МОНОЦИТЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА КАК МИШЕНЬ ДЕЙСТВИЯ КОМПОНЕНТОВ STREPTOCOCCUS PYOGENES

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Мононуклеарные фагоциты, являясь эффекторами врожденного иммунитета, участвуют в антибактериальной защите, которая обеспечивается их фагоцитарной и секреторной активностью. Для осуществления своих функций клетки должны мигрировать из кровяного русла в очаг инфекции, минуя эндотелиальный барьер. При стрептококковых инфекциях мононуклеарные фагоциты первыми распознают консервативные структуры бактерий. Это приводит к активации защитных механизмов, в результате чего происходит фагоцитоз и разрушение бактерий. В крови накапливаются продукты, секретируемые живыми бактериальными клетками, а также продукты их деградации. Клетки крови становятся мишенями для этих факторов. Целью исследования было изучение влияния компонентов разрушенных стрептококков на функции моноцитов крови человека, связанные с процессами трансэндотелиальной миграции in vitro. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали мононуклеарные лейкоциты, выделенные из периферической крови (ПК) условно здоровых доноров осаждением в градиенте плотности фиколл-верографина (Биолот, СПб). Клетки культивировали в полной культуральной среде (ПКС) RPMI-1640 (Биолот, СПб) с добавками. Эндотелиальные клетки (ЭК) линии EA.hy 926, предоставленые Dr. Cora-Jean C. Edgell (Университет Северной Каролины, США), культивировали в среде DMEM/F12 (Биолот, СПб) с добавками. Дезинтеграцию монослоя проводили в растворе Версена (Биолот, СПб). Жизнеспособность клеток составляла не менее 90%. Супернатант разрушенных стрептококков (СРС) был приготовлен из Streptococcus pyogenes серологической группы А (тип М22, штамм AL168, предоставленный Dr. Lindahl, Отдел лабораторной медицины Лундского универcитета, Швеция). Концентрацию бактерий доводили до 2,5 - 5,0x108 КОЕ/мл и проводили ультразвуковую дезинтеграцию трижды в течение 30 секунд при частоте 22 kHz и мощности 0,6 - 0,7 мА на дезинтеграторе (MSE, Великобритания). После центрифугирования при 14 000 об/мин СРС стерилизовали с помощью фильтров с размером пор 0,45 микрон. В экспериментах использовали СРС в разведениях 1:50 - 1:2000. Все исследуемые концентрации были нетоксичны для клеток. В работе использовали коммерческие препараты: рекомбинантный TNF-a (1ЕД - 0,06 нг) в концентрации 100 ЕД/мл (Sanitas, Литва) и форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА) в концентрации 50 нг/мл (Sigma, США). Для оценки адгезивной активности моноцитов предварительно проводили посев ЭК в 12-луночный планшет в концентрации 0,3x106 клеток в 2 мл ПКС. В отдельных экспериментах проводили 4 час преинкубацию ЭК с СРС или TNF-a. Мононуклеарные лейкоциты вносили в лунки в концентрации 2x106 клеток в 2 мл ПКС, содержащей TNF-a или СРС, и инкубировали 1 час. Количество адге-зировавших моноцитов оценивали методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител (мАт) против CD14 (Beckman Coulter, США), меченных FITC. Результаты выражали в процентах от числа спонтанно адгезиро-вавших клеток. Для исследования миграции мононуклеарные лейкоциты вносили в верхние камеры трансвеллы для 24-луночного планшета с диаметром пор 8 цм (Becton Dickinson, США) в концентрации 2x106 клеток в 300 цл среды RPMI-1640 с добавлением 2,5% сыворотки. В нижние камеры вносили 600 цл такой же среды с исследуемыми веществами и инкубировали 2 часа. Для исследования ТЭМ в верхние камеры трансвелл вносили ЭК в концентрации 40x103 клеток в 250 цл ПКС, инкубировали до образования конфлюэнтного монослоя, после чего в трансвеллы вносили мононуклеарные лейкоциты и исследуемые вещества, как описано выше, и инкубировали 2,5 часа. Оценку количества мигрировавших клеток проводили методом проточной цитометрии с использованием мАт против CD14, меченных FITC, и коммерческих наборов Flow-count Fluorospheres (Beckman Coulter США). Результаты выражали в процентах от числа спонтанно мигрировавших клеток. Экспрессию поверхностных молекул на клетках после 2 час инкубации с СРС оценивали методом проточной цитометрии с использованием мАт против CD49d, CD29, CD14 (Beckman Coulter, США), меченных FITC, и CD11b, CD14, CD162 (Becton Dickinson, США), меченных РЕ. Оценку уровня фосфорилирования р38 МАРК и NFkB клетками после инкубации с СРС 15 мин проводили методом проточной цитомерии с использованием мАт против фосфо-NFKB или фосфо-р38, меченных AlexaFluor 488 (BD Pharmingen, США), и мАт против CD14, меченных FITC. После окончания инкубации клеточную суспензию фиксировали и пер-меабилизировали с помощью IntraPrep fixation/permeabilisation Kit (Beckman Coulter, США). Результаты выражали средними значениями интенсивности флуоресценции (MFI). Концентрацию цитокинов в супернатантах клеточных культур после 2 час инкубации с СРС определяли с помощью коммерческих наборов (Цитокин, СПб). Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента с помощью пакета программ Microsoft Office Excel 2010 и STATISTICA 6.0. РЕЗУЛЬТАТЫ Начальным этапом процесса трансэндотелиальной миграции лейкоцитов в субэндотелиальное пространство является их адгезия к эндотелию сосудов. В данной работе в качестве стандартного вещества, усиливающего адгезию моноцитов крови к эндотелиальным клеткам, был выбран провоспалительный цитокин TNF-a. Механизмы усиления адгезивной активности лейкоцитов под влиянием этого цитокина в настоящее время хорошо изучены. В наших экспериментах в присутствии TNF-a адгезия моноцитов к эндотелиальным клеткам усиливалась по сравнению с их спонтанной адгезией (контролем) с 100,00±5,61% до 200,45±99,34%, p<0,001. Под влиянием супернатанта разрушенных ультразвуком S. pyogenes наблюдалось статистически значимое повышение интенсивности адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам (216,94±87,11%) по сравнению с контролем (p<0,001). Для оценки вклада эндотелиальных клеток и моноцитов в этот процесс изучали интенсивность адгезии в тех же условиях, но после предварительной 4 час инкубации эндотелиальных клеток с исследуемыми веществами. Адгезия моноцитов к преинкубированному с TNF-a монослою эндотелиальных клеток усиливалась почти в два раза (426,20±194,71%, p<0,01) по сравнению с адгезией клеток в присутствии TNF-a. Результаты экспериментов показали достоверное усиление адгезивной активности моноцитов крови человека к преинкубированным с СРС эндотелиальным клеткам в присутствии компонентов стрептококка (232,18±92,39%, p<0,001) по сравнению с контролем. Статистически значимых отличий между интенсивностью адгезии моноцитов в присутствии СРС к интактному эндотелию и интенсивностью адгезии моноцитов в присутствии СРС к преинкубированному эндотелию выявлено не было. Адгезия лейкоцитов к эндотелиальным клеткам опосредована адгезионными молекулами, которые конститутивно или индуцированно экспрессируются на этих клетках. В наших экспериментах супернатант разрушенных стрептококков не оказывал влияния на уровень экспрессии адгезионных молекул CD49d, CD29 и CD62L на поверхности моноцитов. При этом уровень экспрессии CD11b на поверхности моноцитов достоверно увеличивался по сравнению с уровнем спонтанной экспрессии этой молекулы. Экспрессия CD162 под влиянием СРС на моноцитах достоверно снижалась (табл. 1). В экспериментах по изучению влияния СРС на интенсивность миграции и трансмиграции моноцитов Таблица 1. Изменение уровня экспрессии молекул на поверхности в качестве положительного шлют ПК под м-м Срс Уровень экспрессии молекул, MFI (M±SD) молекула на моноцитах Изотипический контроль В культуральной среде(контроль) В присутствии СРС (1:50) В присутствии TNF-a CD162 5,14±2,33 35,11±4,86 29,19±2,23* 45,65±13,08 n=3 n=7 n=7 n=3 CD11b 5,14±2,33 134,33±5,51 162,67±15,82* 158,00±11,31 n=3 n=3 n=3 n=3 П римечание. * Различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0,05). контроля использовали культуральную среду с 20% содержанием сыворотки. Внесение культуральной среды с повышенным содержанием сыворотки в нижнюю камеру трансвелл приводило к достоверному усилению трансэндотелиальной миграции моноцитов по сравнению с контролем (с 100,00±10,60 % до 2193,28±960,47%, p<0,001). Трансэндотелиальная миграция моноцитов в присутствии СРС в разведении 1:50 в нижней камере трансвелл достоверно снижалась (73,89+33,83%, p<0,01) по сравнению с контролем. Статистически значимых изменений интенсивности трансмиграции моноцитов в присутствии СРС в разведениях 1:100, 1:500 и 1:1000 относительно спонтанной миграции выявлено не было. В среде с 20% сыворотки миграция моноцитов крови человека усиливалась более чем в 2 раза по сравнению с контролем (табл. 2). СРС оказывал разнонаправленное дозозависимое влияние на миграцию моноцитов. Миграция моноцитов достоверно снижалась под влиянием СРС в разведении 1:50 по сравнению со спонтанной миграцией. Однако под влиянием СРС в низких концентрациях (разведения 1:500, 1:1000, 1:2000) наблюдалось статистически значимое усиление миграции этих клеток по сравнению с контролем. В присутствии СРС в низкой концентрации (1:2000) моноциты всех доноров мигрировали сильнее, чем в контроле. При этом по интенсивности миграции моноцитов крови к СРС в разведении 1:50 доноров можно было разделить на две группы (табл. 3). Миграция моноцитов ПК доноров первой группы достоверно снижалась, в то время как миграция моноцитов доноров второй группы под влиянием СРС в той же концентрации достоверно повышалась. Полученные данные свидетельствуют о разнонаправленных эффектах СРС. Результаты, полученные в экспериментах по адгезии, миграции, экспрессии адгезионных молекул свидетельствовали об активации моноцитов под влиянием СРС, в то время как результаты трансэндотелиальной миграции демонстрировали ингибирующее действие СРС на функции этих клеток. Поэтому для уточнения характера влияния СРС на моноциты в дальнейших экспериментах мы изучали секрецию мононуклеарными лейкоцитами провоспалительных цитокинов и экспрессию моноцитами стресс-киназ. Мононуклеарные лейкоциты спонтанно секретировали IL-8 в концентрациях, близких к 200 пг/мл, в то время как уровень спонтанной секреции TNF-a и IL-6 этими клетками был низким (табл. 4). После 2 час инкубации лейкоцитов с супернатантом разрушенных стрептококков наблюдалось достоверное усиление Таблица 2. Миграция моноцитов крови человека под влиянием СРС Доля мигрировавших клеток, % (M±SD) В культуральной среде В присутствии супернатанта разрушенных стрептококков 2,5% FCS (контроль) 20% FCS 1:50 1:500 1:1000 1:2000 100,0±13,8 n=38 276,1±144,6* n=21 73,0±55,4** n=36 123,8±31,8** n=11 144,7±54,9* n=10 153,5±52,7* n=17 Примечание. Здесь и в табл. 3, 4 - различия статистически значимы по сравнению с контролем (* p<0,001, ** p<0,01). секреции TNF-a, IL-6 и Таблица 3. Миграция моноцитов крови доноров разных групп под IL-8 мононуклеарными влиянием Срс Доля мигрировавших клеток, % (M+SD) Группы В культуральной среде В присутствии супернатанта разрушенных стрептококков 2,5% FCS (контроль) 20% FCS 1:50 1:2000 1 100,00+15,80 282,24+224,82* 44,56+19,48* 151,55+61,05* n=29 n=22 n=28 n=9 2 100,00+0,49 581,61+309,49* 157,85+36,57* 155,68+45,57** n=9 n=8 n=9 n=8 лейкоцитами по сравнению со спонтанной секрецией этих цитокинов. В присутствии стандартного индуктора РМА уровень экспрессии фос-фо-NF-KB и фосфо-р38 МАР киназ в моноцитах крови человека достоверно возрастал по сравнению с контролем (табл. 5). После преинкубации моноцитов в присутствии СРС уровень экспрессии фосфо-NF-KB не изменялся. В то же время, под влиянием компонентов стрептококка достоверно увеличивался уровень экспрессии фосфо-р38 МАР-киназы в моноцитах по сравнению со спонтанным уровнем экспрессии. ОБСУЖДЕНИЕ В данной работе в качестве стандартного индуктора адгезии моноцитов ПК к эндотелиальным клеткам использовали провоспалительный цитокин TNF-a. Известно, что под влиянием TNF-a на эндотелиальных клетках усиливается экспрессия адгезионных молекул, опосредующих роллинг лейкоцитов и их прочную адгезию к эндотелию (Р-, Е-селектины, лиганды L-селектина, ICAM-1, VCAM-1) [8, 11, 12]. Также TNF-a стимулирует секрецию эндотелиальными клетками (СХ3СL1, MCP-1, IL-8) хемокинов, привлекающих в очаг воспаления лейкоциты [7, 12]. Хемокины также опосредуют адгезию лейкоцитов к эндотелию, изменяя конформацию интегринов и вызывая усиление их аффинности и авидности. Адгезия моноцитов к преинкубированному с TNF-a монослою эндотелия усиливалась по сравнению с адгезией клеток в присутствии TNF-a. Это свидетельствует о том, что изменение адгезии моноцитов под влиянием TNF-a зависит от свойств монослоя эндотелиальных клеток. Преинкубация эндотелиальных клеток с СРС не оказывала влияния на интенсивность адгезии моноцитов. Ранее нами было показано, что под влиянием СРС не происходило изменение уровня экспрессии адгезионных молекул на эндотелиальных клетках [1]. Это доказывает, что усиление адгезии моноцитов к монослою эндотелия в присутствии СРС не связано с изменением свойств эндотелиальных клеток. Регуляция цитокином TNF-a экспрессии адгезионных молекул на эндотелиальных клетках и продукции клетками хемокинов контролируется активацией транскрипционного фактора NF-kB [15]. В наших экспериментах уровень экс- Концентрация цитокина, пг/мл (M+SD) Цитокины Культуральная среда (контроль) В присутствии СРС (1:50) TNF-a 4,78+12,43 212,18+105,47* n=10 n=10 IL-6 3,08+8,7 164,48+105,41** n=8 n=8 IL-8 171,93+125,82 1047,57+586,65** n=7 n=7 NF-kB р38 МАРК Таблица 4. Влияние СРС на секрецию Таблица 5. Влияние СРС на уровень экспрессии фосфо-цитокинов мононуклеарными киназ моноцитами ПК человека лейкоцитами Уровень экспрессии фосфокиназ, MFI (M+SD) Фосфокиназы В культуральной среде (контроль) В присутствии СРС (1:50) В присутствии РМА (50 нг/мл) 0,79±0,28 n=4 0,91±0,24 n=4 0,83+0,27 n=4 1,40+0,36** n=4 1,41+0,28* n=4 2,38+1,17* n=4 Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем (** p<0,01, * p<0,05). прессии фосфо-NF-KB моноцитами ПК под влиянием СРС не изменялся. Также в более ранних исследованиях не было выявлено достоверных изменений уровня экспрессии фосфо-NF-KB эндотелиальными клетками под влиянием СРС [2]. Все это позволяет предположить, что в основе усиления адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам под влиянием СРС лежат механизмы, отличные от тех, которые обеспечивают усиление адгезии моноцитов к эндотелию под влиянием TNF-a. Р-селектин опосредует роллинг и адгезию моноцитов к активированному эндотелию. Основным лигандом Р-селектина является PSGL-1 (CD162). Также PSGL-1 взаимодействует с E- и L-селектинами [4, 13]. Связывание PSGL-1 с Р-селектином активирует аМ^2- и а4р1-интегрины [10] - основные интегрины, опосредующие адгезию моноцитов к эндотелию [5]. Показано, что при активации моноцитов снижается уровень экспрессии PSGL-1 за счет слущивания его с поверхности клетки [4]. Снижение экспрессии PSGL-1 на поверхности клетки может быть частью механизма переключения Р-селектин опосредованного роллинга к интегрин опосредованной прочной адгезии [4]. И в наших экспериментах снижение CD162 на моноцитах под влиянием СРС может свидетельствовать об активации этих клеток. Из литературных источников известно, что р38 МАРК опосредованно регулирует процессы адгезии и трансмиграции лейкоцитов. Активация р38 МАРК повышает Е-селектин опосредованную адгезию лейкоцитов к клеткам, экспрессирующим Е-селектин и ICAM-1 [5, 13]. В данном исследовании СРС усиливал экспрессию фосфо-р38 на моноцитах. Это доказывает, что под влиянием СРС происходит активация моноцитов и фосфорилирование р38 МАРК может вносить вклад в усиление адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам. В наших экспериментах СРС индуцировал секрецию провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8 мононуклеарными лейкоцитами. Согласно литературным данным IL-8 усиливает адгезию моноцитов, вызывая конформационные изменения в2-интегринов [10, 16]. IL-6 индуцирует секрецию МСР-1 и IL-8 эндотелиальными клетками, тем самым оказывая косвенное влияние на миграцию лейкоцитов [9]. Кроме того, в литературе есть данные о том, что под влиянием IL-6 происходит активация в1-интегринов, усиливается полимеризация актина и адгезия моноцитов к эндотелиальным клеткам [3]. Нельзя исключать, что влияние СРС на функции моноцитов может быть частично связано с аутокринным влиянием секретируемых мононуклеарными лейкоцитами провоспалительных цитокинов. СРС оказывал разнонаправленное действие на миграцию моноцитов крови. В низких концентрациях (1:500, 1:1000 и 1:2000) наблюдалось достоверное усиление миграции моноцитов по сравнению с контролем. Напротив, в высоких концентрациях СРС (1:50) миграция моноцитов была достоверно ниже, чем в контроле. Согласно литературным данным одно и то же вещество, в зависимости от концентрации, может оказывать разнонаправленное действие на миграцию лейкоцитов: в низких концентрациях может выступать в качестве хемоаттрактанта, а при высоких концентрациях действовать как хеморепеллент [6, 14]. Таким образом, можно предположить, что разнонаправленный эффект СРС на миграцию моноцитов в разных концентрациях связан с наличием в его составе подобного фактора. Это согласуется с ранее полученными данными о механизмах усиления миграции моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 под влиянием СРС [2]. Деление доноров на группы по миграции моноцитов в присутствии СРС можно объяснить отличиями чувствительности моноцитов разных доноров к действующему веществу в составе СРС. Принимая во внимание, что под влиянием СРС происходит усиление адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам и усиление их миграционной активности, парадоксальным является выявленное в данной работе подавление трансэндотелиальной миграции моноцитов в присутствии компонентов стрептококка в нижней камере. Это можно объяснить тем, что в используемой модели взаимодействия моноцитов и эндотелиальных клеток в присутствии СРС секретируются факторы, ингибирующие трансмиграцию моноцитов. Под влиянием СРС происходит усиление адгезивной и миграционной активности моноцитов. Изменение уровня экспрессии адгезионных молекул и фосфо-р38 на этих клетках под влиянием СРС и индукция секреции провоспалительных цитокинов говорят в пользу активации моноцитов компонентами стрептококка. Однако при этом СРС оказывает ингибирующее действие на интенсивность трансэндотелиальной миграции моноцитов. Неоднозначное действие СРС на функции моноцитов крови человека может объясняться присутствием в составе супернатанта разрушенных стрептококков компонентов с разной биологической активностью.

Об авторах

А. М Лебедева

НИИ экспериментальной медицины

Санкт-Петербург

Э. А Старикова

НИИ экспериментальной медицины

Санкт-Петербург

Л. А Бурова

НИИ экспериментальной медицины

Санкт-Петербург

И. С Фрейдлин

НИИ экспериментальной медицины

Санкт-Петербург

К. А Самойлова

Институт цитологии

Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы