К вопросу об актуальности разработки и перспективам использования препарата бактериофага Streptococcus pneumoniae

Полный текст

Введение

Актуальной проблемой для многих стран мира являются инфекции пневмококковой этиологии. Патоген Streptococcus pneumoniae при определённых условиях может вызывать у человека ряд инфекционных заболеваний и угрожающих состояний, в том числе пневмонию, отит, синусит, менингит, сепсис, эндокардит, артрит и др.¹ К группам риска по заболеваемости относят детей, лиц пожилого возраста, пациентов с хронической патологией сердечно-сосудистой системы, органов дыхания и печени, функциональной или анатомической аспленией, сахарным диабетом, иммунодефицитами, травмами черепа, позвоночника и др. [1, 2]. Снижение заболеваемости и смертности от пневмококковой пневмонии остаётся одной из приоритетных задач клинической и профилактической медицины [3]. Широкое географическое распространение S. pneumoniae, способность формировать устойчивые к антибиотикам штаммы [4–9] диктуют необходимость разработки новых антимикробных средств. Согласно Плану реализации мероприятий в рамках Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в России на период до 2030 г.² к приоритетным биотехнологическим разработкам в этой области относят препараты бактериофагов. Благодаря специфичности, высокой противомикробной активности, способности к накоплению в очаге поражения, проникновению через биологические барьеры бактериофаги являются перспективными кандидатами, нацеленными на актуальные штаммы S. pneumoniae.

Основная часть

Исследования по получению пневмококкового бактериофага берут начало на Урале в Пермском Институте эпидемиологии и микробиологии Наркомздрава РСФСР (в настоящее время филиал НПО «Биомед» ФГУП НПО «Микроген», Пермь). В 1935 г. аспирантке института А.М. Родигиной на чувствительных бактериальных культурах S. pneumoniae впервые удалось выделить стрептококковый бактериофаг [10]. Под руководством профессора П.И. Чистякова проведены 3 серии экспериментов на 16 лабораторных животных (кролики) с целью изучения возможности использования бактериофага в офтальмологии при язвенном поражении роговой оболочки глаза. Каждому кролику в роговицу выполнена инъекция раствором, содержащим клинические вирулентные штаммы пневмококка, что приводило к развитию язвенного процесса. В «опытной» группе животных применяли подконъюнктивальные инъекции и/или обильное промывание роговицы полученным фаголизатом, при этом во всех случаях язвенный процесс прекращался и наступала реконвалесценция. В контрольной группе животных заболевание продолжалось более длительный период времени и осложнялось иритом, гипопионом и панофтальмитом. Таким образом, впервые на биологической модели была доказана клиническая эффективность нового антимикробного средства. Однако бактериофаг не имел узкой специфичности.

В настоящее время Россия является мировым лидером по производству препаратов бактериофагов, включая стрептококковые. На базе НПО «Микроген» выпускают широкую линейку моно- и поливалентных фагов. Так, «Бактериофаг стрептококковый» представляет собой фильтрат фаголизатов различных видов Streptococcus. Действующим активным веществом коммерческого препарата «Секстафаг» (МНН препарата Пиобактериофаг) являются фаголизаты Staphylococcus, Streptococcus, Proteus (P. vulgaris, P. mirabilis), Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae. Препарат «Пиобактериофаг комплексный» (МНН препарата Пиобактериофаг) включает фаги Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis. Сочетание бактериофагов в препарате повышает эффективность эмпирической терапии, однако может оказать существенное влияние на резидентную микрофлору.

Верхние дыхательные пути человека как один из важнейших его биотопов имеют значительное представительство микробных ассоциаций. Согласно исследованию И.А. Беляева и соавт., проведённому во всех возрастных группах населения, выявлено, что стрептококки в зеве являются доминирующими видами [11]. Эти данные подтверждает работа Е.В. Беляевой и соавт., где установлена ведущая роль Streptococcus (75,2%) в микробиоценозе носоглотки [12]. При этом нарушение состава ассоциантов приводило к развитию активного инфекционного процесса [11–13]. I. Fujimori и соавт. установили высокий риск инфицирования пациентов вирулентными штаммами β-гемолитического стрептококка группы А (S. pyogenes) при пониженном уровне содержания в зеве α-гемолитических стрептококков [14, 15]. Авторы объяснили это способностью большинства α-гемолитических стрептококков выделять бактериоцины, подавляющие рост S. pyogenes [18].

S.E. Tzannetis и соавт. отметили влияние некоторых штаммов оральных стрептококков на стафилококки [17]. Используя технику отсроченного антагонизма, они установили, что наибольшую ингибирующую активность против штаммов стафилококков имели стрептококки определённых видов, в том числе S. mutans, S. sanguis и S. mitior, наименьшей активностью обладали S. milleri и S. salivarius. В целом назальные штаммы стрептококков оказались более чувствительны к «природным» ингибиторам, чем оральные. Сделан вывод о важной защитной функции оральных стрептококков. Подтверждением явилась работа H. Bisgaard и соавт., где основным микробным фактором в развитии бронхиальной астмы у детей к 5 годам жизни определены S. pneumoniae, H. influenzae и M. catarrhalis при условии колонизации этими видами ротовой полости новорождённых на фоне отсутствия представителей нормофлоры [18]. Дисбиотические состояния полости рта у взрослых лиц на фоне приёма антибиотиков влекли за собой развитие пародонтита и кариеса [19, 20]. Использование антимикробных средств широкого спектра действия приводило к серьёзным нарушениям баланса внутри микробного сообщества и к потере ключевых симбиотических видов бактерий, которые в нормальных условиях предотвращают чрезмерный рост патогенов, что необходимо учитывать при персонализированной терапии.

Примеры фаготерапии у человека при пневмококковой инфекции немногочисленны, посвящены использованию комплексных препаратов со стрептококковым компонентом. В.Г. Акимкин и соавт. выявили положительный эффект препарата «Бактериофаг стрептококковый» (АО НПО «Микроген») у лиц со стрептококковой инфекцией из организованных коллективов [21]. После профилактического курса аэрозольным орошением ротоглотки бактериофагом (по 1,5–2,0 мл препарата 2 раза в день) количество выделенных стрептококков в группе наблюдения уменьшилось в 2,4 раза, преимущественно за счёт доли S. pneumoniae. В группе сравнения количество бактериальных культур, напротив, увеличилось в 2,8 раза. Заболеваемость среди лиц, получивших бактериофаг, снизилась в 1,8 раза, в группе «сравнения» выросла в 1,4 раза.

В настоящее время определена полная геномная последовательность пневмококковых бактериофагов Dp-1 и MM-1 (семейство Siphoviridae), Cp-1 и SOCP (семейство Podoviridae) и фага EJ-1 (семейство Myoviridae). В 2017 г. получен фаг MS1 с синтетическим геномом по отношению к фагу Dp-1 и средней идентичностью нуклеотидов 73,3% (на 62,3% выровненных последовательностей) [22]. Фаги Cp-1, SOCP, Dp-1 и MS1 отнесены к группе литических, фаги MM-1, EJ-1 — к группе умеренных, которые способны интегрировать свой геном в геном бактериальной клетки. Встроенный ген может передаваться дочерним клеткам при их делении. При этом бактерии, несущие в составе своего генома геном бактериофага, определены как лизогенные, а интегрированный фаг назван профагом. Эта микробная ассоциация «хозяин–паразит» будет существовать до тех пор, пока стрессовые условия не приведут к индукции профага из генома бактерии с возможной реализацией бактериофагом литического цикла развития. Известно, что профаги (или их остатки) широко распространены в геноме S. pneumoniae. По последним оценкам, их несут до 90% бактериальных изолятов [23].

Первым из пневмококковых бактериофагов охарактеризован фаг Dp-1 семейства Siphoviridae, полученный M. McDonnell и соавт. от пациентов с лёгкими симптомами инфекции верхних дыхательных путей [24]. Фаг в форме икосаэдрического капсида (69,8 ± 1,2 нм) с длинным несокращающимся хвостовым отростком (длина — 169,9 ± 3,6 нм, ширина — 19,6 ± 2 нм), литическим циклом развития [25] описан как первый фаг грамположительной бактерии, содержащий липиды (8,5% от сухой массы) [26]. Авторы указали на высокий уровень чувствительности Dp-1 к органическим растворителям и, как следствие, на его низкую стабильность (хлороформ активно используют при консервации и длительном хранении фаголизата). Первым этапом инфекционного процесса с участием бактериофага является адсорбция фаговых частиц на поверхности бактериальной клетки путём взаимодействия фага со специфическими рецепторами. Для адсорбции фага Dp-1 необходимы остатки фосфорилхолина, который входит в состав тейхоевых кислот всех грамположительных бактерий [27]. К фосфорилхолину нековалентно прикреплены холинсвязывающие белки Cbp, одним из них является белок CpbA, основной пневмококковый адгезин [28, 29]. К фосфорилхолину также крепятся холинсвязывающие литические ферменты, в их числе LytA (N-ацетилмурамоил-1-аланинамидаза). Как основной аутолизин он приводит к лизису бактериальных колоний, способствует пленкообразованию [30]. Вывод о необходимости холиновых (choline) остатков для адгезии фага Dp-1 сделан R. Lopez и соавт. на основе культивирования S. pneumoniae, где вместо холина (choline) в состав питательной среды были включены другие аминоспирты (этаноламин, N-монометиламиноэтаноламин, N-диметиламиноэтаноламин) [27]. Пневмококки на средах с добавлением этаноламина и N-монометиламиноэтаноламина значительно хуже адсорбировали фаг. При этом повышенная концентрация Dp-1 и время инкубации не оказывали существенного влияния на эффективность показателя скорости адсорбции. Авторами отмечено, что штаммы S. pneumoniae, культивируемые на питательных средах с этаноламином, в присутствии холина (choline) восстанавливали способность адсорбировать фаг.

Анализ генома фага Dp-1 проведён M. Sabri и соавт. [31]. Фаг имел длину 56 506 пар нуклеотидов, включал 156 взаимодействий и 72 рамки считывания. Содержание G+C в нём составило 40,3%, что близко (39%) к содержанию G+C в геноме S. pneumoniae. Последовательность генома Dp-1 загружена в базу данных GenBank под регистрационным номером HQ268735³. Авторы выявили гомологию большинства генов Dp-1 с генами других фагов грамположительных бактерий — как вирулентных, так и умеренных. В частности, установлена отдалённая гомология гена упаковочного кластера (orf23) фага Dp-1 и фрагмента гена большой субъединицы терминазы (orf37) умеренного фага EJ-1. Каркасный белок Gp41 (авторы назвали белок фага Dp-1 glycoprotein 41), кодируемый orf41, оказался гомологичным капсидному белку Gp23 фага S. aureus 88 и консервативному домену каркасного белка Gp20 фага Lactobacillus mv4. Обнаруженный феномен иллюстрирует последствия генетического обмена между популяциями фагов, который происходит через сообщества «бактерий-хозяев».

Следующим литическим фагом S. pneumoniae, выделенным из зева здоровых детей C. Ronda и соавт., был фаг Cp-1 семейства Podoviridae [32]. Морфологически фаг представлен вытянутым гексагональным капсидом (65,8 ± 1,1 на 42,1 ± 1,7 нм) с коротким несокращающимся хвостом (длина 19,3 ± 1 нм, ширина 7,5 ± 1,2 нм) [25]. Авторы отметили стабильность фага при хранении. Способность Cp-1 инфицировать не только S. pneumoniae, но и S. oralis отмечена в работе C. Ronda и соавт. [33]. Cp-1 имеет геном линейной двухцепочечной ДНК с концевым белком, ковалентно связанным с его 5'-концами. ДНК фага реплицируется по механизму праймирования белка. Геном имеет 19 343 пары нуклеотидов. Общее содержание G+C в ДНК Cp-1 составляет 38,8%, что коррелирует (39%) с общим содержанием G+C в геноме S. pneumoniae. Определены 28 рамок считывания. Для адгезии на поверхности клеточной стенки фагу Cp-1, как и фагу Dp-1, необходимы холиновые (choline) остатки [34]. Последовательность генома фага Cp-1 с номером Z47794 выложена в GenBank⁴. Примечательно, что S. Ouennane и соавт. при секвенировании фага Cp-1 из коллекции Félix d'Hérelle получили последовательность нуклеотидов, отличную от фага Cp-1 Z47794 [27]. В результате Cp-1 Félix d'Hérelle был переименован в SOCP и зарегистрирован в GenBank как фаг KJ617393.1⁵, его геном включает 19 347 п.н. (Cp-1 Z47794 имеет 19 343 п.н.). Установлена возможность лизиса фагами Dp-1 и SOCP S. mitis [27].

Первым секвенированным умеренным фагом S. pneumoniae был фаг MM1. V. Obregón и соавт. определили, что его геном длиной 40 248 п.н. организован 53 открытыми рамками считывания и, по меньшей мере, имеет 5 функциональных кластеров (лизогенный, репликационный, структурный, упаковочный, литический). ДНК зрелых фаговых частиц является терминально избыточной и содержит ковалентно связанный белок с 5'-концами. Среднее содержание G+C в ДНК фага MM1 составило 38,4%, что сопоставимо с данными соотношения нуклеотидов в геноме его хозяина — S. pneumoniae (39%). Сравнение генома MM1 с геномами других бактериофагов также выявило их сходство с фагами грамположительных бактерий [35].

Электронная микроскопия ММ1 установила его принадлежность к семейству Siphoviridae. Морфологически фаг имеет форму икосаэдрического капсида (60 нм в диаметре) с длинным несокращающимся хвостом (160 нм в длину) [36]. При этом реакция сайт-специфической рекомбинации, приводящая к интеграции фага в бактериальный геном, опосредуется фаговой интегразой. Процесс происходит путём опознавания и рекомбинации специфических последовательностей ДНК, расположенных в геномах бактерии и фага. Эти «сайты прикрепления» носят названия attB и attP (the bacterial attachment site и the phage attachment site). После встраивания фага в бактериальную клетку образуются два гибридных сайта — attL и attR. Обратная индукция профага предполагает рекомбинацию между attL и attR с образованием attB и attP. E. Gindreau и соавт. идентифицировали и депонировали последовательности attB, attP, attL и attR в GenBank под регистрационными номерами AJ400631, AJ400629, AJ400632 и AJ400630 [36]. Установлено, что гены профага часто оказывают «фенотипическое» влияние на «бактерию-хозяина». Так, в 2006 г. J.M. Loeffler и соавт. изучили лизогенные и нелизогенные штаммы S. pneumoniae [37]. В работе использован умеренный фаг ММ1-1998 (идентичность последовательностей ММ1-1998 с ММ1 составила более 99,8%). Лизогенные штаммы S. pneumoniae обладали лучшей адгезивной способностью к инертным поверхностям (стекло, пластик) и биологическим тканям (клеточные культуры носоглотки животных). В своём исследовании авторы доказали, что присутствие профага в бактериальной клетке вызывает её фенотипическую модификацию с повышением вирулентности и адаптационных механизмов.

Другим наиболее полно охарактеризованным умеренным фагом S. pneumoniae стал фаг EJ-1, выделенный из клинического изолята S. pneumoniae 101/87 [38]. Источником выделения фага EJ-1 (индуцирован из бактериальной клетки Митомицином С) был штамм S. pneumoniae, полученный из крови пациента с внебольничной пневмонией. Штамм характеризовался устойчивостью к желчи, оптохину, не поддавался серотипированию и нес ген lytA, специфичный для всех штаммов S. pneumoniae [39]. Умеренный фаг EJ-1, капсид которого представлен 57 нм, имел длинный сокращающийся хвост длиной 130 нм, в последующем был отнесён к семейству Myoviridae. Его геном не содержал ковалентно связанных белков. В 2004 г. P. Romero и соавт. выложили в GenBank полную геномную последовательность EJ-1 (длиной 42 935 пар нуклеотидов), организованную 73 открытыми рамками считывания и как минимум 5 функциональными кластерами [40]. Среднее содержание G+C в ДНК фага EJ-1 составило 39,6%, идентично (39%) содержанию G+C в геноме S. pneumoniae [41].

Активное изучение пневмококковых бактериофагов в дальнейшем продолжилось в плоскости оценки биохимических процессов, происходящих в бактериальной клетке под действием бактериофага, где важным и завершающим этапом является разрушение клеточной стенки бактерии и высвобождение зрелых фаговых частиц. Известно, что бактериальный лизис происходит преимущественно за счёт выработки специфических ферментов, кодируемых фагами. Два различных класса литических ферментов были обнаружены в пневмококковых фагах, в их числе амидазы и лизоцим. Все они разлагают муреин путём гидролиза гликозидной связи между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой или между лактильной группой N-ацетилмурамовой кислоты и аминогруппой L-аланина. Фермент Cpl-1, кодируемый фагом Cp-1, является лизоцимом, а ферменты Pal, Mml и Ejl, кодируемые фагами Dp-1, MM1 и EJ-1, — амидазами. Литические ферменты фагов имеют двухдоменную структуру, где С-концевой домен специфически распознаёт и связывает в клеточной стенке бактерии холин (choline), тогда как N-концевой домен отвечает за расщепление связей в пептидогликане [42, 43]. Особенностью лизиса клетки бактериофагом с двухцепочечной ДНК является синтез белка холина (holin), функция которого заключается в создании повреждений в цитоплазматической мембране. Тем самым для муреингидролаз обеспечивается доступ к муреиновому слою клеточной стенки. Как правило, ген, кодирующий холин (holin), и ген, кодирующий эндолизин, располагаются в геноме фага друг за другом. В частности, продуктами генов 21 и 22 в геноме фага Cp-1 являются лизоцим и холин (holin) соответственно. Данный механизм лизиса называется «холин-лизоцим лизисная стратегия» (holin-lysozyme lysis strategy) [44, 45].

Кодируемые фагами ферменты, специфически разрушающие клеточные стенки бактерий, изучают в плоскости проблемы антибиотикорезистентности. Так, в 2003 г. I. Jado и соавт. исследовали фермент лизоцим Cpl-1, кодируемый фагом Cp-1, и фермент амидазу Pal, кодируемую фагом Dp-1 [46]. В качестве продуцента обоих ферментов использовали штамм E. coli, несущий pCIP100 или pMSP11. Действие Cpl-1 и Pal тестировано на модели пневмококкового сепсиса у лабораторных животных (мыши). При внутрибрюшинном заражении животных S. pneumoniae и однократном (через 10 мин) введении в брюшную полость Cpl-1 или Pal в течение суток авторы наблюдали дозозависимый терапевтический эффект в форме снижения клинических симптомов заболевания. При использовании 40 мкг Cpl-1 или 40 мкг Pal все животные полностью выздоравливали. Отмечен синергический эффект комбинации двух фаговых литических ферментов. На идентичной биологической модели через 1 ч после заражения и совместного внутрибрюшинного введения по 2,5 мкг Cpl-1 и Pal (при этом суммарная доза компонентов 5 мкг была в 8 раз ниже, чем при использовании монокомпонента в дозе 40 мкг) у животных останавливалось развитие инфекционного процесса. Однократная же инъекция 5 мкг любого из двух перечисленных ферментов в отдельности на фоне введения живой культуры S. pneumoniae приводила к летальному исходу. Эффект выздоровления в «опытной» группе животных наблюдали и при более поздней (через 2 ч после заражения) инокуляции литических ферментов, в последующем названных энзибиотиками. В отличие от антибиотиков, требующих постоянной фармакологической концентрации активного вещества, достигаемой при строгом интервале дозирования, однократной инъекции энзибиотика было достаточно для подавления роста клинических изолятов S. pneumoniae. Авторы считают эти уникальные субстанции многообещающими кандидатами в качестве средств антимикробной терапии [46].

Одной из перспективных стратегий борьбы с инфекционными болезнями человека и животных считается совместное применение антибиотиков и энзибиотиков. На идентичной модели пневмококковой бактериемии у лабораторных мышей определён синергический эффект комбинации антибиотика — даптомицина и энзибиотика — Cpl-1 [47]. Мышам внутрибрюшинным способом вводили S. pneumoniae D39, что приводило в течение 72 ч к летальному исходу. При однократной инъекции даптомицина (0,4 мг/кг) выживаемость мышей на 7-й день эксперимента составляла 35%. При введении Cpl-1 (0,4 мг/кг) все животные погибали в течение 72 ч. Совместное внутрибрюшинное введение даптомицина и Cpl-1 (по 0,4 мг/кг каждого вещества) повышало показатель выживаемости до 80%. У выживших животных отсутствовали признаки инфекции, наблюдалась прибавка в массе тела с той же скоростью, что у неинфицированных. При увеличении дозы Cpl-1 в 2,5 раза (с 0,4 до 1,0 мг/кг) и прежней концентрации даптомицина (0,4 мг/кг) выживаемость на 7-й день достигала 95%. Авторы установили, что использование комбинации Cpl-1 и даптомицина, помимо выраженного клинического эффекта, предотвращало появление устойчивых к даптомицину штаммов S. pneumoniae. Таким образом, стратегия применения антибиотика и энзибиотика имела у животных высокую эффективность.

M. Harhala и соавт. провели первые экспериментальные исследования безопасности и токсичности двух эндолизинов фагов Dp-1 и Cp-1 на клеточных культурах человека [48]. На первом этапе авторы осуществили профилирование экспрессии генов на микрочипах для двух клеточных линий: FaDu (плоскоклеточный рак глотки, ATCC HTB-43) и SC (макрофаги периферической крови, ATCC CRL-9855). В последующем клеточные линии подвергали воздействию 0,5 мкМ Pal или Cpl-1 в течение 6 ч. Анализ ДНК на микрочипах не показал статистически значимых различий в показателях экспрессии генов изучаемых клеточных культур. Авторами также на образцах крови 6 здоровых доноров установлено отсутствие потенциального влияния эндолизинов на систему комплемента ex vivo. Оценивали активацию системы по классическому, альтернативному и лектиновому путям. В дальнейшем на биологической модели мыши оценивали показатели выработки специфического иммунного ответа на фоне однократного введения каждого из ферментов Pal или Cpl-1. Период оценки составил 50 дней. Индукция IgG характеризовалась медленным увеличением титра антител до 30-го дня, затем показатель выходил на плато. Динамика формирования IgG явилась типичной для иммунного ответа испытуемой биологической модели на вещества белковой природы. У животных не было отмечено негативных соматических и поведенческих реакций, отсутствовала выработка IgE, связанная с развитием гиперчувствительности и аллергических реакций, стабильным оставался уровень провоспалительных цитокинов, существенно не менялся состав микробиома, однако родственные бактерии из группы S. mitis проявили чувствительность к Cpl-1 и Pal. Проведённые исследования выявили незначительное влияние энзибиотиков на клеточные и системные функции организма мелких животных, что предопределило перспективу изучения их фармакокинетики и фармакодинамики на крупных млекопитающих и приматах.

Одним из важных механизмов уклонения S. pneumoniae от иммунного ответа является полисахаридная капсула. Помимо функции основного фактора патогенности микроорганизма, её присутствие ингибирует внедрение фага в бактериальную клетку за счёт ограничения доступности рецептора, что доказали в лабораторных условиях P. Leprohon и соавт. [49]. Авторы сравнили чувствительность к фагу неинкапсулированного (R6) и инкапсулированного (D39) штаммов S. pneumoniae. Неинкапсулированный (бескапсульный) штамм R6 с 1950-х гг. применяют в качестве лабораторного стандарта, отсутствие капсулы делает его авирулентным и безопасным для работы. Родительским штаммом R6 является штамм R36A (производный штамма D39), полученный выращиванием D39 в присутствии кроличьей антисыворотки путём 36 последовательных пассажей [50]. Инкапсулированный (капсульный) штамм D39 исходно демонстрировал полную устойчивость к фагам SOCP и Dp-1, в отличие от штамма R6. Инактивация D39 по гену cps2C приводила к уменьшению размера капсулы и появлению у штамма D39 чувствительности к фагам SOCP и Dp-1, аналогично штамму R6. Таким образом, авторы предположили, что капсула S. pneumoniae может влиять на резистентность клетки-хозяина к литическому фагу. На уровень экспрессии капсулы S. pneumoniae оказывает влияние ряд факторов [51, 52]. В 1998 г. охарактеризованы два основных фенотипа S. pneumoniae, обозначенные как «прозрачный» и «непрозрачный», при этом последний обладал выраженной вирулентностью с содержанием концентрации полисахарида в капсуле выше, чем у «прозрачного», в 1,2–5,6 раза [53]. «Прозрачный» фенотип имел в клеточной стенке в 2,1–3,8 раза большее количество тейхоевых кислот. Выявленные отличия подтверждены культивированием S. pneumoniae в питательной среде с радиоактивным изотопом холина ([³H]choline), входящим в состав тейхоевой кислоты, которая признана единственным резервуаром холина в бактериальной клетке пневмококка. В то же время уровень экспрессии капсулы S. pneumoniae непостоянен и обеспечивает условия, при которых фаговая инфекция не будет всё время ингибироваться капсулой. В связи с этим инкапсулированные штаммы пневмококка также подвержены фаголизису.

Более 90 серотипов S. pneumoniae в настоящее время идентифицированы по биохимической структуре капсульного полисахарида, что свидетельствует о высокой пластичности и рекомбинантной изменчивости генома возбудителя, приводящей к формированию устойчивости к антибиотикам. В связи с этим серотипирование S. pneumoniae по капсульному полисахариду актуально для внутривидовой идентификации микроорганизма, определения тяжести инфекционного процесса и выявления антимикробной резистентности [54, 55]. Изучение актуальных серотипов S. pneumoniae на определённых территориях и в отдельных группах населения в зависимости от возраста, практики применения антибиотиков, клинических проявлений инфекции, демографических характеристик, охвата населения вакцинацией, состава вакцинных штаммов имеет значение в плане персонализированного подхода к лечению и профилактике пневмококковой инфекции [56, 57]. Результаты исследований, проведённых в разных странах, свидетельствуют о том, что более 80% наиболее тяжёлых инвазивных случаев заболеваний, как правило, обусловлены 20 основными серотипами, в их числе 13 вызывают до 70–75% случаев манифестных форм. Повышенной устойчивостью к основным классам антибиотиков характеризуются представители серотипов 23, 19 и 6 [55, 58]. Наиболее часто инвазивные формы у детей до 5 лет вызывают серотипы 4, 6, 9, 14, 18, 19 и 23, в остальных возрастных группах преобладают 4, 6, 9, 12, 14, 19 и 23 [55, 59, 60]. Особого внимания заслуживает информация о циркуляции в России серотипов 19F, 14, 9V/A, 15 A/F, 6 A/B/C/D, 3 и 23F [61–64], часть из них не представлена в составе современных вакцин (15 A/F/C, 6 C/D, 9A). Некоторые ассоциируются с определёнными клиническими формами. Так, серотипы 3 и 14 чаще вызывают пневмонии и плевриты с деструкцией лёгочной ткани [5, 65], серотипы 3 и 19F — острый средний отит у детей. Г.В. Белошицкий и соавт. отметили, что серотипы 23F, 14, 19F и 3 могут стать причиной развития тяжёлых клинических форм менингита и приводить к летальным исходам [66].

Бактериальные штаммы внутри одного вида и даже подвида могут обладать направленной чувствительностью к фагам, что позволяет успешно использовать бактериофаги для воздействия на определённый биовар, серовар, фаговар. Одна из серьёзных проблем в борьбе с пневмококковой инфекцией состоит в сложности лабораторной диагностики S. pneumoniae, включая внутривидовую идентификацию возбудителя — важный элемент мониторинга за эпидемическим процессом. Основная трудность оценки серотипового пейзажа S. pneumoniae связана с отсутствием методов типирования, одновременно обладающих высокой специфичностью, чувствительностью, воспроизводимостью и низкой себестоимостью.

Наиболее известными способами серотипирования S. pneumoniae в настоящее время являются реакция набухания капсулы (по Нейфельду), тест латекс-агглютинации и ПЦР-серотипирование. При использовании перечисленных методов в ряде случаев имеют место перекрёстные реакции с антигенами представителей внутри семейства Streptococcaceae (S. oralis, S. mitis и др.) и даже между семействами (Escherichia coli, Klebsiella и др.) [67]. В связи с широким внедрением вакцинации от пневмококковой инфекции в последние годы происходит смена циркулирующих серотипов. Так, в работе 2021 г. Е.В. Никитиной и соавт. отмечено снижение эффективности метода капсульного ПЦР-серотипирования S. pneumoniae за последние 5 лет (2016–2021 гг.) со 100 до 41,6% [68].

Наряду с этим внутривидовая идентификация микроорганизмов с использованием бактериофагов берёт своё начало в 1960-е гг. Одним из первых типируемых на фаговары видов микроорганизмов был S. aureus, использовался международный набор диагностических стафилококковых фагов Давидсона [69, 70]. На протяжении многих лет фаготипирование S. aureus помогало эффективной расшифровке эпидемических вспышек при стафилококковых пищевых токсикоинфекциях на предприятиях общественного питания и при нозокомиальных инфекциях в медицинских организациях. Установлена различная лизирующая способность листериофагов [71]. Лизис отдельных серотипов бактериофагами наблюдали при внутривидовой идентификации Enterobacter cloacae [72]. Результаты исследований по фенотипированию Acinetobacter baumannii с изучением специфической активности ацинетобактерного бактериофага опубликованы О.С. Федотовой и соавт. [73]. Впервые авторами установлена специфичность ацинетобактерного бактериофага к отдельному сиквенс-типу A. baumannii (ST 1167). Разработка и внедрение альтернативных лабораторных стратегий внутривидового типирования с использованием бактериофагов, направленных на повышение качества идентификации S. pneumoniae, является приоритетом в решении молекулярно-биологических и эпидемиологических задач, поскольку несёт значимый потенциал в изучении новых факторов вирулентности, патогенности и антибиотикорезистентности микроорганизмов. С их решением станут возможными глубокая оценка филогенетических связей внутри циркулирующей микробной популяции пневмококков и, как следствие, грамотное обоснование противоэпидемических и профилактических мероприятий при пневмококковой инфекции, включая вакцинопрофилактику. Одно из решений данной проблемы мы видим в разработке оригинального набора бактериофагов специфической направленности на актуальные серотипы или генотипы S. pneumoniae.

Заключение

Значимым направлением в области сохранения здоровья и качества жизни населения является борьба с пневмококковой инфекцией путём совершенствования средств и методов специфической профилактики, диагностики и лечения. В этой связи разработка нового антимикробного средства «Бактериофаг Pneumococcus» с направленностью на отдельные серологические варианты актуальных клинических изолятов Streptococcus pneumoniae, циркулирующих на территории России, имеет высокую актуальность и соответствует основному направлению Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации⁶ в части перехода к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения, в том числе за счёт рационального применения лекарственных препаратов (прежде всего антибактериальных). Организация научных исследований в этой области знаний позволит выявить новые закономерности циркуляции актуальных серологических вариантов S. pneumoniae на отдельных территориях. Существенный вклад в изучение биологии возбудителя внесут созданные в ходе исследований уникальные коллекции штаммов S. pneumoniae и штаммов бактерий-продуцентов пневмококковых бактериофагов, а также сами полученные литические фаги S. pneumoniae направленного действия. Изучение их структурно-функциональной организации будет способствовать расширению теоретических основ микробиологии для дальнейшего создания новой группы перспективных лекарственных, диагностических и профилактических средств, что имеет важное народно-хозяйственное значение. Разработка инновационных лечебно-профилактических и диагностических препаратов на основе бактериофагов S. pneumoniae существенно снизит циркуляцию штаммов микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью и потребление антибиотиков, повысит качество лабораторной диагностики. Исключительно важное социальное значение обсуждаемая тема будет иметь для реабилитации пациентов от последствий постковидной пневмококковой инфекции, в целом окажет положительное влияние на снижение общего уровня заболеваемости и смертности населения от инфекционной патологии, сохранит здоровье и качество жизни, улучшит демографическую ситуацию в стране.

 

¹ Справочник MSD. Профессиональная версия. Пневмококковая инфекция. URL: https://www.msdmanuals.com/ru/профессиональный/инфекционные-болезни/грамположительные- кокки/пневмококковые-инфекции

² Распоряжение Правительства РФ от 30.03.2019 № 604-р «Об утверждении Плана мероприятий на 2019–2024 годы по реализации Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года. М.; 2019.

³ Национальная библиотека медицины. Стрептококковый фаг Dp-1, полный геном.

URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/HQ268735

⁴ Национальная библиотека медицины. Стрептококковый фаг Сp-1, полный геном.

URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/Z47794

⁵ Национальная библиотека медицины. Стрептококковый фаг SOCP, полный геном.

URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ617393

⁶ Утверждена Указом Президента Российской Федерации от 01.12.2016 № 642 «О Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации».

Об авторах

Юлия Александровна Захарова

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

Email: zakharova_ya@eniivi.ru
ORCID iD: 0000-0003-3416-0902

д.м.н., доц., рук. отдела эпидемиологии вирусных инфекций

Россия, Екатеринбург

Иван Александрович Иващенко

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

Email: zakharova_ya@eniivi.ru
ORCID iD: 0000-0002-3584-9528

старший лаборант лаб. респираторных вирусных инфекций отдела эпидемиологии вирусных инфекций

Россия, Екатеринбург

Екатерина Викторовна Болгарова

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: zakharova_ya@eniivi.ru
ORCID iD: 0000-0001-6140-2546

н.с. лаб. респираторных вирусных инфекций отдела эпидемиологии вирусных инфекций

Россия, Екатеринбург

Список литературы

Дополнительные файлы