Селективное подавление репликации вируса гриппа A/H5N1 in vitro с помощью нанокомплексов, состоящих из siRNA и наночастиц аминопропилсиланола

Полный текст

Введение

Терапия с использованием нуклеиновых кислот (НК) предлагает уникальные возможности воздействия на генетический материал клетки. Однако её эффективность ограничена нестабильностью НК по отношению к клеточным нуклеазам и их низкой способностью проникать через цитоплазматическую мембрану, что делает необходимым использование различных систем доставки [1].

Малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (small interfering RNA, siRNA) — многообещающий тип терапевтических средств на основе РНК, поскольку механизм их действия является каталитическим и каждая молекула siRNA может инактивировать несколько молекул РНК-мишеней. Молекулы siRNA интенсивно исследуются в качестве противовирусных агентов. L. Singh и соавт. представили широкий спектр применения наноразмерных материалов для лечения распространённых вирусных инфекций [2]. Для клинического успеха предлагаемых методов доставки фрагментов НК в клетки безопасность и эффективность остаются жизненно важными требованиями. Предложены различные подходы к решению проблемы доставки siRNA, например, с помощью вирусов, катионных липидов, полимеров, транспортных пептидов. Следует упомянуть успешное использование биоконъюгатов siRNA и N-ацетилгалактозаминов [3]. Однако все методы имеют ограничения для терапевтического использования. Огромное количество потенциальных препаратов на основе siRNA не прошли клинических испытаний, поскольку многие факторы (низкая эффективность доставки siRNA в клетки-мишени, токсичность, деградация siRNA нуклеазами, фильтрация почками, поглощение иммунными клетками, нецелевые эффекты, низкая эффективность проникновения через гидрофобную клеточную мембрану и высвобождение siRNA из эндосом) ограничивают использование siRNA в биомедицине.

Одним из наиболее перспективных подходов к решению проблемы доставки siRNA в клетки является использование невирусных векторов на основе наночастиц (НЧ) [2, 4, 5]. Для доставки siRNA применялись различные типы НЧ. НЧ, состоящие из катионных полимеров (поли-L-лизин, полиамидоамин, полиэтиленимин, хитозан) или липидов, являются наиболее изученными средствами доставки [6, 7]. Учитывая широкое разнообразие доступных материалов, каждый из которых имеет множество потенциальных модификаций, состав НЧ можно оптимизировать для доставки конкретного типа РНК [8–10]. Системы доставки должны удовлетворять ряду важных требований: они должны повышать способность проникновения РНК в клетки, обеспечивать эффективную защиту РНК от деградации клеточными нуклеазами, а также обладать низкой токсичностью.

Несмотря на определённые успехи в разработке методов доставки фрагментов НК в клетки, проблему доставки нельзя считать окончательно решенной. Поэтому целесообразным является поиск других способов доставки siRNA в клетки.

Ранее мы разработали системы доставки олигодезоксирибонуклеотидов и дезоксирибозимов, основанные на использовании НЧ диоксида титана и аминопропилсиланола (АПС), с целью их воздействия на НК-мишени. Показано, что фрагменты ДНК в составе созданных нанокомпозитов сайт-специфично и эффективно воздействуют на гены-мишени in vitro и in vivo [11–14].

Цель работы — определить возможность использования неагломерированных, растворимых в водных растворах НЧ АПС для доставки siRNA в клетки в виде нанокомплексов Si~NH₂/siRNA, для эффективного и селективного подавления репликации вируса гриппа А/H5N1.

Материалы и методы

В работе использовали реактивы от коммерческих поставщиков: (3-аминопропил)триэтоксисилан, трипсин, пенициллин, стрептомицин («Sigma-Aldrich»); среду DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium; «Биолот»); эмбриональную телячью сыворотку («Gibco»), МТТ ((3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромид), «NeoFroxx»), диметилсульфоксид («Компонент-Реактив»). Трипсин использовали в концентрации 2 мкг/мл, пенициллин и стрептомицин — в концентрации 100 ЕД/мл. Куриные эритроциты, клетки MDCK и штамм вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) были получены из коллекций ГНЦ ВБ «Вектор».

Олигорибонуклеотиды и их производные синтезировали твёрдофазным методом на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе «ASM-800 synthesizer» («Биоссет»), используя оптимизированный протокол для масштаба синтеза 0,4 ммоль. В качестве мономеров использовали 2'-дезокси-, 2'-O-TBDMS- и 2'-O-метил-фосфорамидиты («Glen Research»). Сульфуризующий реагент II («Glen Research») применяли для введения тиофосфатной группы. Концентрацию олигонуклеотидов определяли спектрофотометрическим методом путём измерения их оптической плотности в растворе с использованием спектрофотометра «Shimadzu U-1800» («Shimadzu»).

Получение наночастиц аминопропилсиланола Si~NH₂ и нанокомплексов Si~NH₂/siRNA

НЧ АПС (Si~NH₂) синтезировали путём гидролиза (3-аминопропил)триэтоксисилана, который добавляли по каплям в горячую воду, и смесь перемешивали при этой температуре в течение 15 ч с последующим охлаждением до комнатной температуры [15]. Значение рН полученного раствора (10,6) было доведено до 7,5 с помощью 1 М HCl. Концентрацию конечного раствора Si~NH₂ (0,26 М) определяли титрованием аминогрупп с помощью 1 М HCl. Выход реакции составил 95–97%. НЧ Si~NH₂ ранее изучены физико-химическими методами: динамическое светорассеяние, ультрафиолетовая, инфракрасная спектроскопия, просвечивающая и атомно-силовая микроскопия [15].

Молекулы РНК иммобилизовали на НЧ АПС [16] благодаря электростатическому взаимодействию между отрицательно заряженными межнуклеотидными фосфатными группами в олигорибонуклеотидах (p) и положительно заряженными аминогруппами (NH₂) в НЧ. Нанокомплексы с одно- и двухцепочечной РНК (соответственно Si~NH₂/RNA и Si~NH₂/siRNA) получали при смешивании RNA или siRNA с 0,26 М Si~NH₂ в воде при условии, что соотношение NH₂/p составляло 50 (мы учитывали количество фосфатных групп только в одной цепи). Размер и дзета-потенциал полученных НЧ АПС и нанокомплексов с молекулами РНК измеряли методом динамического светорассеяния на приборе «Zetasizer Nano ZS Plus» («Malvern»).

Анализ токсичности наночастиц и нанокомплексов в культуре клеток MDCK

Образцы в среде DMEM (0,1 мл в концентрациях 5–50 мкМ для siRNA или 5–50 мМ для Si~NH₂) вносили в лунки 96-луночных планшетов с клетками MDCK. В качестве контроля использовали клетки в 0,1 мл поддерживающей среды DMEM. После инкубации клеток в течение 2 дней при 37ºC и 5% CO₂ культуральную среду удаляли и в каждую лунку вносили МТТ-краситель (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромид) в буфере FSB-D (фосфатная соль Дульбекко; 0,075 мл, 1 мг/мл). Клетки инкубировали в течение 90 мин при 37ºC, после чего удаляли раствор красителя и добавляли диметилсульфоксид (0,1 мл). После инкубации в течение 10 мин измеряли оптическую плотность в каждой лунке на спектрофотометре «Emax» («Molecular Devices») при длине волны 540 нм, что является показателем количества жизнеспособных клеток в монослое.

Зависимость оптической плотности от концентрации исследуемого образца была представлена в полулогарифмических координатах, а 50% цитотоксическая концентрация (CC₅₀) каждого образца была рассчитана с помощью компьютерной программы «SoftMaxPro-4.0».

Противовирусная активность нанокомплексов

Вирус A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) выращивали в аллантоисной полости 10-дневных куриных эмбрионов при 37ºC. Аллантоисную жидкость собирали в течение 48 ч после инокуляции вируса и хранили при –80ºC. Клетки MDCK высевали из расчёта 10⁵ клеток/мл в питательной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Gibco»), в 96-луночные планшеты (100 мкл/лунку) и инкубировали при 37ºC, 5% CO₂ и 100% влажности. После достижения ~80% монослоя среду удаляли и в лунки добавляли образцы Si~NH₂, Si~NH₂/RNA и Si~NH₂/siRNA в концентрации 0,5 мМ (в отношении Si~NH₂, что соответствует 0,5 мкМ в отношении РНК или siRNA) в 100 мкл среды DMEM. Контрольным образцом была та же среда без нанокомплексов. В качестве препарата сравнения использовали озельтамивир в концентрации 10 мкг/мл.

Для экспериментов по исследованию дозозависимости противовирусной активности нанокомплексов Si~NH₂/siRNA их концентрация изменялась в диапазоне 0,01–1,00 мкМ (в отношении siRNA).

Клетки инкубировали в присутствии образцов при 37ºC, 5% CO₂ и 100% влажности в течение 4 ч с последующей промывкой клеток той же средой. Затем клетки инфицировали вирусом A/H5N1 в содержащей трипсин (2 мкг/мл) среде DMEM (по 100 мкл в каждую лунку) при множественности заражения 0,01 50% тканевой цитопатической дозы (ТЦД₅₀) на 1 мл. После адсорбции вируса в течение 1 ч при комнатной температуре среду, содержащую вирус, удаляли, клетки промывали средой DMEM без трипсина и добавляли ту же среду, содержащую трипсин, в каждую лунку по 100 мкл. После инкубации в течение 48 ч последовательные 10-кратные разведения (от 10^–1 до 10^–8) культуральной жидкости, содержащей вирус, из каждой лунки наносили на клетки MDCK с повторной инкубацией в течение 48 ч для последующей оценки титра вируса. Наличие цитопатического действия регистрировали под микроскопом и в реакции гемагглютинации с 1% суспензией куриных эритроцитов. Титр вируса выражали в единицах lg ТЦД₅₀/мл. Для оценки зависимости ингибирования вируса от концентрации нанокомплексов рассчитывали процент подавления продукции вируса по формуле: (A – B)/A, где А — титр вируса в контроле (без образца) в ТЦД₅₀/мл; B — титр вируса в эксперименте (с образцом) в ТЦД₅₀/мл.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием программы «Statistica v. 12» («StatSoft Inc.»). Титр вируса в контроле и эксперименте (соответственно без или с экспериментальными образцами) рассчитывали с использованием метода Спирмена–Кербера и выражали в lg ТЦД₅₀/мл. Различия между результатами с экспериментальными и контрольными образцами считали значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение

НЧ диоксида кремния рассматриваются как перспективные носители для доставки НК в клетки [17]. Чаще всего для иммобилизации НК и их фрагментов используются амино-модифицированные Si-НЧ. Мы синтезировали неагломерированные НЧ АПС (гидродинамический диаметр — ~1 нм, дзета-потенциал — ~10 мВ) [15].

Малый размер частиц Si~NH₂ обеспечивает получение водорастворимых препаратов. Характеристика НЧ АПС с помощью физико-химических методов описана в нашей предыдущей работе [15]. Показано, что полученные НЧ не склонны к агломерации и могут храниться в течение нескольких месяцев.

Нанокомплексы Si~NH₂/RNA и Si~NH₂/siRNA получены путём электростатического взаимодействия между отрицательно заряженными межнуклеотидными фосфатными группами в РНК и siRNA и положительно заряженными протонированными аминогруппами в НЧ Si~NH₂. Добавление отрицательно заряженных молекул siRNA к НЧ приводит к изменению дзета-потенциала с ~(+10 мВ) до ~(–30 мВ) и размера частиц с ~1 нм до ~200 нм, что свидетельствует об образовании нанокомплексов.

В качестве мишени для РНК и siRNA мы выбрали сегмент 5 вируса гриппа А, кодирующий нуклеопротеин, который играет ключевую роль во встраивании вирусного генома в клеточное ядро инфицированного организма, способствуя таким образом дальнейшей репликации и сборке вирусных частиц [18]. Для воздействия siRNA была выбрана область вблизи 3'-конца этого сегмента, начинающаяся с нуклеотида 1496, которая является консервативной и уязвимой к действию siRNA [19–21].

Мы синтезировали 2 нативных (RNA₁ и RNA₂) и 8 модифицированных (RNA–RNA₁₀) олигорибонуклеотидов, содержащих ТТ на 3'-конце (табл. 1). Цепи RNA₃ и RNA₄ содержат TT на 3’-конце; RNA₅ и RNA₆ содержат, кроме TT на 3'-конце, 2'-OMe группы в сайте U*A в центре цепей. Присутствие группы 2'-O-Me в этих сайтах повышает устойчивость к сывороточным нуклеазам, тем самым поддерживая интерференционную способность siRNA [22] и обеспечивая долгосрочное подавление экспрессии генов-мишеней [23]. Цепь RNA₇ содержит 2’-O-Me группы во всех положениях и 2 межнуклеотидные тиофосфатные группы на обоих концах. Цепь RNA₈ отличается от RNA₇ наличием 3 последовательных 2’-F групп в положениях 9–11 от 5’-конца. Олигорибонуклеотиды RNA₂, RNA₄, RNA₆ и RNA₈ являются смысловыми цепями, а RNA₁, RNA₃, RNA₅ и RNA₇ — антисмысловыми цепями, т.е. направленными на (–)РНК и (+)РНК вирусного генома соответственно, RNA₉ и RNA₁₀ являются составными цепями для siRNA, направленной на мРНК зелёного флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP) [20].

 

Таблица 1. Олигорибонуклеотиды, используемые в данной работе

Table 1. Oligoribonucleotides used in this study

Цепь РНК | RNA chain		Нуклеотидная последовательность, 5’–3’ Nucleotide sequence, 5'-3'
RNA1	Антисмысловая | Antisense	CUCCGAAGAAAUAAGAUCC
RNA2	Смысловая | Sense	GGAUCUUAUUUCUUCGGAG
RNA3	Антисмысловая | Antisense	CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT
RNA4	Смысловая | Sense	GGAUCUUAUUUCUUCGGAGTT
RNA5	Антисмысловая | Antisense	CUCCGAAGAAAU*AAGAUCCTT
RNA6	Смысловая | Sense	GGAUCUU*AUUUCUUCGGAGTT
RNA7	Антисмысловая | Antisense	C*PSU*PSC*C*G*A*A*G*A*A*A*U*A*A*G*A*U*C*C*PSTPST
RNA8	Смысловая | Sense	G*PSG*PSA*U*U*U#A*U#U#U#C*U*U*C*G*G*A*G*PSTPST

Примечание. *2’-O-метильная группа; ^#2’-фтор группа; PS — межнуклеотидная тиофосфатная группа; символ d для обозначения дезоксириботимидина опущен.

Note. *2'-O-methyl group; ^#2'-fluoro group; PS — internucleotide thiophosphate group; symbol d for deoxyribotimidine has been omitted.

 

Синтезированные РНК были использованы для получения нанокомплексов Si~NH₂/RNA на основе неагломерированных НЧ АПС. Исследована их биологическая активность на примере подавления репликации вируса A/H5N1 в инфицированных клетках MDCK при множественности заражения 0,01 ТЦД₅₀/кл. Полученные результаты свидетельствуют о том, что все одноцепочечные олигорибонуклеотиды (как смысловые, так и антисмысловые цепи) в составе нанокомплексов Si~NH₂/RNA подавляли репликацию вируса гриппа А/H5N1 на 0,7–1,3 порядка — в 5–20 раз (рис. 1, столбцы 1–8).

 

Рис. 1. Титры вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) после инкубирования клеток MDCK с нанокомплексами Si~NH₂/RNA и Si~NH₂/siRNA.

С — контроль вируса без образцов. 1–8 — нанокомплексы Si~NH₂/RNA, содержащие RNA₁–RNA₈ (концентрация РНК в нанокомплексах 0,5 мкМ); 9–12 — нанокомплексы Si~NH₂/siRNA, содержащие siRNA_1/4, siRNA_3/4, siRNA_5/4 и siRNA_7/4 (концентрация siRNA в нанокомплексах 0,5 мкМ в расчёте на одну цепь); 13 — озельтамивир (10 мкг/мл или 32 мкМ); 14 — Si~NH₂ (концентрация частиц 0,5 мМ); 15 — Si~NH₂/siRNA_9/10 (нанокомплекс, содержащий неспецифическую (для вируса гриппа А) siRNA_9/10). Множественность заражения — 0,01 ТЦД₅₀/кл. Представленные средние значения, стандартные отклонения и отличия величин титров вируса рассчитаны по методу Спирмена–Кербера. *р ≤ 0,05 по сравнению с контролем.

Fig. 1. Titers of A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) virus in MDCK cells after their incubation of with Si~NH₂/RNA and Si~NH₂/siRNA nanocomplexes.

C, virus control without samples. Si~NH₂/RNA nanocomplexes containing RNA₁–RNA₈ (1–8), concentration of RNA in nanocomplexes is 0.5 µM; Si~NH₂/siRNA nanocomplexes containing siRNA_1/4, siRNA_3/4, siRNA_5/4 and siRNA_7/4 (9–12), concentration of siRNA in nanocomplexes is 0.5 µM per one strand; ozeltamivir (13), 10 µg/mL or 32 µM; Si~NH₂ (14), 0.5 mM; Si~NH₂/siRNA_9/10, nanocomplex containing unspecific siRNA_9/10 (15). MOI, 0.01 TCID₅₀/cell. The presented average values, standard deviations and differences in the titer values of the virus are calculated using the Spearman–Kerber method. Asterisks designate the difference between the control and the titer values of the virus obtained under the action of the studied series of nanocomplexes, at p < 0.05.

 

Из 4 исследованных смысловых цепей мы выбрали RNA₄, несущую дезоксидинуклеотид ТТ на 3’-конце для защиты от экзонуклеаз, как наиболее активную и сформировали 4 молекулы siRNA со всеми возможными антисмысловыми цепями (RNA_1/4, RNA_3/4, RNA_5/4 и RNA_7/4). Все siRNA являются дуплексами с одинаковой нуклеотидной последовательностью и разной модификацией нуклеозидных звеньев. Эффективность исследованных siRNA оказалась существенно выше по сравнению с одноцепочечными олигорибонуклеотидами (рис. 1). Нанокомплексы Si~NH₂/siRNA, содержащие siRNA_1/4, siRNA_3/4, siRNA_5/4 и siRNA_7/4, подавляли репликацию вируса A/H5N1 на 2,3–2,8 порядка — в 200–630 раз. Нанокомплексы Si~NH₂/siRNA_9/10, содержащие неспецифическую для вируса гриппа А siRNA_9/10, практически не подавляли репликацию вируса гриппа А (рис. 1), что свидетельствует о высокой специфичности воздействия созданных нанокомплексов Si~NH₂/siRNA на вирус гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005.

Главная причина отличия в эффективности siRNA и олигорибонуклеотидов заключается в разном механизме их действия. Известно, что олигодезоксинуклеотиды и siRNA подавляют функции целевых РНК за счёт комплементарных взаимодействий с РНК-мишенью с её последующей деградацией клеточными РНКазами (соответственно РНКазы-H1 и AGO2) [24–26], что в итоге приводит к утрате функций целевых РНК. Одноцепочечные РНК-фрагменты могут формировать комплементарные комплексы с РНК-мишенью, но не вызывают деградации целевой РНК. Молекула siRNA сначала связывается с комплексом (RISC), затем удаляется смысловая (пассажирская) цепь. Нуклеаза AGO2 и оставшаяся антисмысловая цепь в составе комплекса RISC находят целевую РНК-мишень, и AGO2 расщепляет её. AGO2 сохраняет антисмысловую цепь в течение некоторого времени в составе комплекса RISC для дальнейших реакций [27–29].

Известно, что siRNA быстро гидролизуются клеточными нуклеазами, для защиты от которых используют различные модификации. Следует отметить, что даже минимально модифицированные siRNA_1/4 и siRNA_3/4, доставленные в клетки в составе нанокомлексов с НЧ, весьма эффективно подавляли репликацию вируса (на 2,3 порядка, ~ в 200 раз). Это означает, что в составе нанокомплекса Si~NH₂/siRNA НЧ АПС защищают siRNA от клеточных нуклеаз. Самый активный нанокомплекс Si~NH₂/siRNA_5/4 подавлял репликацию вируса почти на 3 порядка.

Противовирусная активность исследованных нанокомплексов Si~NH₂/siRNA была сравнима с активностью озельтамивира (наиболее часто используемого препарата сравнения при исследовании воздействия на вирус гриппа А), но при гораздо меньшей концентрации активного компонента (0,5 мкМ для siRNA и 32 мкМ для озельтамивира). НЧ Si~NH₂, как и следовало ожидать, не приводили к подавлению репликации вируса.

Наиболее активный нанокомплекс Si~NH₂/siRNA_5/4 охарактеризован более подробно. Мы оценили влияние siRNA, НЧ Si~NH₂ в свободном состоянии и в составе нанокомплекса Si~NH₂/siRNA_5/4 на выживаемость незаражённых клеток MDCK (рис. 2). Не связанная с НЧ siRNA_5/4, как и следовало ожидать, оказалась нетоксичной в исследуемом диапазоне концентраций. Цитотоксичность нанокомплекса Si~NH₂/siRNA_5/4 совпадает с токсичностью НЧ Si~NH₂. Следовательно, можно сделать вывод о том, что цитотоксичность нанокомплексов определяется токсичностью входящих в них НЧ. Цитотоксическая концентрация препарата, при которой разрушается 50% клеток в неинфицированном монослое, определённая из данных рис. 2, составила 38 мМ в расчёте на Si~NH₂ и 38 мкМ в расчёте на siRNA.

 

Рис. 2. Жизнеспособность клеток MDCK при обработке образцами siRNA и Si~NH₂ в свободном состоянии и в составе нанокомплекса Si~NH₂/siRNA.

1 — siRNA_5/4; 2 — Si~NH₂; 3 — Si~NH₂/siRNA_5/4. На оси абсцисс приведена концентрация siRNA в свободном состоянии или в составе нанокомплекса (мкМ) и наночастиц Si~NH₂ в свободном состоянии или в составе нанокомплекса (мМ). На оси ординат приведена оптическая плотность раствора MTT.

Fig. 2. Viability of MDCK cells when treated with siRNA and Si~NH₂ samples in the free state and as part of the Si~NH₂/siRNA nanocomplex.

1, siRNA_5/4; 2, Si~NH₂; 3, Si~NH₂/siRNA_5/4. The x-axis shows the concentration of siRNA in the free state or as part of a nanocomplex (µM) and Si~NH₂ nanoparticles in the free state or as part of a nanocomplex (mM). The y-axis shows optical density of the MTT solution.

 

В таблице 2 приведены результаты подавления продукции вируса гриппа в зависимости от концентрации нанокомплекса Si~NH₂/siRNA_5/4 в среде культивирования клеток с вирусом гриппа.

 

Таблица 2. Зависимость противовирусной активности нанокомплекса Si~NH₂/siRNA_5/4 от концентрации siRNA при множественности заражения 0,01 ТЦД₅₀/кл

Table 2. Dependence of antiviral activity of Si~NH₂/siRNA_5/4 nanocomplex on siRNA concentration with MOI 0.01 TCID₅₀/cell

Концентрация siRNA5/4 в нанокомплексе, мкМ Concentration of siRNA5/4 in nanocomplex, µM	Инфекционный титр вируса гриппа lgТЦД50/мл Infection titer of influenza A virus lgTCID50/mL	Подавление продукции вируса гриппа, % Inhibition of influenza A virus replication, %
1,00	4,50	99,99
0,50	5,75	99,82
0,10	7,00	97
0,05	7,50	90
0,01	7,50	90
Контроль вируса | Virus control	8,50	–

 

Показано, что в диапазоне концентраций siRNA_5/4 в нанокомплексе Si~NH₂/siRNA_5/4 от 0,01 до 1,00 мкМ подавление продукции вируса гриппа составляло 90,00–99,99%.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что НЧ АПС могут быть использованы для доставки siRNA в клетки в составе нанокомплексов Si~NH₂/siRNA. Цитотоксичность нанокомплекса Si~NH₂/siRNA_5/4 определяется токсичностью НЧ Si~NH₂. Цитотоксическая концентрация препарата, при которой разрушается 50% клеток в неинфицированном монослое, для нанокомплекса Si~NH₂/siRNA_5/4 составила 38 мМ в расчёте на Si~NH₂ и 38 мкМ в расчёте на siRNA. Нанокомплекс Si~NH₂/siRNA_9/10, содержащий неспецифическую для вируса гриппа А siRNA_9/10, был полностью неактивен. Это свидетельствует о селективности действия нанокомплексов Si~NH₂/siRNA, несущих siRNA_1/4, siRNA_3/4, siRNA_5/4 и siRNA_7/4, специфических к mRNA вируса гриппа. Таким образом, показано успешное использование предложенных нанокомплексов, содержащих siRNA, нацеленных на выбранный участок 5-го сегмента мРНК вирусного генома, для подавления продукции вируса A/H5N1 в клеточной системе. Наиболее эффективный нанокомплекс Si~NH₂/siRNA_5/4 снижал репликацию вируса гриппа А в культуре клеток почти на 3 порядка.

Об авторах

Марина Николаевна Репкова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины

Email: zarytova@niboch.ncs.ru
ORCID iD: 0000-0002-7108-9036

к. х. н., н. с. лаб. нуклеиновых кислот

Россия, Новосибирск

Ася Сауловна Левина

Институт химической биологии и фундаментальной медицины

Email: zarytova@niboch.ncs.ru
ORCID iD: 0000-0003-2423-3805

к. х. н., с. н. с. лаб. нуклеиновых кислот

Россия, Новосибирск

Олег Юрьевич Мазурков

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Email: zarytova@niboch.ncs.ru
ORCID iD: 0000-0001-8164-4091

к. б. н., н. с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций

Россия, Кольцово

Елена Викторовна Макаревич

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Email: zarytova@niboch.ncs.ru
ORCID iD: 0000-0002-5146-8979

н. с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций

Россия, Кольцово

Екатерина Игоревна Филиппова

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Email: zarytova@niboch.ncs.ru
ORCID iD: 0000-0001-9554-4462

к. б. н., н. с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций

Россия, Кольцово

Наталья Алексеевна Мазуркова

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Email: zarytova@niboch.ncs.ru
ORCID iD: 0000-0002-1896-2684

д. б. н., в. н. с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций

Россия, Кольцово

Валентина Филипповна Зарытова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: zarytova@niboch.ncs.ru
ORCID iD: 0000-0002-9579-9972

д. х. н., г. н. с. лаб. нуклеиновых кислот

Россия, Новосибирск

Список литературы

Дополнительные файлы