исследования являлась молекулярно-генетическая характеристика UPEC, выделенных при ББУ у беременных.

Материалы и методы

Клинические изоляты E. coli (n = 70) выделены из мочи беременных женщин с ББУ, которые наблюдались акушером-гинекологом в НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта в 2018–2023 гг.

Исследование проводили при добровольном информированном согласии пациенток, протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта (протокол № 114 от 14.12.2021).

Диагноз ББУ был установлен при выделении одного и того же микроорганизма в количестве ≥ 10⁵ КОЕ/мл в 2 последовательных пробах мочи, взятых с интервалом не менее 24 ч, при отсутствии клинических проявлений ИМП. При выделении более 1 микроорганизма проба исключалась из исследования. Бактериологическое исследование клинического материала проводили с использованием хромогенной питательной среды для выделения возбудителей ИМП (Brilliance UTI Clarity Agar, «Oxoid»). Результаты идентификации подтверждали методом масс-спектрометрии («MALDI-TOF MS», «Bruker Daltonics»). Хранение культур осуществляли в триптиказо-соевом бульоне с добавлением 30% глицерина при –70ºС.

Экстракцию ДНК проводили с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб АМ» (ЦНИИ Эпидемиологии).

Принадлежность штаммов E. coli к филогенетическим группам определяли с помощью quadriplex-полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно O. Clermont и соавт. [9].

Все изоляты были протестированы на 15 маркеров вирулентности: гены, ассоциированные с адгезией (fimH, papC, sfa, afa, focG); инвазией (ibeA), синтезом токсинов (cnf1, hlyA, sat, vat, usp), сидерофоров (fyuА, iroN, iuc), капсульного антигена (kpsМII). Использовали ранее исследованные праймеры, синтез ПЦР-праймеров выполнен ООО «Синтол» [14–20]. Для ПЦР-амплификации использовали набор реагентов «Tersus plus PCR kit» («Евроген») и термоциклер «Терцик» («ДНК-Технология»). Разделение полученных ампликонов проводили в 2% агарозном геле. Визуализацию и документирование данных осуществляли с использованием гель-документирующей системы «Infinity» («Vilber Lourmat»).

Для оценки статистической значимости различий средних величин применяли точный критерий Фишера. Статистически значимыми считали различия при доверительном интервале (ДИ) 95% (р < 0,05).

Результаты

Филогенетический анализ E. coli, выделенных при ББУ у беременных, показал, что достоверно чаще (р < 0,05) преобладали клинические изоляты, принадлежащие к филогруппе B2 (51,4%); остальные изоляты относились к филогруппам D, А, В1 и F (табл. 1).

 

Таблица 1. Принадлежность к филогенетическим группам изолятов E. coli, выделенных при ББУ у беременных

Table 1. Belonging to phylogenetic groups of E. coli isolated from pregnant women with asymptomatic bacteriuria

Показатель | Indicator	Филогенетическая группа | Phylogroup
	А	В1	В2	D	F
Абсолютное количество | Number of isolates	8	6	36	14	6
%	11,4	8,6	51,4	20,0	8,6
95% ДИ | 95% CI	5,1–21,3	3,2–17,7	39,2–63,6	11,4–31,3	3,2–17,7

 

Анализ факторов вирулентности, связанных с адгезией, показал, что ген fimН был выявлен у 97,1% изученных штаммов; papС — у 34,3%; sfa — у 27,1%; focG — у 11,4%; afa — у 2,9%. Ответственный за инвазию эндотелиальных клеток ген ibeA не был обнаружен среди UPEC, выделенных при ББУ у беременных. Наиболее распространённым геном, кодирующим синтез токсинов, был vat (42,9%); гены hlyA, cnf1 и sat выявлены у 21,4, 22,9 и 32,9% изолятов соответственно. Уропатоген-специфичный белок usp был обнаружен у 57,1% изолятов. Среди генов, связанных с продукцией сидерофоров, ген fyuA был выявлен у 78,6% изолятов, iroN — у 48,6%, iuc — у 37,1%. Ген, кодирующий синтез капсульного антигена (kpsMII), обнаружен у 65,7% изученных штаммов E. coli.

В клинических изолятах UPEC присутствовали от 1 до 12 генов вирулентности. Ни один из 70 штаммов E. coli не содержал все 15 маркеров вирулентности, включённых в исследование. Филогенетическая группа А достоверно чаще была представлена изолятами с 1 (75%) геном вирулентности; остальные штаммы без статистически значимых различий характеризовались сочетанием 2 (12,5%) и 5 (12,5%) генов. Изоляты, принадлежащие к филогенетической группе В1, без статистически значимых различий имели в своём геноме сочетание 2 (33,3%) и 4 (50%) маркеров вирулентности; в геноме 1 (16,7%) штамма выявлен 1 ген вирулентности. Филогенетическая группа В2 характеризовалась наибольшим количеством генов в различных комбинациях (от 5 до 12); достоверно чаще встречались изоляты, содержащие в своём геноме комбинации из 7 (11,1%), 8 (25%), 9 (13,9%), 10 (25%) и 12 (2,8%) генов. Филогенетические группы D и F были представлены изолятами, в которых гены, кодирующие факторы вирулентности, присутствовали без значимых различий в сочетании от 2 до 8 и от 3 до 8 соответственно.

В зависимости от наличия факторов патогенности UPEC все изоляты были разделены на 6 кластеров (табл. 2).

 

Таблица 2. Частота обнаружения факторов патогенности в изолятах UPEC, выделенных при ББУ у беременных

Table 2. Frequency of detection of pathogenicity factors in uropathogenic E. coli isolated from pregnant women with asymptomatic bacteriuria

Фактор патогенности | Pathogenicity factor	n	%	95% ДИ | 95% CI
Адгезия | Adhesion	7	10	4,1–19,5
Адгезия + сидерофоры | Adhesion + siderophores	11	15,7	8,1–26,4
Адгезия + токсины | Adhesion + toxins	1	1,4	0,04–7,7
Сидерофоры + капсула | Siderophores + capsules	1	1,4	0,04–7,7
Адгезия + сидерофоры + капсулы | Adhesion + siderophores + capsules	2	2,9	0,03–12,6
Адгезия + сидерофоры + токсины | Adhesion + siderophores + toxins	4	5,7	1,8–14,2
Адгезия + сидерофоры + токсины + капсула | Adhesion + siderophores + toxins + capsules	44	62,9	50,5–74,1

 

В геномах 7 изолятов были выявлены генетические детерминанты, кодирующие 1 фактор патогенности (7%; 95% ДИ 4,1–19,5). Частота встречаемости изолятов, содержащих комбинации 4 факторов (62,9%; 95% ДИ 50,0–74,1), статистически достоверно (p < 0,0001) отличалась от изолятов, характеризующихся присутствием сочетаний генов, кодирующих 2 и 3 фактора патогенности.

Наибольшее количество генов вирулентности было обнаружено у штаммов, принадлежащих филогруппе В2; в филогруппе D не детектировались гены focG, afa, cnf1 и ibeA; в филогруппе F обнаружено 8 генов вирулентности, за исключением afa, sfa, focG, cnf1, hlyA, vat и ibeA (табл. 3). В филогруппах А и В1 было выявлено наименьшее разнообразие генов. Статистически значимо чаще (p < 0,05) гены вирулентности, ассоциированные с адгезией (sfa, focG), кодирующие синтез токсинов (hlyA, cnf1, vat, usp), сидерофоров (fyuA, iroN, hlyA) и капсул (kps), присутствовали в изолятах филогенетической группы В2, по сравнению с изолятами других филогенетических групп. Статистически достоверные различия выявлены в частоте встречаемости гена kps (p < 0,01) у изолятов UPEC, принадлежащих к филогенетической группе А; генов vat (p < 0,05) и usp (р < 0,001), принадлежащих к филогенетической группе D.

 

Таблица 3. Встречаемость генов вирулентности в разных филогенетических группах клинических изолятов E. coli, выделенных при ББУ у беременных

Table 3. Occurrence of virulence genes in E. coli of various phylogenetic groups isolated from pregnant women with asymptomatic bacteriuria

Фактор вирулентности Virulence factors	Ген Gen	Частота встречаемости генов, n (%) | Frequency of gene occurrence, n (%)
		A (n = 8)	B1 (n = 6)	B2 (n = 36)	D (n = 14)	F (n = 6)
Адгезины | Adhesins	papC	0	0	15 (41,7%)	5 (35,7%)	4 (66,7%)
	afa	0	0	2 (5,6%)	0	0
	fimH	8 (100,0%)	6 (10,0%)	36 (100,0%)	13 (92,8%)	6 (100,0%)
	sfa	0	0	18+*** (50,0%)	1 (7,1%)	0
	focG	0	0	8+** (22,2%)	0	0
Инвазины | Invasins	ibeA	0	0	0	0	0
Сидерофоры | Siderophore	fyuA	2 (25,%)	4 (66,7%)	33+** (91,7%)	12 (85,7%)	4 (66,7%)
	iroN	0	4 (66,7%)	25+*** (69,4%)	3 (21,4%)	2 (33,3%)
	iuc	1 (12,5%)	3 (50,0%)	14 (38,9%)	4 (28,5%)	4 (66,7%)
Токсины | Toxins	hlyA	0	0	14+*** (38,9%)	1 (7,1%)	0
	cnf1	0	0	16+*** (44,4%)	0	0
	sat	1 (12,5%)	0	14 (38,9%)	7 (50,0%)	2 (33,3%)
	vat	0	0	30+*** (83,3%)	2–* (14,3%)	0
	usp	0	0	36+*** (100,0%)	1–*** (7,1%)	3 (50,0%)
Капсула | Capsules	kpsMII	1–** (12,5%)	0	32+*** (88,9%)	9 (64,3%)	4 (66,7%)

Примечание. ^– — частота встречаемости гена в группе или подгруппе меньше частоты встречаемости этого же гена в общей выборке; ⁺ — частота встречаемости гена в группе или подгруппе выше частоты встречаемости этого же гена в общей выборке. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

Note. ^– — the frequency of gene occurrence in the group is lower than the frequency of occurrence of the same gene in the overall sample; ⁺ — the frequency of gene occurrence in the group is higher than the frequency of occurrence of the same gene in the overall sample. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

 

Обсуждение

Исследования молекулярно-генетической характеристики уропатогенных E. coli, результаты которых в настоящее время доступны для анализа, основывались на оценке патогенного потенциала штаммов, выделенных при ИМП. Учитывая значимое влияние бессимптомной бактериурии на развитие осложнений беременности, мы провели исследование, направленное на изучение штаммов E. coli, выделенных у пациенток с данной патологией.

Клинические изоляты E. coli, выделенные при ББУ у беременных, принадлежали к 5 филогенетическим группам (A, B1, B2, D и F). Было показано, что доминирующими филогруппами были B2 и D (в меньшей степени) — 51,4 и 20% соответственно, что согласуется с результаты других исследований [10]. Согласно расширенной классификации O. Clermont (2013), филогруппа F является подгруппой филогруппы B2, а E. coli, принадлежащие к этой группе, также считаются уропатогенными. В нашем исследовании 8,6% изолятов, выделенных при ББУ, были отнесены к этой филогруппе. Также были обнаружены E. coli, принадлежащие к филогенетическим группам А (11,4%) и В1 (8,6%), которые ассоциируются с комменсальными изолятами; это позволяет предположить, что основным резервуаром E. coli, которые способны колонизировать мочевые пути, является кишечник.

Факторы адгезии играют ключевую роль в патогенезе ИМП, облегчая прикрепление E. coli к уроэпителию. В целом факторы адгезии в нашем исследовании были обнаружены изолированно или в различных сочетаниях у 69 (98,6%) изолятов, что подтверждает роль адгезинов как одного из основных факторов уровирулентности. Согласно многочисленным исследованиям, ген fimH является наиболее распространённым геном адгезии, кодирующим фимбрии 1-го типа, что было подтверждено и результатами нашего исследования — ген fimH был обнаружен у большинства изолятов (97,1%). Важное значение в патогенезе ИМП, особенно у беременных, играют факторы вирулентности, ассоциированные с развитием восходящей инфекции (пиелонефрита). Ген papС (пиелонефрит-ассоциированные пили) и афимбриальные afa-адгезины (ассоциирован с развитием гестационного пиелонефрита) в нашем исследовании были обнаружены у 34,3 и 2,9% изолятов соответственно. Распространённость генов, кодирующих фимбриальные адгезины sfa и focG, которые экспрессируются штаммами, вызывающими менингит, сепсис и пиелонефрит, составила 34,7 и 12,9% соответственно. Результаты аналогичных исследований по изучению генетических детерминант вирулентности UPEC, выделенной при ББУ, свидетельствуют о более низкой распространённости генов papС (от 12,9 до 20,6%), sfa (от 8,1 до 16,9%), но о большей частоте выявления генов afa (34,9%) и focG (35,1%) [19, 21, 22].

МВП могут быть источником NMEC, который является одной из наиболее распространённых инфекций с высокой заболеваемостью и смертностью в неонатальном периоде [23]. Ген ibeA, являющийся одним из важных факторов вирулентности NMEC и ответственный за инвазию эндотелиальных клеток, не был обнаружен среди изолятов E. coli, выделенных при ББУ у беременных.

Для UPEC характерно наличие уропатоген-специфичного белка — бактериоциноподобного токсина, ассоциированного с развитием пиелонефрита и бактериемии. Появление этого маркера вирулентности часто связано с увеличением вирулентности штамма и его выживаемости в МВП. Результаты нашего исследования показали более высокую частоту обнаружения гена usp (57,1%) по сравнению с результатами аналогичных исследований, где частота детекции гена usp у UPEC, выделенных при ББУ, составила 22,6–34,4% [19, 21].

Токсинообразование характерно для штаммов E. coli, ответственных за более тяжёлые формы заболевания (пиелонефрит, уросепсис). Гены hlyA и cnf1, ассоциированные с синтезом токсинов, были обнаружены у 68,2 и 63,6% изолятов, выделенных при пиелонефрите; у 19,4 и 25,8% — выделенных при ББУ [21]. Результаты нашего исследования продемонстрировали аналогичную картину — гены hlyA и cnf1 были выявлены у 21,4 и 22,9% изолятов, выделенных при ББУ у беременных. Секретируемый аутотранспортный токсин (sat) также является фактором вирулентности, характерным для UPEC, выделенных при пиелонефрите. В нашем исследовании частота обнаружения гена sat составила 32,9%, что значительно выше, чем в работе L. Maniam и соавт. (7,5%) [19]. Ген vat встречается более чем у половины изолятов E. coli, выделенных при цистите и пиелонефрите [24]. В нашем исследовании ген vat был обнаружен у 42,9% изолятов E. coli, выделенных при ББУ.

Продукция сидерофоров, играющих важную роль в захвате железа, повышает жизнеспособность микроорганизмов внутри уретрального тракта. Присутствие этих факторов вирулентности у UPEC, по-видимому, компенсирует отсутствие других генов вирулентности, связанных с адгезией и токсинообразованием, и таким образом способствует длительной колонизации в МВП, не вызывая воспалительного ответа у хозяина. В проведённом исследовании в геноме были выявлены гены, ответственные за синтез иерсинебактина (fyuA) — 78,6% изолятов, сальмохелина (iroN) — 48,6% и аэробактина (iuc) — 37,1%.

Капсула выполняет защитную роль от иммунной системы хозяина, что способствует длительной персистенции в МВП. Ген kpsMII был выявлен нами в 65,7% изолятов, выделенных при ББУ. В аналогичных исследованиях было показано, что частота данного гена варьировала от 38 до 73% [19, 22].

Присутствие в геноме отдельных генов вирулентности не является достаточным для реализации уропатогенного потенциала. Многие исследования свидетельствуют о том, что в бактериях присутствуют сразу несколько факторов вирулентности [21, 25]. Полученные нами данные также свидетельствуют о генетическом разнообразии UPEC, выделенных при ББУ. Результаты количественного распределения факторов вирулентности в филогенетических группах показали, что у 90% изолятов E. coli были выявлены 2 и более маркера вирулентности. E. coli, относящиеся к филогруппам B2, D, E и F, ассоциированные с UPEC, содержали большее количество генов вирулентности, чем филогруппы А и В1, ассоциированные с комменсальными штаммами. Кроме того, E. coli, принадлежащие филогенетической группе В2, обладали наибольшим количеством генов в различных комбинациях (от 5 до 12); достоверно чаще (p < 0,05) были обнаружены гены, ассоциированные с адгезией (sfa, focG), синтезом сидерофоров (fyuA, iroN, iuc), токсинов (hlyA, cnf1, vat, usp) и капсул (kpsMII).

На экспрессию факторов вирулентности и способность к адаптации изолятов UPEC к персистенции в МВП могут влиять многочисленные факторы (иммунный ответ, способность к образованию биоплёнок). При сравнении вирулентных свойств UPEC, выделенных при ББУ и при симптоматических ИМП (цистит, пиелонефрит) у беременных, показано, что изоляты E. coli, выделенные при ББУ и цистите, демонстрировали сопоставимые показатели вирулентности [22]. Определение большого количества генов вирулентности в изоляте, по мнению исследователей, может свидетельствовать об уропатогенном потенциале возбудителя, а способность к проявлению зависит от экспрессии данного гена или совокупности генов.

Заключение

Изучение молекулярной характеристики и оценки генотипического разнообразия штаммов E. coli необходимо для лучшего понимания их роли в патогенезе ИМП. Определение ключевых детерминант вирулентности и/или комбинации генов вирулентности может быть маркером для прогнозирования течения ИМП, особенно у беременных, и позволит расширить возможности диагностики с учётом вирулентных свойств уропатогена.

 

¹ European Association of Urology. Guidelines on urological infection; 2018. URL: https://uroweb.org/guidelines/urological-infections/chapter/the-guideline

Об авторах

Татьяна Алексеевна Хуснутдинова

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта

Автор, ответственный за переписку.
Email: husnutdinovat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2742-2655

к.м.н., с.н.с. отдела медицинской микробиологии

Россия, Санкт-Петербург

Ольга Викторовна Будиловская

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта

Email: husnutdinovat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7673-6274

к.м.н., с.н.с. отдела медицинской микробиологии

Россия, Санкт-Петербург

Анна Александровна Крысанова

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта

Email: husnutdinovat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4798-1881

к.м.н., с.н.с. отдела медицинской микробиологии

Россия, Санкт-Петербург

Кира Валентиновна Шалепо

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта

Email: husnutdinovat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3002-3874

к.б.н., с.н.с. отдела медицинской микробиологии

Россия, Санкт-Петербург

Анна Александровна Синякова

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта

Email: husnutdinovat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3094-665X

к.м.н., н.с. отдела акушерства и перинатологии

Россия, Санкт-Петербург

Алевтина Михайловна Савичева

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта

Email: husnutdinovat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3870-5930

д.м.н., профессор, зав. отделом медицинской микробиологии

Россия, Санкт-Петербург

Игорь Юрьевич Коган

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта

Email: husnutdinovat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7351-6900

д.м.н., профессор, чл.-корр. РАН, директор

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы