ПРОДУКЦИЯ НЕКОТОРЫХ ПРО- И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ ПРИ СТИМУЛЯЦИИ ЖИВЫМИ И ИНАКТИВИРОВАННЫМИ ПАТОГЕННЫМИ ЛЕПТОСПИРАМИ НА МОДЕЛИ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Изучение способности клинических изолятов лептоспир вызывать продукцию некоторых про- и противовоспалительных цитокинов на модели цельной крови человека. Материалы и методы. Для эксперимента был взят штамм Leptospira interrogans. Содержание цитокинов определяли методом, основанным на хMAP технологии с использованием стандартной панели, состоящей из 9 аналитов: TNF-a, MСP-1, IL-8, IL-4, IL-6, IL-10, IL-Жа, IL-12^70), IFN-y. Результаты. Подобрана оптимальная концентрация L.interro-gans для стимуляции цельной крови человека - 1х106 лептоспир/мл. Впервые на модели цельной крови человека определено, что на ранних сроках инкубации активнее продуцируются IFN-y, IL-12(p70), IL-4 и IL-1Ra; на более поздних (6-часовая инкубация) - IL-8 и TNF-a. Заключение. Показан дифференциальный характер стимуляции продукции цитокинов на модели цельной крови человека живыми и инактивированными лептоспирами.

Ключевые слова

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Лептоспирозы - группа природноочаговых, нетрансмиссивных зооантропонозов, сходных, но не идентичных, по патогенезу, эпидемическим и клиническим проявлениям [1, 2]. Возбудителями являются бактерии рода Leptospira, входящие в семейство Leptospiraceae порядка Spirochaetales. В настоящее время идентифицировано более 250 серовариантов патогенных лептоспир [2, 13]. В Российской Федерации лептоспирозы продолжают оставаться в ряду широко распространенных зооантропонозов, что обусловлено наличием практически на всех территориях природных и хозяйственных очагов как в сельской местности, так и в городах [1, 2]. В ряде случаев лептоспироз у человека протекает в легкой форме, сопровождаясь неспецифическими симптомами, такими как лихорадка, боль в мышцах и головная боль, однако у 10 - 15% больных развивается тяжелая форма, которая часто быстро прогрессирует и может привести к летальному исходу [12]. Летальность в случае развития тяжелых форм лептоспироза достигает 20%, а в случае развития легочного геморрагического синдрома превышает 50% [11]. Патогенез лептоспирозов сложен и на данный момент мало изучен. Лептоспиры обладают множеством механизмов, позволяющих им уклоняться от иммунной системы хозяина и вызывать инфекцию [3]. На данный момент не так много известно о врожденной иммунной реакции на лептоспиры [12]. Toll-подобные рецепторы (TLR) являются основными датчиками вторжения патогенных микроорганизмов [6]. Интересно, что липополисахарид лептоспир отличается от липополисахарида грамот-рицательных бактерий по нескольким биохимическим, физическим и биологическим свойствам [12]. Установлено, что липополисахарид лептоспир взаимодействует с TLR2, а не с TLR4, в отличие от большинства грамотрицательных бактерий [11]. Важную роль в иммунопатогенезе лептоспирозов отводят цитокинам. Предполагается, что тяжесть и исход лептоспирозной инфекции зависит от вида продуцируемых цитокинов и от их концентрации. Работ по исследованию данной темы немного, и часто их данные противоречивы [13 - 15]. Ранее нами было показано, что в сыворотке крови больных лептоспирозом повышен уровень TNF-a, IL-10, MCP-1, IL-8 [5]. В то же время, для изучения продукции цитокинов при лептоспирозной инфекции, в основном, используются животные модели (крысы, мыши, морские свинки) [Lowanitchapart A., 2009; da Silva J.B., 2012] или отдельно выделенные клетки (PBMC-Peripheral Blood Mononuclear Cells, THP-1) [8, 9], также стимуляция чаще проводится липополисахаридами лептоспир [Diament D. et al., 2002]. Цель работы - изучение способности клинических изолятов лептоспир вызывать продукцию некоторых про- и противовоспалительных цитокинов на модели цельной крови человека. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для эксперимента был взят штамм Leptospira interrogans серогруппы Ictero-haemorrhagiae из коллекции лаборатории зооантропонозных инфекций С.Петербургского НИИЭМ им. Пастера. Возбудитель выделен из крови больного, умершего от лептоспирозной инфекции в 2013 г. Культивирование лептоспир осуществляли на фосфатно-сывороточной среде Терских в соответствии с [4]. Для эксперимента проводили трехкратную отмывку лептоспир от питательной среды культивирования натриево-фосфатным буфером (PBS) с последующей инактивацией части образцов нагреванием до 56°C в течение 30 мин. Подбор концентрации проводили последовательным разведением образцов под контролем микроскопии. Жизнеспособность микроорганизмов определяли с помощью темнопольной микроскопией. Взятие крови здоровых доноров, не имеющих в анамнезе лептоспирозной инфекции, осуществляли стерильно в вакутейнеры с гепарином. Стимуляцию живыми и убитыми лептоспирами проводили в течение 24 часов. Через 1, 2, 3, 4, 6, 12 и 24 часа после начала инкубации отбирали супернатанты. Для определения цитокинов в биоматериале использовали анализатор «MagPix» (Millipore, США), основанный на технологии хМАР компании Luminex (США) с использованием стандартной панели из 9 аналитов: TNF-a, MСP-1, IL-8, IL-4, IL-6, IL-10, IL-1Иа, IL-12^70), IFN-y. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ MS Excel, Prizm 5.0 (GraphPad Software Inc.). РЕЗУЛЬТАТЫ Рис. 1 Содержание IFN-y (1), IL-10 (2), IL-12(p70) (3) в супернатантах после 24-часовой стимуляции различной концентрацией лептоспир (пг/мл). Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс - лептоспир/мл. В предварительном эксперименте была подобрана концентрация лептоспир, оптимальная для проведения стимуляции цельной крови. Пик стимуляции при 24 час инкубации лептоспир с цельной кровью наиболее выражен при концентрации микроорганизмов lxlO6 лепто-спир/мл, как видно из рис. 1, 2. В ходе основного эксперимента нами было установлено, что живые лептоспиры являются более сильными индукторами продукции цитокинов, чем те же лептоспиры, инактивированные нагреванием (для IFN-y р=0,0156; IL-12(p70) p=0,0012; IL-4 р=0,01; IL-8 p=0,026; IL-1Ra p=0,0012). Так, индукция синтеза IFN-y живыми лепто-спирами идет активнее, чем инактивированными лепто-спирами (табл. 1, 2). Пик синтеза данного цитокина приходится на 3 час стимуляции. Аналогичный пик стимуляции, приходящийся на 3 час, выявлен для IL-12(p70) в случае стимуляции инактивированными бактериями. В случае же стимуляции живыми возбудителями лептоспи-роза максимальный уровень IL-12(p70) наблюдается уже ко второму часу инкубации, а затем становится практически неизменным. Рис. 2 Содержание TNF-a (1), IL-6 (2), IL-8 (3), MCP-1 (4) в супернатантах после 24-часовой стимуляции различной концентрацией лептоспир (пг/мл). Сходная динамика наблюдается и для противовоспалительного цитокина IL-1Ra, который дает пики стимуляции для живых и инактивированных нагреванием лептоспир на второй и третий час инкубации, соответственно. После достижения своего максимального значения в обоих случаях уровень данного цитокина выходит на плато. Сходная картина наблюдается и для IL-4. Также непохожую на остальные цитокины динамику дали IL-8 и TNF-a, которые имеют более поздние, чем другие цитокины, пики стимуляции, приходящиеся на 6 ч. Концентрация МСР-1 в ходе всего эксперимента изменялась незначительно. Таблица 1. Концентрация IFN-y, IL-4, IL-10, IL-Ша, IL-12^70) (пг/мл) в супернатанте при стимуляции лептоспирами (убитыми и живыми) Цитокины Время, ч IFN-y IL-10 IL-12(p70) IL-1Ri IL-4 убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми 0 119,99 <3,2 30,61 19,461 <3,2 1 259,11 2672,94 <3,2 <3,2 24,02 154,99 142,42 817,67 <3,2 53,84 2 620,18 2838,86 1,08 23,53 109,00 784,70 684,55 4632,06 63,49 311,94 3 913,27 3319,88 15,49 9,81 209,30 458,07 1636,10 2361,53 163,74 213,24 4 404,54 2404,39 1,08 10,05 43,41 443,34 386,36 2386,37 62,28 262,52 6 303,05 2607,37 <3,2 15,29 39,39 457,68 309,71 2316,66 58,65 285,08 12 267,09 1780,26 <3,2 9,81 33,53 292,39 306,09 1649,60 27,84 144,10 24 282,83 2109,76 2,71 11,87 36,45 386,60 302,47 2029,54 24,36 174,22 Таблица 2.Концентрация IL-8, IL-6, TNF-a, MOP-1 (пг/мл) в супернатанте при стимуляции лептоспирами (убитыми и живыми) Цитотокины Время, ч IL-6 IL-8 MCP-1 TNF-a убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми 0 <3,2 25,031 525,938 8,335 1 64,25 405,22 199,24 1176,33 238,21 397,35 127,26 87,65 2 340,60 1015,36 3417,70 3765,42 599,52 868,69 3273,27 2778,94 3 652,02 755,18 24641,82 21441,26 821,90 696,88 20123,51 5630,11 4 730,99 831,50 23224,82 24234,08 665,51 765,52 26351,48 36252,30 6 705,94 1067,13 36039,54 49623,54 708,98 875,36 26602,24 57044,55 12 844,08 1170,60 19249,61 41469,11 588,55 711,45 19979,13 46245,03 24 1224,11 1582,20 11595,89 16710,47 624,40 854,21 19051,66 12534,37 ОБСУЖДЕН И Е В ходе основного эксперимента нами были получены данные о высоком уровне TNF-a, IL-10, MCP-1, IL-8, сходные данные были получены нами ранее [5], что может свидетельствовать об адекватности используемой модели. Определение концентрации лептоспир, необходимой для стимуляции цельной крови, является важным этапом эксперимента. В литературе используются различные концентрации бактерий - от 104 лептоспир/мл (как минимальная концентрация, вызывающая легкую форму инфекции) [9] до 105 - 106 лептоспир/мл и выше (как концентрации, вызывающие тяжелые формы лептоспирозов) [12]. Для каждого сероварианта возбудителя данная концентрация должна определяться индивидуально. В результате эксперимента мы наблюдали повышение уровня IL-12(p70) и TNF-a в ответ на введение лептоспир в цельную кровь, аналогичный результат был получен Gaudart N. et al. в 2008 г. при стимуляции дендритных клеток человека. Низкий уровень стимуляции IL-10 свидетельствует о низкой противовоспалительной активности цитокинов при лептоспирозе, что также согласуется с полученными нами данными. Считается, что соотношение IL-10/TNF-a может являться прогностическим для определения тяжести течения заболевания [7, 14, 15]. Полученные данные согласуются с нашими результатами по содержанию некоторых цитокинов в сыворотке крови больных лептоспирозом, где было показано высокое содержание IFN-y, IL-10, MCP-1, IL-8 [5]. Нами подобрана оптимальная концентрация Leptospira interrogans для стимуляции цельной крови человека - 1х106 лептоспир/мл. Впервые на модели цельной крови человека определена почасовая индукция лептоспирами 9 цитокинов: на ранних сроках инкубации активнее продуцируются IFN-y, IL-12(p70), IL-4 и IL-1Ra; на более поздних (6-часовая инкубация) - IL-8 и TNF-a.
×

Об авторах

О. А Петрова

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Н. А Стоянова

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Н. К Токаревич

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Н. А Арсентьева

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Н. Е Любимова

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

А. В Семенов

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

А. Тотолян Арег

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Список литературы

  1. Ананьина Ю.В. Лептоспирозы людей и животных: тенденции распространения и проблемы профилактики. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010, 2 (51): 13-16.
  2. Ананьина Ю.В. Лептоспирозы в РФ: современные особенности эпидемического проявления природных и техногенных очагов. Вет. патол. 2004, 4: 54-57.
  3. Ваганова А.Н. Наружная мембрана патогенных представителей рода Leptospira. Инфекция и иммунитет. 2011, 1 (1): 29-42.
  4. Методические указания 3.1.1128-02. Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний лептоспирозами. М., МЗ РФ, 2002.
  5. Петрова О.А, Стоянова Н.А., Токаревич Н.К. Содержание некоторых про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных лептоспирозной инфекцией. Журн. микробиол. 2014, 5: 60-64.
  6. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М., Мир. 2000.
  7. Chirathaworn C., Kongpan S. Immune responses to Leptospira infection: roles as biomarkers for disease severity. Braz. J. Infect. Dis. 2014, 18 (1): 77-81.
  8. Cinco M., Vecile E., Murgia R. Leptospira interrogans and Leptospira peptidoglycans induce the release of TNF-a from human monocytes. FEMS Microbiol. Lett. 1996, 138: 211-214.
  9. Craig S.B., Collet T.A, Wynwood S.J. Neutrophil count in leptospirosis patients infection with different serovars. Trop. Biomed. 2013, 30 (4): 579-583.
  10. De Fost M., Hartskeerl R.A., Groenendijk M.R. et al. Interleukin 12 in part regulates gamma interferon release in human whole blood stimulated with Leptospira interrogans. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003, 10: 332-335.
  11. Fraga T.R., Barbosa A.S., Isaac L. Leptospirosis: Aspect of innate immunity, immunopatho-genesis and immune evasion from the complement system. Sc. J. Immun. 2011, 73: 408-419.
  12. Goris G.A., Wagenaar F.P., Hartskeerl R.A. Potent innate immune response to pathogenic leptospira in human whole blood. PLoS ONE. 6 (3): е18279.
  13. Kyriakidis I., Samara P., Papa A. et al. Serum TNF-alpha, sTNFR1, IL-6, IL-8 and IL-10 levels in Weil’s syndrome. Cytokine. 2011, 54: 117-120.
  14. Tajiki H., Salomao R. Association of plasma levels of tumor necrosis factor alpha with severity of disease and mortality among patients with leptospirosis. Clin. Infect. Dis. 1996, 23: 1177-1178.
  15. Tajiki H., Salomao R. The ratio of plasma levels of IL-10/TNF-alpha and its relationship to disease severity and survival in patients with leptospirosis. Braz. J. Infect. Dis. 1997, 1: 138141.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Петрова О.А., Стоянова Н.А., Токаревич Н.К., Арсентьева Н.А., Любимова Н.Е., Семенов А.В., Арег А.Т., 2015

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах