АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЛИАЗОЛИДИНАММОНИЯ, МОДИФИЦИРОВАННОГО ГИДРАТ-ИОНАМИ ЙОДА

Полный текст

Борьба с возбудителями инфекционных заболеваний остается одной из важнейших задач практической медицины и ветеринарии, решение которой связано с использованием химиотерапевтических препаратов и антибиотиков в качестве этиотропных средств [9, 15]. Однако результатом их использования становится все возрастающее число высокорезистентных штаммов микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний [3, 4, 14]. Кроме того, большинство химиотерапевтических препаратов способны вызывать различные осложнения в организме человека и животных [1, 11]. Для преодоления антибиотикорезистентности синтезируется большое количество новых химических соединений, обладающих антимикробной активностью [6 - 8]. Однако многие из них характеризуются низкой растворимостью и узким спектром антимикробного действия. Поэтому поиск высокоэффективных препаратов, которые отвечают требованиям, предъявляемым к химиотерапевтическим средствам, является актуальным и востребованным. Цель работы - изучение антимикробной активности полимерного соединения - полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами йода, в отношении референс-штаммов и клинических изолятов бактерий, грибов и вирусов. Объектом исследования был полиазолидинаммоний, модифицированный гидратионами йода (ПААГ), представляющий собой неограниченно растворимый в воде полимер с молекулярной массой полимерной линейной цепи порядка 100 - 200 кДа, на концах которой привиты молекулы сахарозы [2]. В качестве экспериментальных моделей использовали референс-штаммы грамо-трицательных и грамположительных бактерий Escherichia coli 113-13, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus 209 P, а также клинические изоляты золотистого стафилококка S. aureus № 2, S. aureus № 6, S. aureus № 21, S. aureus № 23 (MRSA), S. aureus № 92 (MRSA), S. aureus № 430 из музея кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии СГМУ; стандартные штаммы микроскопических грибов Candida albicans 18, Aspergillus fumigatus, Mucor raceniosus и вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС) из коллекции микроорганизмов Саратовского научно-исследовательского ветеринарного института. Антимикробную активность полимерного соединения изучали с использованием метода серийных разведений (МУК 4.2.1890-04.), определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК). Посевы бактерий в мясо-пептонном бульоне с добавлением различных концентраций препарата инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°C, а затем высевали по 0,1 мл бульонной культуры на поверхность мясо-пептонного агара в чашки Петри для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК). Противогрибковую активность полимерного соединения определяли аналогичным образом. Посевы микроскопических грибов в 1% сахарном бульоне культивировали в течение суток при температуре 37°C с последующим высевом на среду Сабуро для определения минимальной фунгицидной концентрации ПААГ. Противовирусную активность ПААГ изучали в отношении авирулентного штамма ВН-96 вируса ТГЭС по методу Мовлеса. В качестве клеточной культуры использовали трофовариант перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи - СПЭВ-б. Полимер вносили в субтоксической дозе, рассчитанной по методу Рида и Менча, в рабочую суспензию клеток после адсорбции вируса с последующим формированием монослоя. Оценку противовирусного действия ПААГ проводили путем изучения морфологических особенностей клеточного монослоя с помощью цифровой камеры-окуляра (ув. x100) для микроскопа SCOPETEK® DCM 35 с выведением изображения на экран компьютера каждые 24 ч. Для подтверждения достоверности полученных результатов все исследования проводили в пяти повторностях. На основе полученных значений МПК ПААГ рассчитывали значение МПК5о для удобства сравнения эффективности действия. Исследования антибактериальных свойств ПААГ показали его высокую активность как в отношении референс-штаммов, так и в отношении клинических изолятов грамположительных и грамотрицательных бактерий по показателям МПК и МБК. Наибольшую чувствительность к полимерному соединению проявили референс-штаммы S. aureus 209 P (МПК 0,25 и МбК 16 мкг/мл) и B. cereus 8035 (МПК 0,5 и МБК 32 мкг/мл). Значения МПК ПААГ для E. coli 113-13 также были низкими (1 мкг/мл), однако показатели МБК (250 мкг/мл) были на порядок выше по сравнению с результатом действия на грамположительные бактерии. Наименьшей чувствительностью к ПААГ характеризовался референс-штамм P. aeruginosa АТСС 27853 (МПК 64 мкг/мл), однако при воздействии соединения в концентрации 32 мкг/мл эти бактерии утрачивали способность к пигментообразованию. Показатели МБК полимера определить не удалось, так как даже самые высокие концентрации рабочих разведений препарата 1000 и 500 мкг/мл вызывали лишь частичное подавление роста, о чем свидетельствовал рост единичных колоний на МПА. Высокие показатели МПК ПААГ для грамотрицательных бактерий, вероятно, можно объяснить особенностями строения их клеточной стенки, в частности, наличием пориновых каналов, представляющих собой трансмембранные белки [10]. Через них в клетку грамотрицательных бактерий поступают соединения только с определенной молекулярной массой и пространственной структурой [12]. При исследовании биологической активности полимерного соединения в отношении клинических изолятов было показано, что значения МПК для S. aureus № 2, № 6 и № 430 были ниже 2 мкг/мл, как и в случае референс-штамма S. aureus 209 Р. Для других штаммов значения МПК составили от 8 до 32 мкг/мл. Для всех исследованных штаммов золотистого стафилококка были определены МБК ПААГ, для двух из которых (№ 6 и № 430) эти значения совпали с показателями для референс-штамма (16 мкг/мл). Наибольшими значениями МБК характеризовались клинические изоляты S. aureus № 23 и № 92 (64 мкг/мл), что, возможно, связано с их устойчивостью к метициллину. Поскольку в последнее время большую эпидемиологическую значимость приобретают микроскопические грибы, представляло интерес исследовать биологическую активность ПААГ в отношении референс-штаммов C. albicans 18, A. fumigatus и M. raceniosus. Согласно полученным результатам микроскопические грибы проявили меньшую чувствительность к исследуемому полимерному соединению по сравнению с бактериями, так как значения МПК были высокими (125, 250 и 250 мкг/мл соответственно). Нам не удалось определить минимальной фунгицидной концентрации ПААГ, так как даже максимально высокие концентрации, используемые в эксперименте, не вызывали абсолютной гибели микроскопических грибов: рост на среде Сабуро наблюдали в виде единичных изолированных колоний. Еще одним важным этиологическим агентом инфекционных заболеваний являются вирусы, борьба с которыми затруднена из-за особенностей их строения и жизнедеятельности. Поэтому представляло интерес параллельно исследовать противовирусную активность ПААГ. Для этого предварительно была определена его субтоксическая концентрация, которая не оказывала цитопатического действия на культуру клеток СПЭВ-б и составила 1 мкг/мл. Оценку морфологических свойств монослоя проводили в сравнительном аспекте по динамике репродукции вируса в монослое исходной культуры клеток СПЭВ-б и обработанном ПААГ. Клетки СПЭВ-б имели по тесту витального окрашивания трипановым синим жизнеспособность на уровне 82 - 86%. На вторые сутки культивирования отмечался островковый рост эпителиоподобных клеток полигональной формы. Клетки имели четко выраженные границы с хорошо окрашенной цитоплазмой, в которой располагались крупные сферической формы вакуоли. Ядра клеток были крупные, овальные, содержали 2 - 3, реже 5 ядрышек правильной округлой формы. Монослой клеток в контроле полностью формировался на третьи сутки культивирования в стационарных условиях. В монослое культуры клеток СПЭВ-б, зараженном вирусом ТГЭС, отмечались морфологические изменения. На третьи сутки культивирования цитопатическое действие вируса регистрировали по деструктивным изменениям отдельных клеток, возникновению округлых клеточных структур с зернистой цитоплазмой, часть которых дегенерировала с образованием «окон». В основном рисунок и границы клеток были слабо выражены, увеличивалось межклеточное пространство, клетки теряли митотическую активность. На пятые сутки культивирования происходили дальнейшие изменения в структуре клеточного монослоя: в поле зрения появлялись округлые апоптозные тельца, происходило отслоение клеточного монослоя от субстрата и на этом этапе исследования поражение клеток вирусом составляло 80 - 90%. Оценку противовирусной активности сублетальных концентраций полимерного соединения ПААГ проводили аналогично по основным морфологическим характеристикам клеток. Было установлено, что клетки СПЭВ-б, обработанные ПААГ, обладали выраженными ростовыми свойствами; аналогично контрольной культуре клеток формирование монослоя начиналось уже на вторые сутки стационарного культивирования без признаков дегенерации клеток в культуре. Это свидетельствовало о чувствительности вируса ТГЭС к исследуемому препарату и отсутствии процесса репродукции в обработанном клеточном монослое. Таким образом, в ходе проведенных исследований нами установлено, что полимерное соединение ПААГ обладает выраженным антимикробным действием в отношении референс-штаммов как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, а также вируса ТГЭС. Меньшую активность полимерное соединение проявило в отношении микроскопических грибов. Проведенные ранее токсикологические исследования позволили отнести данное соединение к IV группе токсичности, а также показали отсутствие у него раздражающего эффекта [5]. Поэтому ПААГ можно рассматривать как перспективное антисептическое и антимикробное средство широкого спектра действия для борьбы с возбудителями внебольничных и госпитальных инфекционных заболеваний.

Об авторах

О. В Нечаева

Саратовский государственный медицинский университет

Саратов

Е. И Тихомирова

Саратовский государственный технический университет

Саратов

Д. А Заярский

Саратовский государственный технический университет

Саратов

М. М Вакараева

Саратовский государственный технический университет

Саратов

Список литературы

Дополнительные файлы