ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОГЕННЫХ ВАРИАНТОВ BACILLUS ANTHRACIS С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ПЛАЗМИД ВИРУЛЕНТНОСТИ

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Bacillus anthracis является грамположительной, палочковидной, неподвижной, факультативно анаэробной спорообразующей бактерией. Вирулентность для животных и человека, а также устойчивость к неблагоприятным условиям окружающей среды спор обусловили использование B.anthracis в качестве объекта биотерроризма [3, 6]. Предметом протеомных и биоинформационных исследований являются сравнительный анализ секреции белков, поиск иммунодоминантных антигенов, что может иметь значение при определении патогенности, терапевтических и диагностических маркеров, разработке вакцин. Для данных целей были использованы изогенные варианты штаммов, в том числе с различной биохимической активностью, выращенные в определенных условиях [5, 9, 12, 14, 16]. Наша работа посвящена получению и характеристике изогенных вариантов B. anthracis, которые в дальнейшем будут использованы для сравнительного про-теомного анализа. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использованы два вирулентных штамма B. anthracis 81/1, 575/122 (рХО1+, рХО2+) и три вакцинных штамма СТИ, 55, Sterne (рХО1+, рХО2-), полученные из коллекции живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. Элиминацию резидентных плазмид из клеток B. anthracis проводили по методикам [11, 13]. При удалении плазмиды рХО2 вместо новобиоцина использован канамицин в концентрации 2 мкг/мл. Штаммы, выраставшие в R-форме на сре- Для выявления плазмид вирулентности B.anthracis использовали набор реагентов для выявления ДНК «АмплиСенс® Bacillus anthra^s-FR^ (ЦНИИ эпидемиологии, Москва), гены pag A (pXO1), capA (pXO2), а также экспериментальные серии мультиплексной амплификационной тест-системы для идентификации и дифференциации B.anthracis (Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт), которая позволяла обнаруживать гены, кодирующие плазмидные факторы вирулентности - cya (рХО1), capC (рХО2) и хромосомный маркер sap. де для капсулообразования в атмосфере СО2, клонировали с неоднократными пересевами. Изучение продукции токсина, капсулы и антигенов S-слоя in vitro проводили в реакции иммунодиффузии с растущими культурами (РИДРК). В качестве питательной среды, обусловливающей продукцию капсулы и токсина, использовали плотную питательную среду, которую получали смешиванием равных объемов двойной концентрации сердечно-мозгового агара («Difco», USA) и компонентов R-среды [15] с нормальной лошадиной сывороткой (15%). Для определения продукции протективного антигена (ПА) и белков S-слоя использовали соответствующие сыворотки [1]. Определяли биологические свойства, служащие критерием видовой идентификации, такие как морфология клеток в мазках, тест на подвижность, тесты на лецитиназу, фосфатазу, чувствительность к бактериофагу диагностическому сибиреязвенному ГАММА А-26, пенициллину, протеолитическую активность [2, 4, 6]. Вирулентность штаммов оценивали на модели экспериментальной инфекции у мышей, которых заражали подкожно споровыми взвесями в дозах от 5 до 1х106 спор. Учитывали динамику смертности животных в опытных и контрольных группах. Контрольную группу заражали исходными вирулентными штаммами. Продолжительность наблюдения - 10 суток. Рис. 1. Реакция иммунодиффузии в геле с растущими культурами изогенных вариантов штамма B. anthracis 575/122. Сыворотки: 1 - анти Sap; 2 - анти ПА; 3 - анти ЕА1. А - слева B. anthracis 575/122 (рХО1 + , рХО2+); справа B. anthracis 575/122 R02 (рХО1-, рХО2+). Б - слева B. anthracis 575/122 R01 (рХО1+, рХО2-); справа B. anthracis 575/122 R00 (рХО1-, рХО2-). Электрофоретический анализ белков бесклеточных культуральных фильтратов (КФ) токсинпродуцирующих и бесплазмид-ных штаммов проводили в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Белки КФ осаждали ацетоном - к одному объему 0,5 мл охлажденного КФ добавляли два объема охлажденного ацетона, смесь помещали в морозильник на 3 ч, затем центрифугировали при 12000 об/мин 5 мин. Осадок растворяли из расчета 1 мг сырого осадка в 1мкл дистиллированной воды, а затем добавляли равный объем лизирующей смеси. Иммуноблоттинг проводили с кроличьими сыворотками, полученными к фракциям культуральных фильтратов, соответствующих ПА и белкам S-слоя [1]. РЕЗУЛЬТАТЫ Для получения штаммов B. anthracis 81/1 R02 и 575/122 R02, содержащих плазмиду рХО2, вирулентные B.anthracis 81/1 и 575/122 пассировали в L-бульоне при температуре 42,5°С в течение 10 - 15 суток с регулярными контрольными высевами на сывороточный агар. Колонии, выраставшие в R- и RS-форме, клонировали. Штаммы B. anthracis 81/1 R02 росли на сывороточной среде в R-форме, а B. anthracis 575/122 R02 - в RS-форме. В РИДРК образовывали линии иммунопреципитации только с сыворотками к антигенам S-слоя (рис. 1). По всей видимости, отсутствие роста в S-форме обусловлено элиминацией плазмиды рХО1, несущей единый регулирующий ген AtxA [10]. Рис. 3. Иммуноблоттинг белков культуральных фильтратов с сывороткой к КФ B. anthracis СТИ. 1, 2 - культуральные фильтраты B. anthracis 575/122 R01 (рХО1+, рХО2-), B. anthracis 575/122 R00 (рХО1-, рХО2-); 3, 4 - культуральные фильтраты B. anthracis 81/1 R01(рХО1+, рХО2-), B. anthracis 81/1 R00 (рХО1-, рХО2-). Полученные штаммы были вирулентны для мышей при подкожном заражении в дозе 100 спор и более, при вскрытии павших животных наблюдали полнокровие внутренних органов, гиперемию и набухание слизистой оболочки кишечника, увеличение лимфатических узлов. Аналогичную картину наблюдали и другие исследователи при изучении рХО2+-штаммов [2, 4]. В мазках-отпечатках из органов павших животных цепочки типичных палочек окрашивались в синий цвет, капсула имела вид розовой полосы. Штаммы B. anthracis 81/1 R01 и 575/122 R01, которые содержат плазмиду вирулентности рХО1, получали в течение 20 суток при пересеве штаммов B. anthracis 81/1 и 575/122 в среде с канамицином. Штаммы росли на сывороточной среде в R-форме, в РИДРК образовывали линии иммунопреципитатов с сыворотками против протективного антигена и антигенов S-слоя (рис. 1). При заражении мышей 1х104 спор и выше наблюдали гибель животных, на вскрытии отмечали отечность и некроз тканей в области введения. Бесплазмидные штаммы B. anthracis 81/1 R00, 575/122 R00 и СТИ R00, 55 R00, Sterne R00 получа- Рис. 2. Электрофорез белков культуральных фильтратов B. anthracis. 1 - B. anthracis 55 (рХО1+, рХО2-); 2 - B. anthracis 55 R00 (рХО1-, рХО2-); 3 - B. anthracis СТИ (рХО1+, рХО2-); 4 - B. anthracis СТИ R00 (рХО1-, рХО2-); 5 - B. anthracis 575/122 R01 (рХО1+, рХО2-); 6 - B. anthracis 575/122 R00 (рХО1-, рХО2-); 7 - B. anthracis 81/1 R01 (рХО1+, рХО2-); 8 - B. anthracis 81/1 R00 (рХО1-, рХО2-); 9 - B. anthracis Sterne R (рХО1+, рХО2-); 10 - B. anthracis Sterne R00 (рХО1-, рХО2-). ли температурной элиминацией плазмиды рХО1, на сывороточной среде росли в R-форме, в РИДРК образовывали линии иммунопреципитации только с сыворотками к антигенам S-слоя (рис. 1), были не вирулентны для мышей. Гены, кодирующие плазмидные факторы вирулентности - cya и pagA, определены у вирулентных и авирулентных токсинпродуцирующих штаммов. Гены capA, capC, кодирующие белки капсулы - у вирулентных и капсулосодержащих штаммов, хромосомный маркер sap - у всех штаммов. Полученные варианты, в отличие от вирулентных предшественников, изменяли свои биохимические свойства. B. anthracis 81/1 обладал незначительной протеолитичской активностью, из его производных только капсулосодержащий вариант сохранил данное свойство. Штамм B. anthracis 575/122 обладал лецити-назной активностью, его производные утратили данное свойство, а токсинпро-дуцирующий - приобрел протеолитичскую активность. B.anthracis СТИ и 55 не обладали лецитиназной и протеолитической активностью, а в результате элиминации плазмиды приобрели лецитиназную активность. B. anthracis Sterne отличался высокой протеолитической активностью, а бесплазмидный вариант B. anthracis Sterne R00 ее утратил. Все штаммы были чувствительны к фагу, неподвижны, не обладали фосфатаз-ной и пенициллиназной активностью. При электрофоретическом анализе белков установлено, что КФ моноплаз-мидных токсинпродуцирующих штаммов содержали преимущественно белки с молекулярной массой (м.м.) около 90 кДа (рис. 2), которые соответствуют молекулярным массам компонентов сибиреязвенного токсина [8]. Культуральные фильтраты бесплазмидных штаммов содержали белки м.м. 97 и 87 кДа, которые соответствуют молекулярным массам белков S-слоя ЕА1 и Sар, соответственно [12]. Следует отметить, что белки КФ B. anthracis 81/1 R00 от аналогичных белков других штаммов отличались тем, что менее интенсивно окрашивались Кумасси R-250, однако в иммуноблотинге выявлялись сывороткой, полученной к КФ B.anthracis СТИ (рис. 3). ОБСУЖДЕНИЕ B.anthracis секретирует в питательную среду большое количество белков, качественный и количественный состав которых зависит от наличия плазмид вирулентности, условий культивирования [9, 12, 14, 16]. В данной работе получены изогенные варианты штаммов B.anthracis 81/1, 575/122, СТИ, 55 Sterne, отличающиеся по наличию плазмид вирулентности. Они обладали типичными культурально-морфологическими свойствами, отличались по биохимической активности. Антигенный профиль КФ вариантов B.anthracis был связан с наличием плазмид. Как правило, штаммы (рХО1- рХО2+) не образуют капсулу при выращивании на воздухе или на содовом агаре в атмосфере СО2 (0,8% бикарбонатa, 5% CO2). Это можно объяснить тем, что ген atxA плазмиды рХО1 является основным регулятором синтеза капсулы и контролирует экспрессию оперона capBCAD через положительное регулирование генов плазмиды рХО2 acpA и acpB. Однако рост в капсульной форме возможен в условиях, способствующих увеличению экспрессии acpA, в буферных средах при концентрации CО2 20% в атмосфере или в организме хозяина [8]. В нашем исследовании штаммы B. anthracis 81/1 R02 и 575/122 R02 не образовывали колонии в S-форме при определенных условиях выращивания. Капсула визуализировалась в мазках-отпечатках органов зараженных живот -ных. Одноплазмидные штаммы вызывали гибель мышей, B. anthracis 81/1 R01 и 575/122 R01 в дозе 1х104 спор, а 81/1 R02 и 575/122 R02 - более 100 спор. Основными факторами патогенности B. anthracis являются экзотоксин и капсула. Исследования последних лет выявили существенные различия в уровне вирулентности между культурами B. anthracis, содержащими как обе, так и одну плазмиды вирулентности, а также ряд факторов патогенности, генетические детерминанты которых локализованы на плазмидах и хромосоме B. anthracis. Наличие у B. anthracis плазмиды рХО1 обусловливает проявления цитопатического эффекта на клетки макроорганизма. Патогенез инфекции для мышей, вызванной капсулосодержащими штаммами B. anthracis, до конца не ясен. Возможно, он связан с наличием разновидностей плазмиды рХО2 и дополнительных факторов вирулентности, детерминированных плазмидами и хромосомой [2, 4, 10, 12, 14, 16]. Таким образом, полученные штаммы могут быть использованы для изучения изменчивости и протеомного анализа возбудителя сибирской язвы, а также выделения антигенов с целью оценки их иммунодиагностического и патогенетического значения.

Об авторах

И. А Баркова

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Волгоград

А. В Новоженина

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Волгоград

А. М Барков

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Волгоград

С. В Порохня

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Волгоград

Г. А Ткаченко

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Волгоград

А. В Липницкий

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Волгоград

Список литературы

Дополнительные файлы