ПРОДУКЦИЯ НЕКОТОРЫХ ПРО- И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ ПРИ СТИМУЛЯЦИИ ЖИВЫМИ И ИНАКТИВИРОВАННЫМИ ПАТОГЕННЫМИ ЛЕПТОСПИРАМИ НА МОДЕЛИ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Лептоспирозы - группа природноочаговых, нетрансмиссивных зооантропонозов, сходных, но не идентичных, по патогенезу, эпидемическим и клиническим проявлениям [1, 2]. Возбудителями являются бактерии рода Leptospira, входящие в семейство Leptospiraceae порядка Spirochaetales. В настоящее время идентифицировано более 250 серовариантов патогенных лептоспир [2, 13]. В Российской Федерации лептоспирозы продолжают оставаться в ряду широко распространенных зооантропонозов, что обусловлено наличием практически на всех территориях природных и хозяйственных очагов как в сельской местности, так и в городах [1, 2]. В ряде случаев лептоспироз у человека протекает в легкой форме, сопровождаясь неспецифическими симптомами, такими как лихорадка, боль в мышцах и головная боль, однако у 10 - 15% больных развивается тяжелая форма, которая часто быстро прогрессирует и может привести к летальному исходу [12]. Летальность в случае развития тяжелых форм лептоспироза достигает 20%, а в случае развития легочного геморрагического синдрома превышает 50% [11]. Патогенез лептоспирозов сложен и на данный момент мало изучен. Лептоспиры обладают множеством механизмов, позволяющих им уклоняться от иммунной системы хозяина и вызывать инфекцию [3]. На данный момент не так много известно о врожденной иммунной реакции на лептоспиры [12]. Toll-подобные рецепторы (TLR) являются основными датчиками вторжения патогенных микроорганизмов [6]. Интересно, что липополисахарид лептоспир отличается от липополисахарида грамот-рицательных бактерий по нескольким биохимическим, физическим и биологическим свойствам [12]. Установлено, что липополисахарид лептоспир взаимодействует с TLR2, а не с TLR4, в отличие от большинства грамотрицательных бактерий [11]. Важную роль в иммунопатогенезе лептоспирозов отводят цитокинам. Предполагается, что тяжесть и исход лептоспирозной инфекции зависит от вида продуцируемых цитокинов и от их концентрации. Работ по исследованию данной темы немного, и часто их данные противоречивы [13 - 15]. Ранее нами было показано, что в сыворотке крови больных лептоспирозом повышен уровень TNF-a, IL-10, MCP-1, IL-8 [5]. В то же время, для изучения продукции цитокинов при лептоспирозной инфекции, в основном, используются животные модели (крысы, мыши, морские свинки) [Lowanitchapart A., 2009; da Silva J.B., 2012] или отдельно выделенные клетки (PBMC-Peripheral Blood Mononuclear Cells, THP-1) [8, 9], также стимуляция чаще проводится липополисахаридами лептоспир [Diament D. et al., 2002]. Цель работы - изучение способности клинических изолятов лептоспир вызывать продукцию некоторых про- и противовоспалительных цитокинов на модели цельной крови человека. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для эксперимента был взят штамм Leptospira interrogans серогруппы Ictero-haemorrhagiae из коллекции лаборатории зооантропонозных инфекций С.Петербургского НИИЭМ им. Пастера. Возбудитель выделен из крови больного, умершего от лептоспирозной инфекции в 2013 г. Культивирование лептоспир осуществляли на фосфатно-сывороточной среде Терских в соответствии с [4]. Для эксперимента проводили трехкратную отмывку лептоспир от питательной среды культивирования натриево-фосфатным буфером (PBS) с последующей инактивацией части образцов нагреванием до 56°C в течение 30 мин. Подбор концентрации проводили последовательным разведением образцов под контролем микроскопии. Жизнеспособность микроорганизмов определяли с помощью темнопольной микроскопией. Взятие крови здоровых доноров, не имеющих в анамнезе лептоспирозной инфекции, осуществляли стерильно в вакутейнеры с гепарином. Стимуляцию живыми и убитыми лептоспирами проводили в течение 24 часов. Через 1, 2, 3, 4, 6, 12 и 24 часа после начала инкубации отбирали супернатанты. Для определения цитокинов в биоматериале использовали анализатор «MagPix» (Millipore, США), основанный на технологии хМАР компании Luminex (США) с использованием стандартной панели из 9 аналитов: TNF-a, MСP-1, IL-8, IL-4, IL-6, IL-10, IL-1Иа, IL-12^70), IFN-y. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ MS Excel, Prizm 5.0 (GraphPad Software Inc.). РЕЗУЛЬТАТЫ Рис. 1 Содержание IFN-y (1), IL-10 (2), IL-12(p70) (3) в супернатантах после 24-часовой стимуляции различной концентрацией лептоспир (пг/мл). Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс - лептоспир/мл. В предварительном эксперименте была подобрана концентрация лептоспир, оптимальная для проведения стимуляции цельной крови. Пик стимуляции при 24 час инкубации лептоспир с цельной кровью наиболее выражен при концентрации микроорганизмов lxlO6 лепто-спир/мл, как видно из рис. 1, 2. В ходе основного эксперимента нами было установлено, что живые лептоспиры являются более сильными индукторами продукции цитокинов, чем те же лептоспиры, инактивированные нагреванием (для IFN-y р=0,0156; IL-12(p70) p=0,0012; IL-4 р=0,01; IL-8 p=0,026; IL-1Ra p=0,0012). Так, индукция синтеза IFN-y живыми лепто-спирами идет активнее, чем инактивированными лепто-спирами (табл. 1, 2). Пик синтеза данного цитокина приходится на 3 час стимуляции. Аналогичный пик стимуляции, приходящийся на 3 час, выявлен для IL-12(p70) в случае стимуляции инактивированными бактериями. В случае же стимуляции живыми возбудителями лептоспи-роза максимальный уровень IL-12(p70) наблюдается уже ко второму часу инкубации, а затем становится практически неизменным. Рис. 2 Содержание TNF-a (1), IL-6 (2), IL-8 (3), MCP-1 (4) в супернатантах после 24-часовой стимуляции различной концентрацией лептоспир (пг/мл). Сходная динамика наблюдается и для противовоспалительного цитокина IL-1Ra, который дает пики стимуляции для живых и инактивированных нагреванием лептоспир на второй и третий час инкубации, соответственно. После достижения своего максимального значения в обоих случаях уровень данного цитокина выходит на плато. Сходная картина наблюдается и для IL-4. Также непохожую на остальные цитокины динамику дали IL-8 и TNF-a, которые имеют более поздние, чем другие цитокины, пики стимуляции, приходящиеся на 6 ч. Концентрация МСР-1 в ходе всего эксперимента изменялась незначительно. Таблица 1. Концентрация IFN-y, IL-4, IL-10, IL-Ша, IL-12^70) (пг/мл) в супернатанте при стимуляции лептоспирами (убитыми и живыми) Цитокины Время, ч IFN-y IL-10 IL-12(p70) IL-1Ri IL-4 убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми 0 119,99 <3,2 30,61 19,461 <3,2 1 259,11 2672,94 <3,2 <3,2 24,02 154,99 142,42 817,67 <3,2 53,84 2 620,18 2838,86 1,08 23,53 109,00 784,70 684,55 4632,06 63,49 311,94 3 913,27 3319,88 15,49 9,81 209,30 458,07 1636,10 2361,53 163,74 213,24 4 404,54 2404,39 1,08 10,05 43,41 443,34 386,36 2386,37 62,28 262,52 6 303,05 2607,37 <3,2 15,29 39,39 457,68 309,71 2316,66 58,65 285,08 12 267,09 1780,26 <3,2 9,81 33,53 292,39 306,09 1649,60 27,84 144,10 24 282,83 2109,76 2,71 11,87 36,45 386,60 302,47 2029,54 24,36 174,22 Таблица 2.Концентрация IL-8, IL-6, TNF-a, MOP-1 (пг/мл) в супернатанте при стимуляции лептоспирами (убитыми и живыми) Цитотокины Время, ч IL-6 IL-8 MCP-1 TNF-a убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми 0 <3,2 25,031 525,938 8,335 1 64,25 405,22 199,24 1176,33 238,21 397,35 127,26 87,65 2 340,60 1015,36 3417,70 3765,42 599,52 868,69 3273,27 2778,94 3 652,02 755,18 24641,82 21441,26 821,90 696,88 20123,51 5630,11 4 730,99 831,50 23224,82 24234,08 665,51 765,52 26351,48 36252,30 6 705,94 1067,13 36039,54 49623,54 708,98 875,36 26602,24 57044,55 12 844,08 1170,60 19249,61 41469,11 588,55 711,45 19979,13 46245,03 24 1224,11 1582,20 11595,89 16710,47 624,40 854,21 19051,66 12534,37 ОБСУЖДЕН И Е В ходе основного эксперимента нами были получены данные о высоком уровне TNF-a, IL-10, MCP-1, IL-8, сходные данные были получены нами ранее [5], что может свидетельствовать об адекватности используемой модели. Определение концентрации лептоспир, необходимой для стимуляции цельной крови, является важным этапом эксперимента. В литературе используются различные концентрации бактерий - от 104 лептоспир/мл (как минимальная концентрация, вызывающая легкую форму инфекции) [9] до 105 - 106 лептоспир/мл и выше (как концентрации, вызывающие тяжелые формы лептоспирозов) [12]. Для каждого сероварианта возбудителя данная концентрация должна определяться индивидуально. В результате эксперимента мы наблюдали повышение уровня IL-12(p70) и TNF-a в ответ на введение лептоспир в цельную кровь, аналогичный результат был получен Gaudart N. et al. в 2008 г. при стимуляции дендритных клеток человека. Низкий уровень стимуляции IL-10 свидетельствует о низкой противовоспалительной активности цитокинов при лептоспирозе, что также согласуется с полученными нами данными. Считается, что соотношение IL-10/TNF-a может являться прогностическим для определения тяжести течения заболевания [7, 14, 15]. Полученные данные согласуются с нашими результатами по содержанию некоторых цитокинов в сыворотке крови больных лептоспирозом, где было показано высокое содержание IFN-y, IL-10, MCP-1, IL-8 [5]. Нами подобрана оптимальная концентрация Leptospira interrogans для стимуляции цельной крови человека - 1х106 лептоспир/мл. Впервые на модели цельной крови человека определена почасовая индукция лептоспирами 9 цитокинов: на ранних сроках инкубации активнее продуцируются IFN-y, IL-12(p70), IL-4 и IL-1Ra; на более поздних (6-часовая инкубация) - IL-8 и TNF-a.

Об авторах

О. А Петрова

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Н. А Стоянова

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Н. К Токаревич

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Н. А Арсентьева

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Н. Е Любимова

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

А. В Семенов

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

А. Тотолян Арег

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Список литературы

Дополнительные файлы