БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ В ИЗУЧЕНИИ ТОКСИЧНОСТИ ЭНТЕРОТОКСИНОВ СТАФИЛОКОККОВ

Полный текст

Известно, что 30 - 50% всего населения Земли являются носителями стафилококков, новорожденные колонизируются уже в первую неделю жизни [17]. Стафилококки являются причиной целого ряда заболеваний от острых воспалений до хронических заболеваний с аутоиммунной составляющей. Основными патогенными факторами стафилококков являются экзотоксины [18, 21]. Для предотвращения заболеваний, вызываемых стафилококками, необходимо создать препараты, способные нейтрализовать и элиминировать из организма энтеротоксины. Одним из важных этапов создания таких соединений и исследования их безопасности для широких групп людей является исследование их на животных моделях. Описанию основных существующих моделей и посвящается данный обзор. Бактерии рода Staphylococcus вырабатывают различные факторы вирулентности, являющиеся причинами их патогенности. Это и экзотоксины (лейкосидины, гемолизины, энтеротоксины, поверхностные капсульные компоненты, пептидогликаны, тейхоевые кислоты, липазы, каталазы), эксфолиативные токсины и многие другие компоненты [18]. Около 6% синтезируемого белка составляют экзотоксины. Среди факторов патогенности особое место занимают энтеротоксины - суперантигены. Это одноцепочечные белки с молекулярной массой 22 - 30 кДа, стабильные в широком диапазоне рН и устойчивые к действию высокой температуры [15]. В настоящее время семейство энтеротоксинов (SE) стафилококков насчитывает более 20 представителей, обозначаемых буквами латинского алфавита. Они разделяются на собственно токсины-суперантигены (SEA, SEB, SEC, SED, SEE) и суперантиген-подобные токсины [31]. Важен тот факт, что энтеротоксины являются эволюционирующим семейством белков: кроме увеличения количества представителей семейства, возможны и изменения структуры, приводящие к повышению токсичности отдельных представителей, что наглядно продемонстрировано в лабораторных экспериментах по направленному мутагенезу SEA [38]. Главными молекулярными мишенями - рецепторами энтеротоксинов являются антигены гистосовместимости второго класса (MHC-II) и Т клеточный рецептор (TCR). Каждый энтеротоксин взаимодействует со своим вариантом антигена гистосовместимости или TCR и инактивируют определенную популяцию клеток иммунной системы - носителей определенных вариантов рецепторов [21]. При таком взаимодействии суперантигены-энтеротоксины способны образовывать молекулярный мостик между антигенпредставляющими и Т клетками. Кроме MHC-II и TCR суперантигены способны взаимодействовать непосредственно или косвенно с другими мембранными белками клеток иммунной системы, играющими определенную роль в передаче сигнала. Так, SEB способен образовывать комплекс MHC-II, TCR и CD28 [5]. Предположительно, в форме такого комплекса SEB проявляет суперантигенность при токсическом шоке. Для другого токсина стафилококков - токсина теплового шока (TSST-1), кроме MHC-II и TCR, показана возможность взаимодействия с антигеном клеточной дифференцировки лимфоцитов CD40 [50]. SEA, имеющий два участка взаимодействия с MHC-II, способен образовывать кластеры на плазматических мембранах лимфоцитов [39]. И если роль белков MHC-II и TCR в образовании комплекса с энтеротоксинами и в воспалительном процессе хорошо изучена, то биохимические параметры участия CD28 или CD40 в данном процессе детально не определены. Образование комплекса MHC-II и TCR на двух популяциях клеток - антигенпредставляющих и Т клетках приводит к синтезу и продукции воспалительных цитокинов, при этом клетки, активированные суперантигенами, как правило, погибают. Важным аспектом токсичности энтеротоксинов является влияние на иммунную систему массированного выброса цитокинов. В крайних случаях, это может приводить к энтеротоксин-зависимому токсическому шоку с летальным исходом. При этом иммунная система здоровых людей представляет собой хорошо слаженный механизм, в котором воспалительные реакции организма направленно регулируются лимфокинами, начиная с продукции воспалительных лимфокинов, а заканчиваются продукцией супрессорных регуляторных молекул, останавливающих реакции и переводящих клетки в стадию антигенспецифического запоминания [4]. В случае активации антигенпредставляющих клеток и Т клеток суперантигенами естественная направленность процесса синтеза лимфокинов и, главное, заключительная стадия процесса кардинально изменяется, запускаются процессы гиперактивации клеток, выходящие из-под контроля иммунной системы [41]. При повторном инфицировании возможен переход процесса в хроническую форму, в которой энтеротоксины регулируют иммунную систему хозяина таким образом, что нарушается процесс распознавания - удаления патогенов энтеротоксинов. Это приводит к развитию аутоиммунных расстройств самой различной этиологии, включая аллергические заболевания кожи, эндокардиты и ряд других [34]. Исследования молекулярных механизмов действия энтеротоксинов стафилококков продолжаются уже длительное время. Наряду с развитием методов молекулярного анализа действия энтеротоксинов, в которых процесс токсичности раскладывается на молекулярные составляющие, и исследованиями взаимодействия энтеротоксинов с компонентами клеток, представляет несомненный интерес проведение обобщающего анализа - установление результата влияния энтеротоксинов на организменном уровне, на животных моделях. Животные модели являются важной связующей частью между исследованиями in vitro (культура клеток, молекулярные модели) и in vivo исследованиями. Такие методы позволяют проводить эффективный поиск и функциональный анализ регулирующих токсины соединений, анализировать их влияние на всю систему в целом и позволяют утвердительно ответить на вопрос: возможен ли и насколько эффективен процесс нейтрализации. Первые исследования по обнаружению и функциональному изучению энтеротоксинов были связаны с вопросами установления природы токсических соединений стафилококков, выделением и очисткой энтеротоксинов и проводились на приматах, как наиболее близкой к человеку модели. Оценка токсичности проводилась на макаках весом 3 - 4 кг, для определения токсичности SEB стафилококков потребовалось 200 животных [46]. Летальную дозу LD100 определяли при внутривенном введении токсина. Была отмечена важность использования растворителей и компонентов, не содержащих эндотоксины [12]. Анализ токсичности SEA, проведенный на макаках, позволил установить два типа действия - при внутрижелудочном и внутривенном введении. Токсическая доза, вызывающая повышение температуры, диарею и рвоту, при внутрижелудочном введении составляла 1 мкг/кг, а при внутривенном - 0,03 мкг/ кг веса животного [47]. Токсичность SED также анализировали на макаках, каждому животному вводили 50 мл раствора токсина внутрижелудочно и определяли токсическую дозу. Для анализа возможности нейтрализовать токсин с помощью антител перед введением токсин в концентрации 2 мкг/мл смешивали с некоторым избытком антител. Реакцию на действие токсина и его нейтрализацию наблюдали в течение пяти часов [14]. Токсичность SEB при ингаляционном введении животным изучали на 6 макаках [35]. При этом каждое животное участвовало в отдельном эксперименте, что, несомненно, усложняло интерпретацию результатов, но было более гуманным по сравнению, например, с исследованием Schantz E.J. et al., в котором было использовано 200 животных [46]. При отсутствии на рынке лабораторных животных макак SPF категории ( specific pathogen free, свободные от определенных патогенов) при тестировании использовали клинически здоровых животных, которые ранее могли быть инфицированы стафилококками, так как проведенные исследования сыворотки крови таких животных показали наличие у них антител к энтеротоксинам [36]. Это обстоятельство может существенно искажать результаты исследований по определению токсической дозы, так как некоторая часть энтеротоксинов, использованных для введения животным в эксперименте, могла быть нейтрализована антителами животного. Необходимость установления механизмов токсичности, создания безопасных вакцин требовали массового анализа и проведения его в строго стандартизированных условиях. Одним из вариантов решения вопроса могло быть использование мелких лабораторных животных, стандартизированных по генетическим и микробиологическим характеристикам (инбредные линии мышей SPF категории) и содержание их в стандартных условиях, исключающих занос патогенов в популяцию извне. В работе Schlievert P.M. при анализе токсичности SEA и SEB использовали тест пирогенности на кроликах, изучали влияние эндотоксина на токсичность SEB, определяли минимальную пирогенную дозу, при которой температура животных достоверно изменялась на 0,5°C в течение 4 часов (она составила 10 мкг/кг). При этом летальность определяли в течение 24 часов, и LD50 составляла 10 мкг/кг, а LD100 - 100 мкг/кг [48]. Синергическое действие эндотоксина и энтеротоксинов в этих исследованиях показало, что в присутствии эндотоксина токсичность энтеротоксинов в тестах на макаках увеличивалась в 20 раз [53]. При использовании кроликов как модели исследований синергическое действие еще более возрастало [48]. В основе данного эксперимента лежал проведенный Good R.A. и Thomas L. анализ кооперативности эндотоксина и энтеротоксина в развитии токсичности и летальности [23]. Несмотря на то, что использованные в тесте энтеротоксины не были очищенными препаратами белков и с высокой степенью вероятности содержали набор энтеротоксинов, это исследование имело большое значение в развитии методов анализа токсичности и позволило разработать удобные животные модели. Авторы показали, что происхождение эндотоксина не играет роли, в тесте усиления практически одинаковую активность проявляли как эндотоксин Escherichia coli, так и эндотоксины ряда других микроорганизмов, например Salmonella spp. В исследовании, проведенном Рябиченко Е.В. и Бондаренко В.М., авторы использовали липополисахарид Serratia marcescens, который сам не обладал летальной токсичностью, но в комплексе с SEA проявлял способность активировать иммунную систему, вызывая септический шок животных - мышей линии C57B1/6 при минимальной дозе 0,1 мкг SEA - 50 мкг липо-полисахарида на животное [1]. Эти исследования заложили основу понимания взаимосвязи кооперативной токсичности эндо- и энтеротоксинов и важности использования в анализе собственно токсичности энтеротоксинов животных и реагентов, не содержащих эндотоксины, а также стимулировали поиск животных моделей, более удобных для массового скрининга и масштабных исследований как энтеротоксинов, так и веществ, способных их нейтрализовать. Поиск соединений, способных усиливать токсическое действие энтеротоксинов, показал, что такими свойствами обладают различные по химической природе и химической структуре соединения. Кроме липополисахаридов, на токсичность энтеротоксинов влияли вирусные белки [44], актиномицин D [16] и часто используемый галактозамин [8]. В зависимости от структуры энтеротоксины стафилококков взаимодействуют с разными подклассами MHC-II и TCR. В случае использования животных моделей наблюдается похожая картина: не все энтеротоксины способны вызывать летальный ответ. Так, при проведении ряда экспериментов на SPF мышах аутбредного стока CD1, в которых в качестве премирующего агента использовали галактозамин, токсичными оказались SEA, SEB и SEC1, в то время как SED и SEE, высокотоксичные для человека и приматов, в данном тесте не были летальны [8]. Интересный сравнительный анализ определения токсичности был проведен на кроликах и мышах. Для анализа токсичности группы энтеротоксинов стрептококков использовали кроликов породы WNZ (новозеладских белых) и мышей линии BALB/c [55]. Премирование проводили галактозамином (20 мг/животное) в смеси с липополисахаридом (1 мкг/животное). Данная работа продемонстрировала, что анализ токсинов на мышах и кроликах в одном оценочном эксперименте как минимум уместен, а результаты, полученные на одном виде животных, не только воспроизводимы на другом, но дополняют друг друга и позволяют получить более полную картину действия токсина. Вопрос, какой премирующий агент выбрать для функционального анализа энтеротоксинов стафилококков, связан, вероятно, с предпочтениями исследователей. Так, Blank C. et al. [9] обнаружили, что эндотоксин в качестве премирующего агента является более эффективным и имеет меньше побочных эффектов. Miethke T. et al. показали, что галактозамин является токсичным для клеток печени. Ряд исследователей использовали комбинацию премирующих агентов, при этом достигалась высокая энтеротоксинзависимая летальность при меньших дозах компонентов [37]. Также показано, что при использовании комбинации эндотоксин-галактозамин достигается высокая воспроизводимость результатов, уменьшается разброс данных, а токсическая доза энтеротоксинов при этом не изменяется в сравнении с использованием премирующих препаратов раздельно [56]. Stiles B.G. et al. [51] для анализа токсичности SEA, SEB и SEC1 использовали мышей линии С57ВL/6. Было показано, что дозы токсичности для данной линии животных низкие и составили от 0,1 до 10 мкг/животное. Такие дозы токсина являются удобными при анализе токсин-нейтрализующих молекул, например пептидов и белков. Следует обратить внимание, что авторы в этом и предыдущих исследованиях использовали в экспериментах свободных от патогенов SPF животных. Это и понятно, так как у конвенциональных животных возможно наличие неконтролируемого количества собственного эндотоксина, других факторов токсичности, способных влиять на развитие токсического шока. Кроме того, у таких животных возможно наличие антител к эндотоксину, что также может влиять на оценку токсичности [27, 35]. Было проведено сравнение токсичности SEA, SEB и TSST-1 на мышах линий BALB/c и C57BL/6, авторы изучали механизм сигнала в виде продукции лимфокинов, а также возможность блокирования септического шока через нейтрализацию лимфокинов [52]. Авторы установили, что для SEB, SEC и TSST-1 лучше использовать мышей линии BALB/c, а для SEA - мышей линии C57BL/6, летальность при введении SEA животным линии C57BL/6 наблюдались при меньших дозах, чем на мышах линии BALB/c. В работе Miethke Т. et al. [37] исследовалась роль фактора некроза опухолей в летальности, вызываемой SEB на мышах линий BALB/c (тип антигенов гистосовместимости - H-2d), С57BL/6 (тип антигена гистосовместимости H-2b) и C3H/HeJ (тип антигенов гистосовместимости H-2k). Было обнаружено, что пусковая и при этом центральная роль принадлежит фактору некроза опухолей, при этом активируется продукция и других лимфокинов, например интерферона гамма. Мыши линии C3H/HeJ (ведут происхождение от линии C3H) имеют дефекты в передаче сигнала через Toll-4 рецепторы. Авторы показали, что и галактозамин, и липополисахарид эффективны в качестве премирующих агентов при анализе токсичности SEB на трех использованных линиях мышей. Центральной молекулой, блокировка которой приводит к подавлению токсичности в виде септического шока, является фактор некроза опухолей. Другие исследователи [26, 45] для оценки токсичности ряда токсинов на мышах линии СЗН/ HeJ использовали интраназальное введение токсина. Изучение токсичности при внутрижелудочном введении представляет несомненный интерес, учитывая широкое распространение отравлений пищей, содержащей энтеротоксины [6]. Важным оказались доза и метод введения токсина. Так, Savransky V. et al. [45] токсин вводили однократно интраназально, при этом летальная доза токсина рассчитывалась индивидуально на вес животного и составляла при дозе 2 мкг/г - 67,5% , 3 мкг/г - 90% и 5 мкг/г - 100% гибели (LD100). В работе были использованы мыши весом 20 - 26 г, токсичность для них составляет, соответственно, при 67,5% летальности 40 - 52 мкг/ мышь, 90% - 60 - 78 мкг/мышь и 100% - 100 - 115 мкг/мышь. Неоспоримым удобством является однократность введения и получение результата через 48 -72 часа. Krakauer T. et al. [26] использовали двукратное введение того же токсина (SEB): первая доза вводилась интраназально, вторая - через два часа внутрибрюшинно. Определяли токсичность SEB, а также и TSST-1 на мышах линий CH3/HeJ, CH3/OuJ и BALB/c. Было установлено, что метод малоэффективен в случае использования TSST-1, 30% летальность достигалась при введении 35 мкг/мышь интраназально и 20 мкг/мышь внутрибрюшинно. Метод хорошо работал в случае SEB на мышах линий CH3/HeJ и CH3/OuJ при введении 5 и 2 мкг/мышь, соответственно. При однократном введении токсина в дозе 62 мкг/мышь животным линии CH3/OuJ интраназально наблюдалась только 40% летальность. При этом животные линии BALB/c оказались устойчивы к интраназальному введению SEB, летальность 50% наблюдалась при введении 60 и 2 мкг/мышь, соответственно [26]. Такой способ введения токсина представляет несомненный интерес по ряду факторов: во-первых, позволяет оценивать способность токсина проникать через эпителиальные ткани и, во-вторых, позволяет проводить эксперимент с более низкими дозами токсинов и, соответственно, нейтрализующих токсины соединений. Для понижения токсической дозы возможно использование и летально облученных животных, которым ввели Т клетки от мышей с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (severe combined immune deficiency - SCID). Показана возможность использования мышей линий CH3/HeJ и BALB/c, однократная доза на животное сокращалась для 100% летальности до 3 - 10 мкг/ мышь. Описанный метод сложен в исполнении, так как кроме облучения необходимо проводить работу по трансплантации клеток костного мозга. Уровень токсичности в данном исследовании зависел от времени, прошедшего после облучения и трансплантации клеток костного мозга. Понижение дозы токсичности наблюдалось не непосредственно после вышеназванных процедур, а через 24 дня для мышей линии CH3/HeJ и через 36 дней для мышей линии BALB/c. Для линии CH3/HeJ наблюдалось увеличение летальности с увеличением времени жизни химерных животных, для мышей BALB/c этот эффект не обнаружен [3]. Для приближения мышиной модели к главному объекту исследований - человеку была сделана попытка проведения исследования токсичности на трансгенных животных с антигенами гистосовместимости HLA-DR3 человека, с которыми взаимодействует SEB, на таких животных определяли токсичность [57]. У химерных животных на треть повышался ответ на SEB, но широкого распространения эта технология для оценки токсичности не получила. Кролики, также как и обезьяны, являются животными более восприимчивыми к действию энтеротоксинов стафилококков по сравнению с мышами, крысами и другими грызунами. Так, было показано, что в ответ на введение SEC1 у кроликов повышается температура тела. Минимальная пирогенная доза составила 0,1 мкг/кг массы тела животного, подъем температуры продолжался в течение 2 часов и далее был на стабильно высоком уровне. Дозы 1 мкг/кг и 5 мкг/кг массы тела животного вызывали подъем и поддержание высоких значений температуры тела в течение всего времени наблюдения (4 часа). Летальность, вызванная введением SEC1 в дозах 0,1; 1 и 5 мкг/ кг, составляла 33, 66 и 100%, соответственно [49]. Была обнаружена корреляция между степенью выраженности пирогенного эффекта и уровнем летальности, данный подход не потерял своей актуальности и в настоящее время [50]. Использование в исследованиях кроликов SPF категории позволило снизить их количество в экспериментальных группах до 3 - 4 особей, что оказалось минимальным, но достаточным для получения статистически значимых различий между сравниваемыми группами. Однако использование в исследованиях конвенциональных кроликов требует увеличения количества особей в экспериментальных группах. Очевидно, что это связано с тем, что конвенциональные животные обладают большей индивидуальной чувствительностью к действию энтеротоксинов, что увеличивает вариабельность ответных реакций животных на вводимые вещества и, как следствие этого, для получения статистически значимых различий между группами требуется увеличение количества животных в группе. При анализе в тесте летальности TSST-1 на конвенциональных кроликах без использования эндотоксинов летальная доза составляла 150 мкг/кг животного [42]. Использование кроликов в исследовании токсичности энтеротоксинов имеет огромное значение. Этот вид более чувствителен к энтеротоксинам по сравнению с мышами, а наличие на рынке животных категории SPF облегчает стандартизацию. В большинстве анализированных работ используются небольшие партии животных, как правило, 3 - 4 кролика в эксперименте. Очевидно, для получения статистически достоверных результатов необходимо использовать в группах сравнения гораздо большее число экспериментальных животных, иначе есть опасность неверной интерпретации результатов из-за индивидуальной чувствительности особей. Несомненно, проведение исследований на мелких лабораторных животных (мышах) позволит увеличить величину выборки без существенного увеличения экономических затрат. Возраст животных влияет на состояние иммунной системы, при старении организма иммунная система и восприятие патогенов и токсинов отличаются от таковых у молодых особей [19]. Кроме наличия клеток памяти к различным антигенам с возрастом изменяется и реактивность. Так, показано, что молодые и старые мыши одной линии по-разному реагировали в тестах токсичности на SEB, старые животные были более восприимчивы [28]. При исследовании механизмов такого различия было показано, что у молодых животных возможен механизм толерантности, основанный на механизме удаления реактивных Т клеток. С возрастом данный механизм защиты утрачивался, и животные становились более чувствительными к токсическому шоку, одновременно наблюдалось изменение количества лимфокинов в крови, повышалась концентрация интерферона-гамма, интерлейкина-2 и интерлейкина-4. При этом основной вклад в летальность, по мнению авторов, вносил интерферон гамма. На начальных этапах изучения факторов иммунной системы, опосредующих действие энтеротоксинов, было показано, что основную роль в реакции организма играют фактор некроза опухолей, интерлейкин-2 и интерферон-гамма [37]. Дальнейшие детальные исследования выявили участие в процессе интерлейкина-6 и фактора хемоатрактанта моноцитов [26]. При этом были обнаружены такие особенности, как зависимость спектра лимфокинов от способа введения токсинов. Так, при интраназальном введении центральную роль играли интерлейкин-2 и хемоатрактант моноцитов [24], а при внутрибрюшинном введении - фактор некроза опухолей и интерферон-гамма. Продукция других лимфокинов (^-1альфа, IL-6) также возрастала, но различия по сравнению с продукцией их в ответ на введение только липопо-лисахарида были значительны [37, 51]. При естественном развитии воспаления на заключительных стадиях продуцируется супрессорный лимфокин интерлейкин-10, останавливающий иммунные реакции. Показано, что введение этого лимфокина способно снижать гиперреактивность и предотвращать токсический шок, вызываемый энтеротоксинами [7]. Анализ роли перитонеальных клеток в ответе организма животных на энтеротоксины и эндотоксины показал, что при введении животным SEA и липополисахарида перитонеальные клетки мыши резко увеличивали продукцию фактора некроза опухолей-альфа и интерферона-гамма. И что важно, при этом значительно усиливалась продукция активных форм кислорода фагоцитирующими клетками. Максимальных значений продукция фактора некроза опухолей, интерферона-гамма и активных форм кислорода перитонеальными клетками достигали при воздействии на животных токсических доз SEA и липополисахарида, и эти показатели совпадали с летальным токсическим шоком [2]. Таким образом, показано, что наряду с лимфокинами важным фактором токсического шока являются и фагоцитирующие клетки - продуценты активных форм кислорода. При изучении суперантигенности вариантов SEB в качестве модели воспалительной реакции использовались клеточные модели, в которых анализировалась способность суперантигена взаимодействовать с TCR и вызывать активацию биосинтеза белка клетками иммунной системы [25]. Интересен эксперимент по контролю способности SEB активировать дифференцировку Т хелперов с превращением основной популяции в Т хелперы второго типа. Этот тип клеток продуцирует широкий спектр лимфокинов и играет важную роль в регулировании дифференцировки лимфоцитов и активации аллергических реакций [32]. Такая биологическая модель представляет несомненный интерес в свете установленной в настоящее время роли энтеротоксинов-суперантигенов в активации аутоиммунных расстройств, в частности таких, как аллергия и астма [32]. Во многих случаях, например, при исследовании молекулярных механизмов активации клеток иммунной системы суперантигенами или их неактивными аналогами, при поиске веществ с токсин-нейтрализующей активностью, необходим прямой анализ взаимодействия энтеротоксинов стафилококков с рецепторными молекулами. Для этого возможно использование выделенных рецепторов, но предпочтительнее использовать естественные клеточные модели, экспрессирующие рецепторные молекулы. Это важно, учитывая возможное участие в реакция с энтеротоксинами и других, не рецепторных молекул клеток иммунной системы, например, возможную олигомеризацию SEA и MHC-II [39], участие CD28 во взаимодействии SEB c MHC- 11 и TCR [5], а также возможное участие CD40 во взаимодействии TSST-1 с MHC-II и TCR [50]. Для изучения таких взаимодействий часто используют сортировщики или анализаторы клеток, в которых изучают взаимодействие меченных флуорохромом суперантигенов с клетками, на плазматических мембранах которых экспрессированы рецепторные молекулы (MHC-II и TCR). Для упрощения и воспроизводимости анализа предпочтительнее использовать стабильные клеточные линии, несущие определенный тип рецепторных молекул MHC-II и/или TCR [43]. Необходимо отметить, что при анализе суперантигенности на клеточных биологических моделях предпочтительным является комбинированный подход с анализом как специфичности взаимодействия с рецепторными молекулами, так и развитие последующих событий - пролиферации или дифференцировки клеток, продукции лимфокинов или влияние на другие типы клеток. Это позволяет получить более полную и достоверную картину процесса. Поиск способов нейтрализовать действие энтеротоксинов суперантигенов является актуальной задачей, поскольку инактивация их в процессе заболевания позволит иммунной системе направленно бороться с синтезирующим токсины микроорганизмом [40]. Для решения задачи инактивации токсинов и предотвращения интоксикации разработаны несколько подходов. Во-первых, традиционная иммунизация анатоксином. На этом направлении существует ряд проблем, связанных с разнообразием токсинов и необходимостью проводить иммунизацию набором антигенов. Такой подход, например, довольно часто применяется для SEB, учитывая его значение как представителя биологического оружия [10]. Для анализа эффективности такого подхода используются в качестве животных моделей мыши и приматы, при этом оценивается как эффективность гуморального иммунитета - выработка токсин-специфических антител, так и способность выживать при летальной дозе. Во-вторых, представляет интерес подход использования для инактивации энтеротоксинов фрагментов рецепторных молекул MHC-II и TCR [13]. Для более эффективной инактивации энтеротоксинов авторы повысили аффинность участка TCR, с которым взаимодействует токсин, до пикомолярного уровня. Анализ проводился на мышиной модели по оценке подавления летальности, индуцируемой SEB и эндотоксином. Кроме того, активно осуществлялся поиск пептидов - агонистов фрагментов токсинов для подавления токсического действия [33]. Для подавления летального действия энтеротоксинов SEA, SEB и SEC2 использовались самки мышей линии BALB/c при использовании премирующих агентов эндотоксина в дозе 8 мкг и галактозамина в дозе 12 мг на животное. Пассивная вакцинация позволяет инактивировать попавшие в организм токсины и является важным элементом сохранения жизни при интоксикации [22, 30]. Изучение взаимодействия токсинов с антителами и получение высокоэффективных нейтрализующих антител представляют несомненный интерес. В одной из первых работ описана разработка модели токсичности TSST-1 на конвенциональных кроликах, которая была использована для поиска нейтрализующих TSST-1 моноклональных антител [11]. В последнее время отмечен значительный интерес исследователей к получению рекомбинантных антител к энтеротоксинам стафилококков [20, 29, 54]. С помощью гибридомной технологии, использования В лимфоцитов от доноров, сыворотка которых содержала высокореактивные антитела к энтеротоксинам стафилококков, были получены моноклональные антитела человека. Изучение токсин-нейтрализующей активности этих антител на модели летальной токсичности с использованием мышей линии BALB/c показало, что доза SEB, соответствующая LD50, составляла 0,2 мкг/мышь, при премировании эндотоксином в дозе 150 мкг/ мышь. В тесте подавления токсичности токсин SEB в дозах 1, 5, 10, 20, 50 и 100 мкг смешивали и инкубировали с 500 мкг антител в течение часа при комнатной температуре, и такой препарат вводили животным внутрибрюшинно. Было найдено антитело с высоким нейтрализующим потенциалом 100% при дозе SEB 1 мкг и 80% при дозе 5 мкг. При анализе токсин-нейтрализующей способности антител авторы наряду с тестами летальности in vivo на животных анализировали способность антител блокировать продукцию фактора некроза опухолей альфа и интерферона-гамма популяцией лимфоцитов периферической крови. Было показано хорошее совпадение результатов по токсин-нейтрализующей способности антител [20]. Необходимо отметить, что для повышения статистической достоверности данных авторы использовали от 5 до 30 животных в экспериментальных группах. Varshney A.K. et al. [54] для анализа нейтрализующей способности мышиных моноклональных антител к SEB использовали мышей линии BALB/c, которых премировали галактозамином в дозе 25 мг/мышь, и трансгенных мышей с антигенами гистосовместимости человека HLA-DR3. У трансгенных животных летальность достигалась двукратным введением SEB внутрибрю-шинно по 50 мкг/животное с разницей в 48 часов, животные умирали через 4 - 5 дней. Larkin E.A. et al. [29] получили рекомбинантные антитела человека к SEB и изучили их влияние на токсичность этого энтеротоксина в клеточных тестах энтеротоксин-зависимой продукции лимфокинов, в котором они оказались высокоактивны. В тесте ингибирования летальности на мышах линии BALB/c при использовании SEB в дозе 2,5 мкг/мышь и эндотоксин, как описано в [28], для повышения эффекта нейтрализации SEB предварительно инкубировали с антителами и такой комплекс вводили животным. Даже при таком способе анализа лучший эффект нейтрализации составил 68%. Авторы исследовали влияние Fc части иммуноглобулина на возможное неспецифическое взаимодействие с компонентами плазмы и клеток мыши. Для одного из антител Fab фрагмент в тесте подавления летальности был в два раза активнее полноразмерного антитела, при этом эффект составлял 34 и 17%, соответственно, а для другого значения ингибирования токсичности для Fab и полноразмерных антител не менялись [29]. Описанные выше модели находят применение при оценке терапевтического потенциала рекомбинантных антител против энтеротоксинов, практически все работы посвящены энтеротоксину В. Предпочтение этому энтеротоксину отдано, на наш взгляд, по причине его широкого распространения, высокой стабильности в экстремальных условиях, доступности и, возможно, его значением, как представителя биологического оружия. Исследования токсин-регулирующих антител, пептидных препаратов, созданных на основе структурных данных об энтеротоксинах стафилококков, и животные модели для оценки токсинов и нейтрализующих молекул находятся на стыке молекулярной биомедицины и инфекционной микробиологии. В данной области постоянно совершаются открытия, над решением которых работают большие коллективы исследователей. Необходимо отметить, что основные литературные данные по изучению токсичности на животных моделях посвящены четырем токсинам: SEB, SEA, TSST-1 и SEC1, список токсинов представлен в соответствии с частотой встречаемости в литературе. Важным элементом таких исследований является то, что они проводятся в кооперации с клеточными и молекулярно биологическими исследованиями. Причем, использование клеточных культур, полученных от человека, дополняет исследования на животных моделях. Анализ литературных источников показал: 1) использование животных моделей является необходимым элементом для анализа как энтеротоксинов, так и препаратов с предполагаемой блокирующей антитоксической активностью; 2) наиболее перспективной экспериментальной моделью в исследованиях in vivo для первичного скрининга являются линии мышей SPF категории, свободные от носительства патогенов, способных исказить результаты исследования; 3) для полной оценки воздействия энтеротоксинов на организм необходимо проводить комплексные исследования на разных моделях, использование мышей и кроликов представляется удачным сочетанием.

Об авторах

А. О Шепеляковская

Филиал института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Пущино, Московская обл.; Пущинский государственный естественно-научный институт, Московская область

С. Г Семушина

Филиал института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Пущино, Московская обл.; Пущинский государственный естественно-научный институт, Московская область

А. Н Мурашев

Филиал института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Пущино, Московская обл.; Пущинский государственный естественно-научный институт, Московская область

И. И Адамейко

Каролинский институт, Стокгольм, Швеция

Ф. А Бровко

Филиал института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Пущино, Московская обл.; Пущинский государственный естественно-научный институт, Московская область

Список литературы

Дополнительные файлы