ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНОВ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ В ШТАММАХ VIBRIO CHOLERAE О1 И О139 СЕРОГРУПП

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Согласно данным Всемирной организации здравоохранения с каждым годом растет число антибиотикоустойчивых штаммов возбудителей инфекционных заболеваний. Не являются исключением и штаммы возбудителя холеры - Vibrio cholerae, вызывающие острую инфекционную болезнь с диарейным синдромом. С одной стороны, применение антибиотиков при лечении холеры существенно сокращает развитие инфекционного процесса, выделение и распространение вибрионов, но с другой - способствует возникновению устойчивых штаммов. Бесконтрольное использование антибиотиков при лечении различных заболеваний способствовало тому, что всё чаще регистрируется выделение культур V cholerae с множественной лекарственной устойчивостью. При этом неблагоприятный прогноз по холере усугубляется выделением штаммов с маркерами резистентности к широко применяемым для экстренной профилактики и лечения холеры антибактериальным препаратам (тетрациклинам, хлорамфениколу, фуразолидону, триметоприму/сульфа-метоксазолу, аминогликозидам, беталактамам) [3, 13]. Несмотря на то, что устойчивость к антибиотикам не является фактором вирулентности, она играет важную роль в селекции, выживаемости и широком распространении патогенных штаммов V. cholerae. В связи с вышеизложенным цель нашей работы состояла в определении чувствительности штаммов V cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор и штаммов О139 серогруппы к антибиотикам и выявлении распространенности в их геноме генов антибиотикорезистентности. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе было использовано 48 штаммов О1 серогруппы V. cholerae биовара Эль Тор. Для уточнения времени появления антибиотикорезистентных штаммов в анализ были взяты предпандемические штаммы - V. cholerae МАК97, МАК676, МАК757, МАК30 (Индонезия, 1937), а также изоляты, выделенные в начале текущей пандемии и в современный ее период. Кроме того, исследования проводились на 27 штаммах V cholerae О139 серогруппы, изолированных в 1993 - 1997 гг. (табл. 1). Штаммы хранятся в лиофилизированном состоянии в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». Для культивирования бактерий применяли бульон и агар LB (рН 7,2), посевы инкубировали 16 - 18 часов при температуре 37°С. Чувствительность культур к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом с использованием препаратов фирмы HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия) и НИЦФ (Санкт-Петербург). Диски с антибиотиками имели следующие концентрации - ампицилин (Ap) - 10 мкг, хлорамфеникол (Cm) - 30 мг, рифампи-цин (Rf) - 5 мкг, канамицин (Kn) - 20 мкг, спектиномицин (Sp) - 25 мкг, тетрациклин (Tc) - 30 мкг, стрептомицин (Sm) - 10 мг, триметоприм (Tp) - 25 мкг. Выделение ДНК для постановки полимеразной цепной реакции осуществляли в присутствии 6М гуанидинтиоцианата с использованием набора «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (Интерлабсервис, Москва) в соответствии с инструкцией к набору. ПЦР для Штамм V. cholerae Антибиотикограмма Присутствие генов антибиотикорезистентности $trB 8ИШ dfr18 dfrA SXT О1 серогруппа Эль Тор биовара 1937 MAK97, MAK676, MAK757, МАК30 Ар!‘ Rf Kns Sps ТС Sms Cms Tps - - - - - 1961-1990 31 Ар!‘ Rf Kns Sps ТС Sms Cms Tps - - - - - Т-4 Арг Rf Knr Sps Тсs Sms Cms Tps - - - - - 34Каюм Арs Rf Kns Sps Тс5 Sms Cms Tps - - - - - М818 Арг Rf Kns Sps Тс5 Sms Cms Tps - - - - - М736, М738 Ар5 Rf Krf Spr Тс5 Smr Cm5 Tp5 + - - - - М712, М713 Ар5 Rf Krf Sp5 Тс5 Smr Cm5 Tp5 + - - - - С803 Ар5 Rf Knr Spr Тс5 Sm5 Cm5 Tp5 - - - - - М1011 Ар5 Rf Krf Spr Тс5 Smr Cm5 Tp5 + - - - - M1013 Ар5 Rf Krf Spr Тс5 Sm5 Cm5 Tp5 - - - - - М582 Ар5 Rf Krf Sp5 Тс5 Sm5 Cm5 Tp5 - - - - - М1114, М1115 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Sm5 Cm5 Tp5 - - - - - Р14161 Ар5 Rf Krf Sp5 Тс5 Sm5 Cm5 Tp5 - - - - - Р14169 Ар5 Rf Krf Sp5 Тс5 Smr Cm5 Tp5 + - - - - С402 Ар5 Rf Krf Sp5 Тс5 Smr Cm5 Tp5 + - - - - Р14576 Ар5 Rf Krf Sp5 Тс5 Sm5 Cm5 Tp5 - - - - - М1259, М1261 Ар5 Rf Krf Spr Тс5 Smr Cm5 Tp5 + - - - - 1993-2011 М1264, M1272, M1299, M1298 Арг Rf Kn5 Spr Тсг Smr Cmr Tpr + + - + + M1270, M1271 Арг Rf Kn5 Spr Тсг Smr Cmr Tpr + + - + + М1268 Арг Rf Kn5 Spr Тс5 Smr Cmr Tpr + + - + + M1269 Арг Rf Kn5 Spr Тсг Smr Cmr Tpr + + - + + Р17644, Р17647, Р17645 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Smr Cmr Tpr + + - + + М1337 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Sm5 Cm5 Tp5 - - - - - M1344, M1345, M1349 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Smr Cmr Tpr + + - + + М1411 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Sm5 Cm5 Tp5 - - - - - M1429 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Smr Cmr Tpr + + - + + Р18748 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Sm5 Cm5 Tp5 - - - - - M1430 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Smr Cmr Tpr + + - + + Р18899 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Smr Cmr Tpr + + - + + Л3225, Л3226, Л4150 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Smr Cmr Tpr + + - + + 301 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Smr Cmr Tpr О139 серогруппа + + - + + 1993-1997 МО28 Ар5 Rf Krf Sp5 Тс5 Smr Cmr Tpr + + + - + 62, 88, 70, 71 Ар5 Rf Krf Sp5 Тс5 Smr Cmr Tpr + + + - + 55 Ар5 Rf Krf Sp5 Тс5 Smr Cm5 Tpr - - + - - AS486, AS549, AS581, PG29 Ар5 Rf Krf Sp5 ТС Smr Cm5 Tp5 + + - - - AS507, AS514, AS612, AS559, Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Smr Cmr Tp5 + + - - + AM308, AM354 AM324, AM348, PG8, AS528, AS536 Арг Rf Kn5 Sp5 Тс5 Smr Cm5 Tp5 + + - - - AS521, AM319, AM338A, S497, PG3 Ар5 Rf Krf Sp5 Тс5 Smr Cmr Tp5 + + - - + AM333 Ар5 Rf Knr Sp5 Тс5 Smr Cmr Tp5 + + - - + Название праймера Последовательность праймера Температура отжига, °С Размер ампликона, п.н. Ссылка ctxA-F CGGGCAGATT CTAGACCT CCTG 64 564 [7] ctxA-R CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC 62 tcpAEl GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACAC 56 471 [12] tcpAEl GAAAGGACCTTCTTTCACGTTG 56 dfrA1-F CAAGTTTACATCTGACAATGAGAACGTAT 61 278 [6] dfrA1-R ACCCTTTTGCCAGATTTGGTA 56 strB-F CCGCGATAGCTAGATCGCGTT 62 515 [14] strB-R CGACTACCAGGCGACCGAAAT 62 dfr18-F TGGGTAAGACACTCGTCATGGG 59 389 [10] dfr18-R ACTGCCGTTTTCGATAATGTGG 62 sulII-F AGGGGGCAGAT GT GATCGAC 62 626 [10] sulII-R TGTGCGGATGAAGTCAGCTCC 61 SXT-F ACTTCACTCGTGGTAACTGGTCCCA 65 860 рассчитаны в дан- SXT-R CGTCTGTGTAGGCATTGCACCG 64 ном исследовании определения наличия генов ctxA и tcpA проводили в микропробирках объемом 600 мкл и 200 мкл на многоканальном амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Москва). Использованные в работе праймеры приведены в табл. 2. РЕЗУЛ ЬТАТЫ На первом этапе работы все взятые для анализа штаммы V cholerae были исследованы методом ПЦР на присутствие основных генов вирулентности - ctxA, входящего в состав оперона ctxAВ, кодирующего продукцию холерного токсина, ответственного за развитие диареи, и tcpA, кодирующего биосинтез основной субъединицы токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА), участвующих в колонизации. В результате проведенных исследований выявлено, что большинство исследованных штаммов холерных вибрионов биовара Эль Тор были токсигенными. Отдельного внимания заслуживают штаммы V. cholerae М1337 (Астрахань, 2000), М1411 (Калмыкия, 2002), Р18748 (Сочи, 2004), у которых не выявлены гены ctxA и tcpA. Возникает вопрос, за счет каких факторов вирулентности штаммы вызвали заболевание, если гены, кодирующие основной фактор колонизации и холерный токсин отсутствовали? Возможно, заселение кишечника было связано с продукцией вибрионами дополнительных факторов колонизации, синтезируемых V. cholerae [8], а диарея могла быть результатом продукции на фоне ослабленного организма дополнительных токсинов и токсических веществ, например, RTX токсина (repeat in toxin) и/или термолабильного гемолизина. Все исследованные изоляты О139 серогруппы содержала оба (ctxA+, tcpA+) тестируемых гена, что указывает на их вирулентность. Таким образом, 93,8% использованных в работе штаммов V. cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор и все взятые для анализа штаммы V. cholerae О139 серогруппы были вирулентными. Далее была определена устойчивость штаммов V. cholerae к восьми наиболее часто используемым в медицинской практике антибиотикам (табл. 1: r - резистентность, s - чувствительность). В результате проведенного анализа подтверждена временная связь между введением в лечебную практику антибиотиков и появлением устойчивых к ним клинических штаммов. Так, предпандемические штаммы V. cholerae биовара Эль Тор были чувствительны ко всем изученным лекарственным препаратам. Штаммы, выделенные в начале пандемии (1961 - 1990 гг.), были устойчивы к одному-двум антибиотикам. При этом 20% были устойчивы к стрептомицину, 15% - к ампицили-ну и 5% - к спектиномицину. Однако наибольшее количество штаммов (25%) были одновременно устойчивы к двум антибиотикам - стрептомицину и спектиномицину, по 5% - к ампицилину/канамицину и канамицину/спектиномицину. Авирулентные штаммы V cholerae М1337, Р18748, М1411 были устойчивы только к ампицилину. Штаммы V. cholerae О1 биовара Эль Тор c множественной лекарственной устойчивостью (стрептомицин, хлорамфеникол, триметоприм) начали завозиться в Россию с 1993 года, что подтверждает данные литературы о циркуляции в данное время полирезистентных штаммов на эндемичной по холере территории [10, 13]. Необходимо отметить, что 94% исследованных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор были чувствительны к тетрациклину и 100% - к рифампицину. При анализе штаммов V. cholerae О139 серогруппы, изолированных от больных во Франции (1994 г.) и Индии (1997 г.), выявлено, что 100% изолятов были устойчивы к стрептомицину, 74% - к хлорамфениколу, 41% - к ампицилину, 22% - к стрептомицину и триметоприму. Однако в отличие от штаммов V. cholerae О1 серогруппы Эль Тор биовара холерные вибрионы О139 серогруппы были чувствительны не только к рифампицину и тетрациклину, но и к спектиномицину, а 96,3% - к канамицину. Следующий этап работы был посвящен выявлению в геноме исследуемых штаммов генов антибиотикорезистентности, входящих в состав SXT элемента (sulfamethoxazole-trimethoprim). Выбор данного элемента обусловлен тем, что он несет гены устойчивости сразу к четырем антибиотикам - сульфаметоксазолу, триметоприму, фуразолидону и стрептомицину. Для определения генов антибиотикорезистентности была сконструирована мультиплексная ПЦР, которая включала праймеры для выявления генов - sulII (резистентность к сульфаметоксазолу), dfrA1 (устойчивость к триметоприму вибрионов О1 серогруппы), dfr18 (резистентность вибрионов О139 серогруппы к триметоприму), strB (устойчивость к стрептомицину В) и rumB (наличие SXT элемента) (табл. 2). Праймеры к генам sulII, dfrA1, dfr18, strB описаны в литературе, праймеры на ген rumB сконструированы с использованием программы Oligo 6.0 и обеспечивали амплификацию фрагмента размером 860 т.п.н. Реакционная смесь включала 2,5 мкл стандартного 10-кратного буфера для Taq-полимеразы (0,7 М трис-HCl, рН 8,8; 0,2 М сульфат аммония; 200 мкг/мл БСА; 0,1% Тween-20), 2,5 мкл 25 М MgCl2, 2 мкл смеси дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ «Fermentas», каждый в концентрации 2 ммоль), 0,4 мкл Taq ДНК-полимеразы (5 ед/ мкл, «Fermentas»), 5,1 мкл деионизованной воды. В готовую смесь добавляли смесь прямого и обратного праймеров в количестве 0,5 мкл для SXT, 0,25 мкл sulII, 0,4 мкл dfr18, 1 мкл dfrA, 0,4 мкл strB и 10 мкл исследуемой ДНК. Амплификацию осуществляли на термоциклере с горячей крышкой «MJ RESEARCH» (США). Программа амплификации была следующей: предварительная денатурация при температуре 94°С - 2 мин, затем 34 цикла, включающих денатурацию при температуре 94°С в течение 1 мин, отжиг праймеров при температуре 61°С - 1 мин, синтез комплементарной цепи при 72°С - 1 мин и финальная элонгация 72°С - 2 мин. Регистрацию результатов ПЦР осуществляли методом электрофореза в 1,5 - 2% агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл этидия бромида. В результате использования тест-системы подтверждено отсутствие в геноме предпандемических штаммов генов антибиотикорезистентности (табл. 1). SXT элемент и гены антибиотикорезистентности не выявлены также и в геноме авирулентных штаммов (М1337, Р18748, М1411). Можно предположить, что утрата мобильных элементов, содержащих гены вирулентности, происходит одновременно с потерей SXT элемента. Однако SXT элемент обнаружен в штаммах V. cholerae биовара Эль Тор, выделяемых после 1993 года. Необходимо отметить, что данные штаммы относятся к генетически измененным штаммам (геновариантам), которые отличаются от типичных Эль Тор вибрионов, вызвавших текущую 7 пандемию холеры, по структуре ряда генов вирулентности (ctxB, rstR), а изолированные в последние годы - и по структуре острова пандемичности VSP-II и tcpA. Геноварианты в отличие от типичных штаммов V cholerae биовара Эль Тор являются более вирулентными и вызывают тяжелую клиническую форму болезни с высокой смертностью [5, 15]. При ПЦР тестировании геновариантов в их геноме выявлено наличие SXT элемента Эль Тор типа (SXTEI) с геном dfrA1. У ряда штаммов V cholerae биовара Эль Тор (М736, М738, М712, М713, М1011, Р14169, С402, М1259, М1261), устойчивых к стрептомицину, тестировался ген strB, но SXT элемент в их геноме выявлен не был. Возможно, данные изоляты содержат другие мобильные элементы (например, плазмиды) с геном устойчивости к стрептомицину. Таким образом, SXT элемент, определяющий устойчивость штаммов сразу к нескольким антибиотикам, впервые обнаружен в штаммах V cholerae биовара Эль Тор, завезенных в Российскую Федерацию в 1993 году и относящихся к токсигенным штаммам геновариантов. Особого внимания заслуживает факт выявления SXTEX элемента в геноме штамма V cholerae 301, выделенного из морской воды в районе города Таганрог (2011 г.). Согласно данным литературы в отсутствии селективного давления антибиотиков штаммы V cholerae биовара Эль Тор утрачивают устойчивость к ним [1, 4]. Однако анализ штамма V. cholerae 301 указывает, что находясь во внешней среде, токсигенные штаммы геновариантов способны сохранять устойчивость к антибиотикам и мобильные генетические элементы (МГЭ) с генами антибиотикорезистентности. При анализе штаммов V cholerae О139 серогруппы выявлено 20 штаммов (74%), содержащих SXT элемент. Однако из них только 5 штаммов (Индия, 1993; Франция, 1994) имели SХТMO10 с геном dfr18, характерный для штаммов О139 серогруппы. Остальные же штаммы (Индия, 1997) содержали дефектный SXT элемент, лишенный гена dfr18 (strB+, sulII+, dfr18-, SXT+). Обнаружен также один штамм - V. cholerae 55, в геноме которого выявлен только ген dfr18 (strB-, sulII-, dfr18+, SXT-). У 26% изученных штаммов О139 серогруппы не выявлен ампликон размером 860 п.н., что указывает на отсутствие SXT элемента. Однако в геноме данных штаммов тестируются гены sulII и strB (strB+, sulII+, dfr18-, SXT-). Возможно, данные штаммы содержат измененный SXT элемент или другие МГЭ (интегроны, плазмиды) с генами антибиотикорезистентности. Таким образом, исследованные нами штаммы V. cholerae О139 серогруппы представляют собой гетерогенную группу, включающие изоляты с разной структурой SХТ элемента. ОБСУЖДЕНИЕ Согласно известным данным возникновение антибиотикоустойчивых штаммов V. cholerae связано с приобретением ими различных МГЭ с генами резистентности - коньюгативных плазмид, коньюгативных транспозонов, интегронов, SXT-элементов, а также в результате спонтанных мутаций в ряде генов, расположенных на хромосоме [2, 11]. Так, SXT-элемент или констин размером 99,5 т.п.н. впервые был обнаружен у холерных вибрионов О139 серогруппы, вызвавших вспышки холеры в Индии и Бангладеш в 1992 году. Данные вибрионы были устойчивы сразу к нескольким антибиотикам - сульфаметоксазолу, триметоприму, фуразолидону и стрептомицину. В результате молекулярно-генетического изучения штаммов О139 серогруппы было установлено, что гены, кодирующие резистентность к данным антибиотикам (dfr18, floR, strAB, sulII), расположены на транспозоноподобном элементе размером 17,2 т.п.н., внедренным в ген rumB из оперона rumAB SXT элемента [9, 10, 17]. По названию штамма - V. cholerae МО10, в котором он впервые был обнаружен, данный коньюгативный генетический элемент был обозначен как SXTMO10 [16]. Кроме генов антибиотикорезистентности SXT констин содержит также высоко консервативную последовательность int, кодирующую интегразу, участвующую как в интеграции, так и исключении SXT, что указывает на возможность его вырезания и попадания в другие штаммы. Действительно, в штаммах V. cholerae биовара Эль Тор, появившихся на эндемичной территории после вспышек холеры, вызванных штаммами V. cholerae О139 серогруппы (1993 г.), было обнаружено присутствие SXT элемента [10]. Однако SXT элемент Эль Тор вибрионов отличался от SXTMO10. В нем был делетирован фрагмент с геном drf18 размером 3,3 т.п.н., но присутствовал новый интегроноподобный элемент с геном drfA1, поэтому SXT элемент штаммов V. cholerae биовара Эль Тор был обозначен как SXTET [10]. В результате проведенного нами анализа выявлено, что действительно штаммы V. cholerae биовара Эль Тор, завезенные в Россию в 1993 году и относящиеся к токси-генным штаммам геновариантов, содержат SXT элемент с генами антибиотикорезистентности. Таким образом, приобретение SXT элемента холерными вибрионами биовара Эль Тор совпало или произошло одновременно с изменением структуры их генов вирулентности (гена ctxB из профага СТХ). Необходимо отметить, что штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, выделяемые в настоящее время, подвержены дальнейшим эволюционным изменениям. В их геноме выявлены как точковые мутации, так обширные делеции в генах вирулентности (ctxB, tcpA) и жизнеобеспечения (mshE, mshJ, ТagА-подобный белок, белки OmpV, OmpH, пируват-флаводоксин оксидоредуктаза, остров интегронов, остров пандемичности VSP-II) [5, 15, 16]. При этом, изменениям также подвержен и SXT элемент, в котором обнаружены различные однонуклеотидные замены, что, возможно, является следствием адаптации штаммов V. cholerae к новым условиям существования [16, 18]. Поскольку SXT констин является мобильным элементом, можно было ожидать, что штаммы могут легко его утрачивать. Однако среди изученных штаммов данный элемент отсутствовал лишь у авирулентных изолятов V. cholerae биовара Эль Тор и у 26% вибрионов О139 серогруппы. Стабильное сохранение SXT элемента в геноме штаммов V. cholerae биовара Эль Тор в течение длительного времени (около 20 лет) может указывать на его важную роль в биологии холерного вибриона. В связи с недостаточным количеством штаммов О139 серогруппы, имеющихся в нашем распоряжении, окончательный вывод для штаммов данной серогруппы сделать затруднительно. Однако в пользу высказанного предположения свидетельствуют данные литературы о выделении в современный период клинических штаммов V. cholerae О139 серогруппы, содержащих SXT элемент [18]. Возникновение штаммов V cholerae биовара Эль Тор, несущих SXT элемент, после вспышек холеры, вызванных вибрионами О139 серогруппы, вполне логично способствовало появлению распространенного мнения, что данный мобильный элемент был получен ими от вибрионов О139 серогруппы. Однако B. Hochhut et al., изучая штаммы О139 серогруппы, выделенные в Индии в 1996 году, высказали предположение, что штаммы V cholerae биовара Эль Тор, содержащие SХТEГ, и штаммы V cholerae О139 серогруппы с SХТMO10 эволюционировали независимо друг от друга [10]. При этом, их предковой формой был штамм, содержащий SXT элемент с генами sulII, strB, floR, но с делетированным геном dfr. Изоляты с данной структурой SXT элемента были выявлены и нами при изучении штаммов V cholerae О139 серогруппы, выделенных в Индии в 1997 году. Однако высокая гетерогенность структуры SXT элемента, обнаруженная на небольшой выборке штаммов V. cholerae О139 серогруппы, а также более позднее по времени появление штаммов О139 серогруппы с указанной выше структурой SXT элемента (1996 - 1997 гг.), на наш взгляд, подтверждают ранее высказанное предположение о приобретении SXT элемента штаммами V. cholerae биовара Эль Тор от штаммов О139 серогруппы. Полученные нами сведения о наличии генов антибиотикорезистентности в исследованных штаммах V. cholerae О1 и О139 серогрупп могут быть использованы при изучении молекулярно-генетических механизмов появления антибиотикорезистентных штаммов холерного вибриона, а также конструировании новых генодиагностических тест-систем и проведении паспортизации штаммов, хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий. Формирование полирезистентных штаммов холерного вибриона происходит в результате горизонтального переноса генов, что позволяет говорить о возможности появления и распространения клонов, устойчивых к действию новых лекарственных препаратов. Очевиден также факт, что формирование штаммов холерных вибрионов с множественной устойчивостью к лекарственным препаратам - одно из основных направлений эволюции этого патогена, поэтому необходимо проведение молекулярного мониторинга за возбудителем холеры с использованием адекватных генодиагностических средств. Работа частично выполнена в рамках ГК №56-Д от 09.06.2010 г. ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2014 гг.)».

Об авторах

С. П Заднова

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Саратов

Н. И Смирнова

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Саратов

Список литературы

Дополнительные файлы