ХАРАКТЕРИСТИКА МЕХАНИЗМОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЦИКЛОФЕРОНА

Полный текст

Золотистые стафилококки, вегетирующие на слизистой оболочке переднего отдела носа, вызывают развитие болезней органов дыхания, учащают и утяжеляют бронхолегочные заболевания [8], влияют на развитие аллергических заболеваний респираторного тракта [3]. Одним из перспективных направлений профилактики данных заболеваний является использование лекарственных препаратов, обладающих не только прямым и опосредованным воздействием на иммунитет, но и универсальной противоинфекционной активностью [1]. К числу таких препаратов можно отнести циклоферон, который стимулирует иммунитет и естественную колонизационную резистентность слизистых оболочек макроорганизма [9], снижает способность микроорганизмов к инактивации комплемента [7], оказывает преимущественно ингибирующее действие на образование биопленок грибами Candida spp. [5]. Однако механизмы действия циклоферона на S.aureus изучены недостаточно. В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение влияния циклоферона в экспериментальных и клинических условиях на персистентные свойства золотистых стафилококков, а также особенностей их морфо-функциональной реакции методом атомносиловой микроскопии. В экспериментах использовали раствор циклоферона для внутривенного введения (ООО «Наука» - технологическая фармакологическая фирма «ПОЛИСАН», Санкт-Петербург). Экспериментальное изучение влияния препарата на антикарнозиновую активность (АКрА) стафилококков [2] и их способность к образованию биопленок [11] проводили на 12 клонах S.aureus, выделенного со слизистой оболочки переднего отдела носа резидентного бактерионосителя по методике [7] в течение 10 дней с ежедневным пересевом. Выделение клонов осуществляли путем рассева суточной бульонной культуры золотистого стафилококка на плотную питательную среду в соответствии с [10]. Обработанные циклофероном стафилококки исследовали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) в контактном режиме с использованием сканирующего зондового микроскопа sММ-2000 (ЗАО «ПРОТОН-МИЭТ», Россия). Клиническое наблюдение включало обследование на стафилококковое бактерионосительство 80 детей в возрасте 8 - 12 лет с формированием группы резидентных бактерионосителей из 26 человек, просанированных циклофероном в течение 10 дней с ежедневным бактериологическим контролем. Экспериментальное изучение влияния циклоферона на персистентные свойства золотистых стафилококков было проведено методом популяционного анализа. При определении популяционной структуры исследуемых штаммов стафилококков установлено, что под действием циклоферона происходило перераспределение клональной структуры исходной культуры S.aureus. В контроле популяция золотистого стафилококка содержала 67% клонов с высокими значениями АКрА 2,0 - 3,0 мг/мл; 16,5% диссоциантов со значениями признака в диапазоне 1,0 - 1,9 мг/мл; 16,5% клонов не обладали способностью к инактивации карнозина. Среднепопуляционный уровень АКрА составлял 2,1+0,3 мг/ мл. Соинкубирование стафилококков с циклофероном приводило к изменению популяционной структуры стафилококков в сравнении с контролем: увеличивалось число клонов, не обладающих АКрА (76%), снижалась доля диссоциантов со средними значениями признака (8%) и появлялись клоны с низким (0,1 - 0,9 мг/мл) уровнем активности (16%). Среднее значение антикарнозиновой активности в популяции снизилось до 0,2±0,12 мг/ мл. Одновременно нами проведено изучение влияния циклоферона на способность золотистых стафилококков образовывать биопленки. Популяция S.aureus была представлена клонами с различной степенью выраженности признака: 80% клонов со средними значениями биопленкообразования (от 1,9 до 2,5) и 20% диссоциантов с высокими значениями свойства (2,6 и более), средняя способность популяции образовывать биопленки была равна 2,44+0,04. При соинкубировании стафилококков с циклофероном отмечалась диссоциация популяции бактерий, в результате которой 80% клонов характеризовались низким уровнем биопленкообразования (1,1 - 1,8) и 20% диссоциантов не обладали способностью образовывать биопленки, средний уровень БПО в популяции составил 1,26+0,05. Полученные экспериментальные данные послужили основанием для проведения клинических исследований: по трехкратному бактериологическому обследованию была сформирована группа резидентных стафилококковых бактерионосителей и определена антикарнозиновая активность у S.aureus, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа этих лиц. Среднее значение признака составило 1,8 мг/мл. В зависимости от исходного уровня АКрА все исследуемые штаммы стафилококков были разделены на три группы: с низкими значениями признака (0,7 мг/мл и 0,9 мг/мл) - 15,4% выделенных штаммов, средними значениями (от 1,1 мг/мл до 1,7 мг/мл) - 46,2% стафилококков и высокими значениями (от 2,2 мг/мл до 3,0 мг/мл) - 38,5% S.aureus. Под влиянием циклоферона было отмечено уменьшение числа бактерионосителей S.aureus до 19,0%, снижение обсемененности слизистых оболочек золотистыми стафилококками с 5х103 до <1х103 КОЕ/мл и с 1х103 КОЕ/мл до единичных колоний. Среднее значение АКрА у выделенных штаммов S.aureus составило 0,9 мг/мл, низкие значения признака (от 0,2 до 0,7 мг/мл) отмечены у 41,6% штаммов, средние - в диапазоне от 1,1 мг/мл до 1,5 мг/мл у 58,3% золотистых стафилококков, высоких значений АКрА у культур не было. Таким образом, проведенные экспериментальные и клинические исследования по изучению биологической активности циклоферона показали однозначное снижение персистентных свойств стафилококков под действием этого препарата. Полученные данные могут быть представлены в качестве одного из механизмов, раскрывающего антибактериальное действие циклоферона. Далее изучали особенности морфо-функциональной реакции S.aureus на воздействие циклоферона с помощью атомно-силовой микроскопии. Основные морфологические параметры бактерий, оцениваемые количественно, включали в себя: длину, ширину, высоту клеток, а также рассчитанный на этой основе объем бактерий. Проведенная на атомно-силовом микроскопе визуализация контрольных образцов S.aureus показала, что интактные бактериальные клетки имеют овоидную форму со средними значениями длины 0,64+0,09 мкм, ширины 0,88+0,10 мкм, высоты 0,64+0,05 мкм. АСМ ультраструктуры клеточной стенки интактных бактерий позволила охарактеризовать рельеф поверхности, среднеквадратичная шероховатость (Rq - отклонение точек профиля от его средней линии) которой составила 2,46+0,72 нм. При культивировании S.aureus в присутствии терапевтических концентраций циклоферона (50 мг/мл) было отмечено увеличение длины бактерий на 23,4% и высоты клеток на 12,5%, при этом ширина клеток не изменялась. Кроме того, шероховатость поверхности стафилококков достоверно увеличивалась с 2,46+0,72 до 3,8+0,27 нм (p<0,05). В работе установлено, что под действием циклоферона происходит снижение уровня антикарнозиновой активности и способности к биопленкообразованию S.aureus в результате внутрипопуляционной перестройки микробного сообщества, проявляющейся в значительном увеличении доли клонов с низкой выраженностью указанных свойств или их отсутствием. Бактериологические исследования по выделению золотистых стафилококков у резидентных бактерионосителей с последующей оценкой антикарнозиновой активности штаммов показали, что влияние циклоферона приводило не только к снижению уровня микробной колонизации слизистой оболочки носа S.aureus и способности у них к инактивации карнозина, но и к исчезновению штаммов с высокой АКрА. Выявленное совпадение результатов направленности воздействия регулирующего фактора на персистентные свойства стафилококков в условиях in vitro и in vivo согласуется с результатами работ по изучению влияния лекарственных средств на способность стафилококков к инактивации факторов естественной резистентности организма [4, 6]. С использованием атомно-силовой микроскопии детализированы механизмы биологической активности циклоферона в отношении S. aureus. Исследование ультраструктуры поверхности золотистых стафилококков выявило значительное увеличение ее шероховатости, а также изменение морфологии бактериальных клеток, что свидетельствует о нарушении барьерных функций клеточной стенки золотистых стафилококков под воздействием препарата. Полученные материалы открывают перспективы для использования циклоферона в качестве препарата для санации резидентных стафилококковых бактерионосителей как превентивной меры в возникновении заболеваний верхних дыхательных путей.

Об авторах

Т. М Уткина

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург

Л. П Потехина

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург

О. Л Карташова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург

А. С Васильченко

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург

Список литературы

Дополнительные файлы