ЭНТЕРОТОКСИГЕННОСТЬ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ГРУДНОГО МОЛОКА У ЖЕНЩИН, ВСКАРМЛИВАЮЩИХ ДЕТЕЙ С ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИЕЙ

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Стафилококковые инфекции сохраняют свою актуальность для человека в связи с высокими показателями заболеваемости и ростом устойчивости возбудителя к противомикробным препаратам. Существенно возросло число случаев стафилококковой инфекции, вызванной метициллин-резистентными штаммами S. aureus как в госпитальных, так и во внебольничных условиях. Пациенты, инфицированные S. aureus, имеют в 5 раз больший риск развития летального исхода при госпитализации в стационар, чем неинфицированные пациенты [10]. Следует подчеркнуть, что смертность от метициллин-резистентных стафилококков в таких странах, как США, Китай и Япония, превышает смертность от ВИЧ-инфекций [20]. Стафилококки продуцируют более 70 факторов патогенности, играющих важную роль в возникновении различной патологии. Инфекции, вызываемые S. aureus, включают более 100 нозологических форм - от стафилодермий до септических процессов и синдрома токсического шока, сопровождающихся высокой летальностью. S. aureus продуцирует четыре типа гемолизинов (а-гемолизин, Р-гемолизин, 8-гемолизин и у-гемолизин), 23 типа термостабильных иммунологически различающихся стафилококковых энтеротоксинов (SE) от А до U, токсин синдрома токсического шока (LSST-1), лейкоцидин Пантона-Валентайна (PVL), два эксфолиативных токсина (ЭТА и ЭТВ) и др. [15]. Клинические проявления стафилококковой инфекции обусловлены способностью стафилококков продуцировать органотропные SE, являющиеся причиной развития пищевых отравлений и синдрома токсического шока. S. aureus является основным возбудителем гнойных маститов у женщин и частым возбудителем гнойновоспалительных заболеваний и энтероколитов у детей грудного возраста. В эпидемиологии стафилококковой инфекции у грудных детей большое значение отводится носительству S. aureus в различных экологических нишах матери [14]. В различных исследованиях доказана возможность инфицирования ребенка стафилококками через инфицированное грудное молоко [19, 21]. Имеются немногочисленные сообщения о выделении из грудного молока штаммов S. aureus, продуцирующих энтеротоксины и TSST-1 [12, 21]. Цель исследования - определить энтеротоксигенность и способность к синтезу TSST-1 у штаммов S. aureus, выделенных из грудного молока у женщин, вскармливающих детей с инфекционной патологией. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследования проводились в течение 2013 - 2015 гг. на базе отделения патологии новорожденных Республиканской инфекционной клинической больницы г. Казань и ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва). В работе исследованы 35 штаммов S. aureus, выделенных из грудного молока женщин, вскармливающих детей, с различной инфекционной патологией грудных желез и здоровых. Идентификация S. aureus проводилась с использованием стандартных микробиологических и биохимических тестов, в том числе окраски по Граму, продукции каталазы, ДНКазы и ферментации маннита. 24 штамма S. aureus выделены от матерей при стационарных случаях и 11 штаммов - при амбулаторных случаях заболеваний у детей. Средний возраст обследованных матерей составил 24,6±0,6 лет. Возраст детей и, соответственно, сроки лактации у матерей составили: 3 - 28 дней - 23 (65,7%) ребенка, 1 - 3 месяца - 12 (34,3%) детей. У 18 (51,4%) матерей обсеменение грудного молока стафилококком не превышало 250 КОЕ/мл, у 17 (48,6%) матерей обнаружено массивное инфицирование грудного молока стафилококком (500 - 5000 КОЕ/мл). 13 (37,2%) обследованных матерей, несмотря на инфицирование грудного молока S. aureus, были клинически здоровы, т.е. у них имела место асимптоматическая стафилококковая бактериолактия. У 15 матерей (42,9%) имелись симптомы лактостаза, 6 (17,1%) женщин имели трещины сосков и 6 (17,1%) женщин перенесли эндометрит в послеродовом периоде. У 16 (45,7%) детей, получавших стационарное лечение, диагностирована стафилококковая инфекция, в т.ч. омфалит в 7 (20%), коньюнктивит - в 6 (17,1%), пузырчатка - в 4 (11,4%), везикулопустулез - в 11 (31,4%) случаях. У 26 детей (74,3%) S^ureus выделен из фекалий в количестве 4 - 7 lg КОЕ/г. У 14 (40%) детей одновременно обнаруживали 2 - 4 очага стафилококковой инфекции. У 2 госпитализированных детей (5,7%) диагностирована ротавирусная инфекция, у 6 (17,1%) - среднетяжелая форма ОРВИ и у 1 (2,9%) - внебольничная пневмония. В амбулаторных условиях бактериологическое обследование матерей проводилось по поводу легких форм стафилококковых энтероколитов и дисбактериозов кишечника у их детей. Для определения энтеротоксигенности штаммов стафилококков проводили посев культуры на жидкую питательную среду, состоящую из ферментативного гидролизата казеина с добавлением 1% сердечно-мозговой вытяжки фирмы Difco, США [7]. Культивирование проводили в пробирках объемом 50 мл, в которые помещали по 4,5 мл питательной среды. Посев производили суточной культурой в стерильную питательную среду. Последующее культивирование осуществляли на шуттель-аппарате при 210 об/мин в течение 24 часов при 37°C. Микробные клетки удаляли путем центрифугирования при 10 000 об/мин в течение 15 мин. В работе использовали надо-садочную жидкость, которую прогревали 30 мин при 100°C. Определение содержания SE A и B проводили иммуноферментным методом с использованием иммуноферментной тест-системы для определения SEА с чувствительностью 2,0 нг/мл [1], иммуноферментной тест-системы для определения SEВ с чувствительностью 1,0 нг/мл [2], а также иммуноферментной тестсистемы для определения ТSST-1 с чувствительностью 10,0 нг/мл [5]. Таблица 1. Частота выделения токсигенных штаммов S.aureus у матерей с патологией грудных желез и асимптоматической бактериолактией, абс. (%) Тип токсина Асимптом. бактериолак. (n=15) Патол. гр. желез (трещины, лактостаз) (П = 20) F критерий Р SEA 6 (40) 6 (30) 0,61 >0,05 SEB 13 (86,7) 17 (85) 0,3 >0,05 TSST-1 6 (40) 9 (45) 0,3 >0,05 Таблица 2. Частота выделения токсигенных штаммов S.aureus из грудного молока женщин в стационарных и амбулаторных условиях, абс. (%) Тип токсина Амб. случаи бактериолак. (П=11) Стац.случаи бактериолак. (П = 24) F критерий Р SEA 7 (63,6) 5(20,8) 2,5 <0,01 SEB 10(90,9) 20 (83,3) 0,6 >0,05 TSST-1 3(27,3) 12 (50) 1,3 >0,05 Комбина- 8 (72,7) 11 (45,8) 1,5 >0,05 ции токсинов Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения © Д. Марапов, 2013. Для сопоставления двух выборок по частоте встречаемости интересующего эффекта использовался F-критерий. Значение р <0,05 считалось статистически значимым. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Таблица 3.Частота колонизации S. aureus кишечника детей, получавших инфицированное грудное молоко Число проб грудного молока, инф. S.aureus Число детей, инф. S.aureus Число детей, не-инф. S.aureus F критерий Р SEA+ (n=12) 10 2 0,35 >0,05 SEA- (n=23) 18 5 SEB+ (n=27) 23 4 1,19 >0,05 SEB- (n=5) 3 2 TSST-1+ (n=15) 11 4 0,84 >0,05 TSST-1- (n=20) 17 3 Способность к синтезу различных токсинов выявлена у 33 штаммов (94,2%) S. aureus, выделенных из грудного молока, а именно: энтеротоксин А (SEA) синтезировали 12 (34,3%), энтеротоксин В (SEB) - 30 (86,7%), токсин синдрома токсического шока (TSST-1) - 15 (42,8%) штаммов S. aureus. 14 (40%) штаммов стафилококков синтезировали 1 вид токсина, 14 (40%) штаммов - 2 вида токсинов и у 5 (14,3%) штаммов обнаружена способность к синтезу 3 токсинов (SEA+SEB+ TSST-1). У матерей с патологией грудных желез (лактостаз, трещины сосков) и с асимптоматической бактериолактией частота выделения токсигенных штаммов S. aureus достоверно не различалась (табл. 1). У матерей в стационарных условиях из грудного молока чаще, чем в амбулаторных условиях, выделяли стафилококки, продуцирующие TSST-1 (p>0,05). Женщины в амбулаторных условиях достоверно чаще были инфицированы стафилококками, продуцирующими SEA (табл. 2). Не выявлено достоверных различий в частоте колонизации кишечника стафилококком детей при вскармливании их грудным молоком, инфицированным S. aureus, в зависимости от наличия или отсутствия SEA, SEB, TSST-1 (табл. 3). ОБСУЖДЕН И Е S. aureus остается наиболее распространенным и актуальным патогеном человека в разных возрастных группах. Патогенность S. aureus зависит от его способности синтезировать факторы вирулентности, среди которых энтеротоксины и TSST-1 являются наиболее распространенными. Энтеротоксины и TSST-1 являются суперантигенами, поскольку обладают способностью к неспецифической стимуляции Т-лимфоцитов. S. aureus обладает способностью синтезировать несколько токсинов одновременно, 5 энтеротоксинов (SEA, SEB, SEC, SED, SEE) ответственны за 95% случаев пищевых отравлений. Известно, что для возникновения пищевого отравления минимальная доза SE равна 100 нг [9]. SE обладают способностью увеличивать токсичность эндотоксинов в 100 000 раз [15], кроме того, SE типов A, B и C обладают способностью вызывать токсический шок. SE и ТSST-1 являются суперантигенами; концентрации от 1 пкг/мл до 1 мкг/мл [18] обладают мощным действием на иммунную систему организма и способны переводить активацию Т-лимфоцитов из ТЫ в ТЬ2. Токсичность SE определяется взаимодействием с главным комплексом гистосовместимости (MHC) класса II на целевых клетках, в результате чего происходит широкое распространение лейкоцитов и высвобождение цитокинов. При этом также происходит нарушение деятельности иммунной системы, увеличение количества Th2-цитокинов, понижение количества других цитокинов (например, альфа-фактора некроза опухолей) и снижение количества антистафилококковых пептидов в иммунной системе новорожденных, например, бета-дефенсина-3 и кателецидинов [22]. Поражение кишечника у детей при стафилококковых инфекциях в основном связано с энтеротоксигенными штаммами, продуцирующими SEA и SEB, которые считаются основными факторами патогенности стафилококков. Особенно большой процент энтеротоксигенных штаммов у детей наблюдается в возрасте от 1 до 5 лет в связи с недостаточным формированием иммунной системы [7]. В большинстве случаев передача энтеротоксигенных штаммов детям происходит через молоко матери [19]. В настоящее время доказана роль энтеротоксинов в развитии недиарейных заболеваний: синдрома токсического шока, атопического дерматита, синдрома Кавасаки, некоторых аутоиммунных заболеваний [15]. Выясняется патогенетическая роль энтеротоксинов стафилококков в развитии синдрома внезапной смерти у младенцев [17]. Также известно, что синдром токсического шока - потенциально фатальное заболевание, которое проявляется высокой лихорадкой, диффузной эритемой кожи, артериальной гипотензией и развитием полиорганной недостаточности [15]. Наиболее уязвимы к стафилококковой инфекции новорожденные дети. Стафилококковая инфекция в данной возрастной группе может быть связана с употреблением инфицированной смеси или инфицированного сцеженного грудного молока. В исследованиях Kawada M. et al. [19] доказана возможность инфицирования ребенка S. aureus через грудное молоко не только при мастите, но при асимптомати-ческой бактериолактии. Инфицирование грудного молока стафилококком наиболее часто происходит с кожи или носовых ходов матери. Общеизвестно, что грудное молоко имеет мощный антиинфекционный потенциал и обеспечивает младенца специфическими и неспецифическими факторами защиты. Противоинфекционный эффект грудного молока во многом обусловлен наличием антител, нейтрализующих токсины, продуцируемые условно патогенной флорой. Человеческое молозиво обеспечивает пассивную защиту для поверхности кишечника. Молозиво содержит секреторный иммуноглобулин (SigA), который может предотвратить поглощение аллергена, ограничивая контакт между антигеном и слизистой оболочкой кишечника [13]. В случаях развития у ребенка стафилококковой инфекции оптимальным является грудное вскармливание и прием антагонистически активных форм бифидобактерий и лактобацилл, ингибирующих продукцию SE [8]. Вопрос отмены или продолжения грудного вскармливания при стафилококковой бактериолактии подлежит обсуждению, так как грудное молоко обладает выраженным синбиотическим и пробиотическим эффектом на состав микробной флоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Известно, что кишечник детей, вскармливаемых материнским молоком, чаще бывает колонизирован лактобациллами и бифидобактериями, в отличие от детей, находящихся на искусственном вскармливании [16]. Частота выделения S. aureus из грудного молока составляет по данным разных авторов от 8 до 30%. S. aureus чаще обнаруживают в грудном молоке у женщин в госпитальных условиях (12%), чем у женщин, обследованных в амбулаторных условиях (3,2%) [3, 21]. В работе разных исследователей показано, что грудное молоко может быть инфицировано энтеротоксигенными штаммами S. aureus. Novak F.R. et al. [21] при исследовании сцеженного грудного молока обнаружили штаммы S. aureus, продуцирующие SEВ. В работе Carneiro L.A.M. et al. [12] в грудном молоке обнаружены штаммы S. aureus, несущие генетические детерминанты SEA, SEG и SEH. В нашей работе мы изучали энтеротоксигенность и способность к синтезу TSST-1 у штаммов S. aureus, выделенных из грудного молока у матерей, вскармливающих детей с различной инфекционной патологией. Токсигенность выявлена у 94,2% штаммов S. aureus; энтеротоксин В синтезировали 86,7%, энтеротоксин А - 34,3% и TSST-1 - 42,8% штаммов S. aureus. 40 % штаммов стафилококков синтезировали 1 вид токсина, 40% штаммов - 2 вида токсинов, и у 14,3 % штаммов обнаружена способность к синтезу 3 токсинов (SEA+SEВ+TSST-1). Частота выделения токсигенных штаммов S. aureus у матерей с патологией грудных желез (лактостаз, трещины сосков) и с асимптоматической бактериолактией достоверно не различалась. Женщины, обследованные в амбулаторных условиях, чаще были инфицированы штаммами стафилококков, продуцирующих SEВ. При обследовании женщин в стационарных условиях у них чаще (50,0%) обнаруживали штаммы S. aureus, продуцирующие TSST-1, чем у женщин, обследованных в амбулаторных условиях (27,3%). Более высокая частота обнаружения гена, детерминирующего синтез TSST-1, выявлена у различных клинических изолятов S. aureus, выделенных у пациентов в госпитальных условиях [23]. Нами не выявлено достоверных различий в частоте колонизации кишечника детей S. aureus при вскармливании их грудным молоком, инфицированным S. aureus, в зависимости от наличия или отсутствия SEA, SEВ, ТSST-1. Это свидетельствует о том, что токсигенные штаммы не имеют селективных преимуществ в кишечном микробиоценозе. Исход колонизации стафилококками, в том числе энтеротоксигенными штаммами, с нашей точки зрения, в большей степени зависит от состояния колонизационной резистентности ЖКТ у детей и массивности обсеменения стафилококком грудного молока. В эксперименте показано, что при совместном культивировании стафилококков с молочнокислыми бактериями ингибируется рост S. aureus (уменьшение числа в 1,48 раза), а также продукция ими SEА - в 5,7 раза и SEВ - в 1,6 раза по сравнению с контролем. Наиболее выраженное ингибирующее действие на продукцию SEА оказывали Lactobacillus spр. 29, Б4, Б5, Б6; L. casei; L. acidophilus 317/402; на продукцию SEВ - Lactobacillus spр. 21; L. casei; L. acidophilus 317/402 [8]. Исход инфицирования ребенка зависит от массивности обсеменения стафилококком. Прогностическое значение имеет содержание S. aureus в грудном молоке > 400 КОЕ/ мл (RR=1,8), при меньших значениях риск инфицирования детей не больше, чем у детей, получающих стерильное грудное молоко [4]. Исход инфицирования ребенка токсигенными штаммами S. aureus во многом определяет пассивный антитоксический и антибактериальный иммунитет, приобретаемый ребенком от матери транспланцетарно и через грудное молоко [11]. В работе Harrison L. et al. [17] исследовано влияния носительства S. aureus у матерей (носоглотка, кишечник) на поздних стадиях беременности на уровень антител к стафилококковым энтеротоксинам В и С, а также TSST-1 в пуповинной крови и грудном молоке. Выявлена высокая частота носительства S. aureus (в т.ч. токсигенных штаммов) у женщин во время беременности. Штаммы стафилококков, продуцирующие SEA, SEB и ТSST-1, часто обнаруживаются у беременных женщин с различной стафилококковой патологией [6], и часто передаются ребенку от кормящей матери. У 89% женщин и их детей были обнаружены защитные антитела к токсинам. Младенцы, рожденные от неинфицированных матерей, не имеют антитоксического иммунитета и, по мнению авторов, представляют группу риска по развитию стафилококковых заболеваний, опосредованных SEB, SEC и TSST- 1. Для проведения профилактических мероприятий у детей из группы риска по развитию стафилококковой инфекции необходима вакцинация. Существующие в настоящее время антистафилококковые вакцины недостаточно эффективны, поэтому разработкой эффективных вакцин занимаются ученые нашей страны и за рубежом. Кроме того, актуальной темой научных исследований в настоящее время является создание препаратов, ингибирующих рост энтеротоксигенных штаммов S. aureus, подавляющих продукцию SE, а также элиминирующих SE из кишечника. Таким образом, результаты наших исследований показали, что S. aureus, выделенные из грудного молока женщин, вскармливающих детей с различной инфекционной патологией, часто обладают способностью к синтезу энтеротоксинов A, B, а также TSST-1.

Об авторах

Ф. С Флуер

Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

И. В Николаева

Казанский государственный медицинский университет

Т. Ю Павлова

Казанский государственный медицинский университет

В. М Бондаренко

Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

С. В Фиалкина

Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

С. И Титарев

Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Список литературы

Дополнительные файлы