Биологическая характеристика холодоадаптированных вариантов коронавируса SARS-CoV-2

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Вакцинопрофилактика является наиболее эффективным подходом к снижению заболеваемости и смертности от COVID-19. Для специфической профилактики новой коронавирусной инфекции широко применяются вакцины, основанные на вирусных векторах, самореплицирующихся РНК, рекомбинантных и нативных вирусных антигенах [1–5]. Эти платформы позволяют быстро разрабатывать вакцины, способные давать протективный иммунный ответ. Основными недостатками таких вакцин является относительно малая продолжительность иммунного ответа, неполный набор вирусных антигенов, быстрое появление ускользающих от поствакцинального иммунитета вирусов мутантов, высокая себестоимость производства. Несмотря на беспрецедентные противоэпидемические мероприятия и широкое применение вакцин против COVID-19, пандемическое распространение коронавируса SARS-CoV-2 продолжается даже в странах с широким охватом вакцинацией¹. Регулярно регистрируется появление новых штаммов SARSCoV-2, отличающихся повышенной эпидемиологической значимостью [6–8]. Так, c августа по ноябрь 2021 г. вариант вируса Delta B.1.617.2, пришедший на смену вариантам Alpha, Beta и Gamma, в общемировой структуре заболеваемости занимал не менее 95% [9]. Вариант Delta обладает повышенной контагиозностью и хуже нейтрализуется антисыворотками, полученными от реконвалесцентов COVID-19, вызванной другими вариантами вируса [10–12]. В начале ноября 2021 г. начал быстро распространяться по всему миру вариант SARS-CoV-2 Omicron B.1.1.529, который уже к февралю 2022 г. занял доминирующую позицию, составляя более 95% всех охарактеризованных секвенированием штаммов².

Вариант Omicron имеет несколько делеций в геноме и более 30 аминокислотных замен в S-белке, которые привели к повышению аффинности связывания вируса с ACE2-рецептором и, как следствие, повышенной контагиозности и способности ускользать от нейтрализующих антител [13–18]. Так, в работе J. Bowen и соавт. [14] выявлена пониженная нейтрализующая активность сывороток крови как переболевших людей, так и привитых различными вакцинами против COVID-19: mRNA-1273 («Moderna»), BNT162b2 («Pfizer/BioNTech»), COVID-19 Vaccine AstraZeneca («AstraZeneca»), «Спутник V» (НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), Novavax COVID-19 vaccine («Novavax»), BBIP-CorV («Sinopharm»), Ad26.COV2.S («Johnson&Johnson») по отношению к двум линиям Omicron — BA.1 и BA.2. Для варианта Omicron также отмечается снижение нейтрализующей активности сывороток людей, перенёсших инфекцию, вызванную другими вариантами вируса [15]. Нейтрализующая активность сывороток людей, привитых вакциной CoronaVac («Sinovac Biotech Ltd.»), была значительно снижена либо отсутствовала полностью в отношении варианта Omicron [13][16]. Моноклональные антитела, которые широко используются в терапии COVID-19, менее эффективны в отношении варианта Omicron [17][18].

Очевидно, что исследования в области создания вакцин, отличающихся высокой протективной активностью в отношении широкого спектра антигенных вариантов SARS-CoV-2, остаются актуальными. К числу вакцин, способных обеспечить формирование иммунного ответа как к структурным, так и неструктурным вирусным белкам и активацию не только гуморального, но и клеточного звена иммунитета, относятся живые вакцины. В многочисленных исследованиях доказано, что адаптация вирусов к росту при субоптимальной пониженной температуре приводит к появлению температурочувствительного (ts) фенотипа (снижение репликации при температуре 37ºС или выше), который ассоциирован с аттенуацией вирулентности для нормального хозяина [19]. При этом полученный холодоадаптированный (ca, cold-adapted) аттенуированный вирус при иммунизации обеспечивает безопасную и эффективную защиту от заражения вирусом дикого типа [19]. В связи с этим целью настоящего исследования являлись получение и биологическая характеристика ca-вариантов коронавируса SARS-CoV-2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирус и культура клеток. В работе использован лабораторный штамм SARS-CoV-2 Dubrovka (номер GenBank: MW514307.1) [20] и его варианты: Dubrovka-37, Dubrovka-ca, Dubrovka-ca-B4, Dubrovka-ca-D2 (номера GenBank: ON380441.1, ON040960.1, ON059701.1 и ON040961.1 соответственно). Культивирование вируса и экспериментальное заражение проводили на клетках эпителия почки африканской зелёной мартышки Vero CCL81 (ATСС) (далее — клетки Vero) и клетках рака лёгких человека Calu-3 HTB-55 (ATСС) (далее — клетки Calu-3). Клетки культивировали при 37ºС в питательной среде DМЕМ на основе буфера Эрла («ПанЭко») с добавлением 5% эмбриональной сыворотки коров («Gibco»), 300 мкг/мл L-глутамина («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина («ПанЭко») в атмосфере 5% СО₂. Трёхдневный монослой клеток Vero или Calu-3 заражали вирусом SARS-CoV-2 при желаемой множественности заражения (MOI). Адсорбцию вируса проводили в СО₂ -инкубаторе в течение 60 мин, затем добавляли поддерживающую среду (DМЕМ, 300 мкг/мл L-глутамина, 40 мкг/мл гентамицина) и инкубировали при 23–39ºС в течение 3–8 сут (в зависимости от варианта вируса и цели эксперимента) в атмосфере 5% СО₂. Для исследования кинетики репродукции вируса культуральную жидкость ежедневно отбирали в течение 4–8 сут и хранили при 80ºС до момента исследования методом титрования или количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ).

Животные. В работе использовали 36 золотистых сирийских хомяков-самок массой 40–50 г (НПП «Питомник лабораторных животных» ИБХ РАН). Животные были случайным образом распределены по 4 группам (n = 9), в том числе три группы для заражения вариантами SARS-CoV-2 и контрольная группа незаражённых животных. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, 23.07.2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом НИИВС им. И.И. Мечникова (протокол № 2 от 24.05.2021).

Титрование вируса. Титр вируса SARS-CoV-2 определяли по конечной точке проявления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток Vero. В лунки 96-луночного планшета вносили последовательные десятикратные разведения вируса в поддерживающей среде и инкубировали в течение 5 сут в атмосфере 5% СО₂ при 37ºС (ca-варианты — при 30ºС). Учёт результатов титрования проводили визуально путём микроскопического исследования клеточного монослоя на наличие характерного ЦПД на 5-е сутки после заражения (округление и частичное открепление клеток от монослоя). Титр вируса рассчитывали по M. Ramakrishnan [21] и выражали в lg ТЦД₅₀/мл.

Количественное определение РНК вируса SARS-CoV-2. Выделение вирусной РНК проводили двумя методами: коммерческим набором реагентов для экстракции ДНК/РНК из биологического материала «МагноПрайм ЮНИ» («НекстБио») в соответствии с инструкцией производителя либо с помощью реагента Triton X-100. Для выделения вирусной РНК с помощью реагента Triton X-100 к 100 мкл вируссодержащей культуральной жидкости добавляли 10 мкл 4,5% раствора Triton X-100, полученную смесь перемешивали и замораживали. После размораживания образец перемешивали, разбавляли водой без РНКаз в 10 раз и незамедлительно использовали в реакции ОТ-ПЦР-РВ (при расчёте концентрации вирусной РНК применяли поправочный коэффициент 10).

Для выявления вирусной РНК в реакции ОТПЦР-РВ были использованы праймеры и зонд к гену нуклеокапсида N вируса SARS-CoV-2: COVID-19- N-F, COVID-19-N-R, COVID-19-N-P (таблица) [22]. Для постановки реакции ОТ-ПЦР-РВ использовали набор реагентов «2,5× реакционная смесь для ПЦРРВ с Taq ДНК-полимеразой» и обратную транскриптазу MMLV («Синтол»). Реакционная смесь объёмом 25 мкл содержала по 10 пмоль каждого праймера и 5 пмоль зонда, Taq ДНК-полимеразу, 30 ед. обратной транскриптазы. Температурно-временной режим: 45ºС — 10 мин (1 цикл); 95ºС — 5 мин (1 цикл); 95ºС — 5 с, 55ºС — 45 с (45 циклов). Реакцию проводили в амплификаторе «DTprime» («ДНК-технология»). Все праймеры и зонды синтезированы в «Синтол». Для построения калибровочного графика использовали образцы, полученные в результате последовательных десятикратных разведений синтетического олигонуклеотида COVN-PC (таблица) с известной концентрацией.

 

Последовательности праймеров, зонда и олигонуклеотида, использованных в работе

Sequences of primers, probe, and oligonucleotide used in the tests

Название Name	Последовательность 5’-3’ Sequence 5’-3’	Назначение Application	Источник Source
COVID-19-N-F	GCGTTCTTCGGAATGTCG	Прямой праймер Forward primer	[22]
COVID-19-N-R	TTGGATCTTTGTCATCCAATTTG	Обратный праймер Reverse primer
COVID-19-N-P	FAM-AACGTGGTTGACCTACACAGGT-BHQ1	Зонд Probe
COVN-PC	GCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAA CGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAA	Калибровочный образец Calibration sample	Собственный дизайн In-house design

 

Секвенирование генома коронавирусов. Для получения пула ампликонов для последующего полногеномного секвенирования использовали набор NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 для подготовки библиотек (Oxford Nanopore Technologies) («New England Biolabs»). Данный набор разработан для проведения полногеномного секвенирования SARS-CoV-2 на основе протокола «SARS-CoV-2 McGill Nanopore sequencing protocol SuperScript IV_42C_ArticV3» [23]. Для подготовки полученного пула использовали наборы Ligation Sequencing kit 1D и Native Barcoding Kit 1D («Oxford Nanopore Technologies»). Секвенирование проводили в проточной ячейке Flow Cell R9.4 с использованием программного обеспечения «MinKNOW» («Oxford Nanopore Technologies»). Сборку генома осуществляли в программе «Minimap2 v. 2.24»³.

Инактивация вируса SARS-CoV-2 ультрафиолетом (УФ). Культуральную жидкость из флаконов с клетками Vero собирали через 72 ч после заражения вирусом, осветляли центрифугированием при 4000 об/мин и титровали. Инактивацию вируса проводили путём обработки ультрафиолетовым светом (λ = 253,7 нм) бактерицидного облучателя «TUV 30W/G30 T8» («Philips»). Чашку Петри диаметром 150 мм с вирусным материалом объёмом 50 мл помещали под лампу на расстоянии 30 см и облучали в течение 4 мин с трёхкратным перемешиванием жидкости через равные промежутки времени. Контроль инактивации вируса проводили путём 3 «слепых» пассажей облучённого вирусного материала на культуре клеток Verо, проводя мониторинг ЦПД и концентрации вирусной РНК на каждом пассажном уровне.

Оценка антигенных свойств SARS-CoV-2, инактивированного УФ. Разведения SARS-CoV-2, инактивированного УФ, анализировали в реакции иммунохроматографии с помощью набора реагентов «SARS-CoV-2 Rapid Antigen Test» («SD Biosensor Inc.») согласно инструкции по применению.

Оценка ts-фенотипа ca-вариантов SARSCoV-2. Клетки Vero заражали ca-вариантами SARSCoV-2 и штаммом Dubrovka при MOI 0,001 и 0,00001 и инкубировали при 37ºС и 39ºС в атмосфере 5% СО₂ в течение 3 сут. Ежедневно отбирали образец культуральной жидкости и хранили при –80ºС до исследования. В отобранных образцах определяли титр вируса и концентрацию вирусной РНК. Разница в титре вируса или концентрации вирусной РНК по сравнению с заражением штаммом Dubrovka на 4,0 lg и более свидетельствовала о наличии у вируса ts-фенотипа.

Оценка аттенуационного (att) фенотипа ca-вариантов SARS-CoV-2. Сирийских хомяков заражали интраназально штаммом Dubrovka и ca-вариантами вируса в дозе 4,0 lg ТЦД₅₀ (n = 9 в каждой группе). Ежедневно оценивали состояние животных и каждые 2 сут проводили контроль массы тела. Через 4 сут после заражения по 4 хомяка из каждой группы гуманно умерщвляли, лёгкие и мозг извлекали, гомогенизировали и хранили при –80ºС до исследования. У остальных животных продолжали контролировать состояние и массу тела до 8 сут после заражения. В гомогенатах органов определяли титр вируса и концентрацию вирусной РНК. Достоверная разница в массе тела титре вируса или концентрации вирусной РНК в лёгких и мозге по сравнению с заражением штаммом Dubrovka свидетельствовала о наличии у вируса att-фенотипа.

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Образцы инактивированного УФ вирусного материала были нанесены на сетки для ТЭМ с углеродной подложкой («Ted Pella Carbon Type B», 300 mesh) и негативно контрастированы 1% уранилацетатом. Изображения TЭM были получены с помощью электронного микроскопа «JEM-2100» («Jeol») 200 кВ, оснащённого камерой «Gatan Orius SC200D» (2k × 2k).

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения «Graphpad Prism v.5.03». Достоверность разницы определяли согласно U-критерию Манна–Уитни с 95% доверительным интервалом.

Требования к безопасности работ. Все работы с вирусом SARS-CoV-2 проводили в соответствии с требованиями СанПиН 3.3686-21 в условиях лаборатории 3-го уровня биобезопасности.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ПОЛУЧЕНИЕ ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ SARS-COV-2

В работе использован лабораторный штамм SARS-CoV-2 Dubrovka, ранее охарактеризованный в НИИВС им. И.И. Мечникова. Штамм Dubrovka был получен летом 2020 г. путём изоляции в культуре клеток Vero из клинического образца пациента с подтверждённым диагнозом COVID-19. Идентификацию вируса проводили методами ОТПЦР-РВ, реакции нейтрализации с сыворотками реконвалесцентов COVID-19 и полногеномного секвенирования (номер GenBank MW514307.1), показавших принадлежность изолята к виду Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus (вирус SARS-CoV-2, клада GR по классификации GISAID, линия B.1.1.317 по классификации Pangolin) [20]. Особенностью штамма Dubrovka является 27 нт делеция в гене S (9 аминокислот с 68 по 76 а.о. — YMSLGPMVL) по сравнению с геном S штамма Wuhan-Hu-1 (номер GenBank NC_045512.2) [20]. Все варианты штамма Dubrovka, полученные в настоящем исследовании, сохраняли эту делецию.

С целью изучения адаптационных способностей SARS-CoV-2 проведено длительное пассирование штамма Dubrovka в культуре клеток Vero при постоянной температуре 37ºС или постепенно понижаемой до 23ºС температуре в течение 42 пассажей. Полученные варианты вируса были названы Dubrovka-37 и Dubrovka-са (cold-adapted) соответственно (рис. 1). Получение варианта Dubrovka-са проводили по следующей схеме: 10 пассажей при 37ºС, далее температуру культивирования понижали на 1ºС через каждые 2 пассажа, заключительные 6 пассажей проводили при 23ºС (всего 42 пассажа). Далее путём трёхкратного клонирования методом предельных разведений при 23ºС на основе варианта Dubrovka-са были получены два клона — B4 и D2 (далее — варианты Dubrovka-са-B4 и Dubrovkaса-D2).

 

Рис. 1. Схема адаптации SARS-СoV-2 к культуре клетокVero и выращиванию при пониженной температуре.

 

Для вариантов штамма Dubrovka: Dubrovka-37, Dubrovka-са, Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 были определены полногеномные последовательности (номера GenBank ON380441.1, ON040960.1, ON059701.1 и ON040961.1 соответственно). Первичный анализ геномов разных вариантов штамма Dubrovka выявил много нуклеотидных замен, большинство из которых были несинонимичными (приводили к аминокислотной замене). В геноме варианта Dubrovka-37 в результате длительной адаптации к культуре клеток Vero при 37ºС произошло 7 нуклеотидных замен, из которых 5 были несинонимичными. В геноме варианта Dubrovka-ca в результате холодовой адаптации в культуре клеток Vero произошло 17 нуклеотидных замен, из которых 16 замен были несинонимичными. Вместе с тем в геномах клонов ca-вариантов: Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 обнаружены 16 и 20 нуклеотидных замен, которые привели к 14 и 17 аминокислотным заменам соответственно. В гене S локализовано наибольшее число несинонимичных замен: 2 — в геноме Dubrovka-37, 5 — Dubrovka-ca, 6 — Dubrovka-са-B4, 7 — Dubrovka-са-D2. Примечательно, что в геноме варианта Dubrovka-са-D2, обладающего ts-фенотипом, из 20 нуклеотидных замен 11 являются уникальными по отношению к Dubrovka-37, Dubrovka-са и Dubrovka-са-B4; из них 9 приводят к аминокислотным заменам.

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВАРИАНТОВ SARS-COV-2

При пассировании в культуре клеток Vero при 37ºС титр вируса возрастал (от 4,3 lg ТЦД₅₀/мл на 2-м пассаже до 9,0 lg ТЦД₅₀/мл на 30-м пассаже), а ЦПД становилось все более выраженным. Если при заражении вирусом 2-го пассажа выживаемость клеток Vero на 5-е сутки после инфицирования составляла 92%, то уже к 14-му пассажу достигала минимального уровня (2–4%) [20]. Сроки проявления ЦПД в процессе холодовой адаптации изменялись с 2–3 сут при 37ºС до 5–7 сут после инфицирования при 23ºС. При заражении вариантом Dubrovka-са ЦПД проявлялось в нарушении целостности монослоя, появлении скоплений округлённых клеток без открепления клеток от поверхности флакона (рис. 2).

 

Рис. 2. Цитопатогенное действие штамма Dubrovka-са в культуре клеток Vero при 23ºС (7-е сутки после инфицирования). а — незаражённые клетки; б — Dubrovka-са. MOI 0,001.

 

Вариант Dubrovka-са при 23ºС размножался значительно медленнее, чем родительский штамм Dubrovka при оптимальной для него температуре 37ºС. В связи с этим клетки заражали большей дозой варианта Dubrovka-са и проводили более длительную инкубацию. Если пик репродукции штамма Dubrovka (17 пассаж) при 37ºС (MOI 0,00001) приходился на 2-е сутки, достигая 9,0 lg ТЦД₅₀/мл, то для варианта Dubrovka-са при 23ºС (MOI 0,001) — на 7-е сутки, достигая 8,0 lg ТЦД₅₀/мл (рис. 3). Репродукция вируса сопровождалась накоплением в культуральной жидкости вирусной РНК (рис. 3).

 

Рис. 3. Кинетика репродукции вируса и накопления вирусной РНК штамма Dubrovka (при 37⁰С) и варианта Dubrovka-са (при 23⁰С) в культуре клеток Verо.Приведены средние значения по результатам 2 независимых экспериментов. Заражение штаммом Dubrovka проводили при MOI 0,00001, вариантом Dubrovka-са — при MOI 0,001.

 

Вариант Dubrovka-37 при 23ºС не размножался в культуре клеток Vero, тогда как варианты Dubrovka-са, Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 на 7-е сутки достигали титра 4,5–8,0 ТЦД₅₀/мл в зависимости от MOI.

Методом иммунохроматографии во всех инактивированных УФ препаратах вируса — Dubrovka, Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 — был выявлен антиген SARS-CoV-2. Методом ТЭМ в этих же препаратах обнаружены вирусоподобные частицы с морфодиагностическими признаками коронавируса: вирионы имели округлую форму с характерными шипами 12–15 нм на оболочке (тримеры S-белка) (рис. 4). Диаметр вириона составлял 90–110 нм. Форма и размер полученных вирусоподобных частиц хорошо согласуются с полученными ранее микрофотографиями вируса SARS-CoV-2 [5][24].

 

Рис. 4. Электронная микрофотография инактивированных УФ вариантов SARS-CoV-2. а — Dubrovka; б — Dubrovka-са-B4; в — Dubrovka-са-D2. ТЭМ. Негативное контрастирование 1% уранилацетатом.Стрелками отмечены тримеры S-белка на поверхности коронавируса. Масштабный отрезок — 100 нм.

 

Полученные клоны варианта Dubrovka-са были исследованы на наличие температурочувствительного (ts) фенотипа, который заключается в неспособности вируса эффективно размножаться при 37ºС или 39ºС. Интенсивность репродукции клонов Dubrovkaса-B4 и Dubrovka-са-D2 (MOI 0,001) при температуре культивирования 37ºС клеток Vero была высокой и достоверно не отличалась от штамма Dubrovka (рис. 5). При температуре культивирования 39ºС вариант Dubrovka-са-D2 не размножался (рис. 6), а концентрация вирусной РНК в культуральной жидкости была снижена на 4,0–6,0 lg по сравнению со штаммом Dubrovka и вариантом Dubrovka-са-B4 (рис. 5). Таким образом, установлено, что вариант Dubrovkaса-D2 обладает выраженным ts-фенотипом. У варианта Dubrovka-са-B4 также выявлены признаки ts-фенотипа, но только при низкой MOI (0,00001) и температуре 39ºС — на 3-и сутки разница в титре вируса со штаммом Dubrovka составляла 3,0 lg (рис. 6).

 

Рис. 5. Накопление вирусной РНК в культуре клеток Vero при заражении штаммом Dubrovka и вариантами Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 при температуре культивирования 37ºС или 39ºС.Клетки заражали при MOI = 0,001, ежедневно отбирали образец культуральной жидкости и определяли концентрацию вирусной РНК. Приведены средние значения по результатам 2 независимых экспериментов.

 

Рис. 6. Титр вируса на 3-и сутки после инфицирования культуры клеток Vero штаммом Dubrovka и вариантами Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 при температуре культивирования 39ºС и разной MOI.Клетки заражали вариантами вируса и через 72 ч определяли титр вируса в культуральной жидкости. Приведены средние значения по результатам 2 независимых экспериментов. n/d — не обнаружено.

 

Варианты Dubrovka-37, Dubrovka-са-B4, адаптированные на протяжении более 40 пассажей к культуре клеток почки обезьяны Vero, утратили способность размножаться в культуре клеток рака лёгких человека Calu-3. Вариант Dubrovka-са-D2 в клетках Calu-3 размножался, но значительно медленнее штамма Dubrovka (рис. 7).

 

Рис. 7. Концентрация вирусной РНК в клетках Calu-3, заражённых вариантами SARS-CoV-2, на 3-и сутки после инфицирования при MOI 0,001.1 — штамм Dubrovka (2-й пассаж); 2 — Dubrovka-са-B4; 3 — Dubrovka-ca-D2; 4 — Dubrovka-37. Приведены средние значения по результатам 2 независимых экспериментов.

 

С целью выявления аттенуационного (att) фенотипа ca-вариантов SARS-CoV-2 был проведён эксперимент по интраназальному заражению хомяков. У хомяков, заражённых ca-вариантами вируса SARS-CoV-2, не наблюдались задержка прироста массы тела и изменения в поведении по сравнению с отрицательным контролем. Напротив, при заражении вирулентным вирусом (штамм Dubrovka) отмечалась достоверная задержка в приросте массы тела, составившая на 2-е сутки после заражения 8,2%, на 4-е — 13,4%, на 6-е — 10,5% (p < 0,05), тогда как на 8-е сутки разница была недостоверной (рис. 8). У животных, зараженных вирулентным штаммом, на 2–6-е сутки также наблюдались снижение аппетита, вялость и сонливость.

 

Рис. 8. Кинетика массы тела хомяков, заражённых интраназально штаммом Dubrovka и вариантами Dubrovkaса-B₄ и Dubrovka-са-D2.С 0-х по 4-е сутки — n = 9 на группу, с 6-х по 8-е сутки — n = 5 на группу. Доза заражения — 4,0 lg ТЦД₅₀. К– — незараженные хомяки.

 

В лёгких и мозге животных на 4-е сутки после заражения ca-вариантами вируса концентрация вирусной РНК была достоверно более низкой по сравнению с контрольной группой, заражённой вирулентным штаммом Dubrovka (рис. 9). Наименьшая концентрация вирусной РНК в органах наблюдалась при заражении вариантом Dubrovka-са-D2: в лёгких — 6,5 lg копий РНК/мл, в мозге — 3,3 lg копий РНК/мл, что на 1,6 и 3,2 lg соответственно ниже, чем в контрольной группе (p < 0,05).

 

Рис. 9. Концентрация вирусной РНК в гомогенатах лёгких и мозга хомяков, заражённых интраназально штаммом Dubrovka и вариантами Dubrovka-са-B4 и Dubrovkaса-D2, на 4-е сутки после инфицирования.n = 4 на группу. К– — незаражённые хомяки.

 

Титр вируса в гомогенатах лёгких животных на 4-е сутки после заражения ca-вариантами вируса составлял 5,0 lg ТЦД₅₀/мл, что на 1,2 lg ниже, чем в контрольной группе (p < 0,05) (рис. 10). Инфекционный вирус в мозге на 4-е сутки после заражения ca-вариантами при титровании не обнаруживался, тогда как при заражении штаммом Dubrovka титр вируса в гомогенате мозга достигал 5,0 lg ТЦД₅₀/мл (рис. 10). Важно отметить, что при титровании вируса гомогенаты органов в разведениях 1 : 10 и 1 : 100 были токсичными для клеток, что затрудняло учёт вирусного ЦПД и снижало чувствительность титрования.

 

Рис. 10. Титр вируса в гомогенатах лёгких и мозга хомяков, заражённых интраназально штаммом Dubrovka и вариантами Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2, на 4-е сутки после инфицирования.n = 4 на группу. К– — незаражённые хомяки.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Массовое применение живых вирусных вакцин, входящих в национальные календари иммунизации, позволило ликвидировать в глобальном масштабе натуральную оспу и поставить в развитых странах на грань исчезновения такие заболевания, как корь, краснуха, ветряная оспа, эпидемический паротит и полиомиелит [25]. Штаммы вирусов, входящие в состав большинства живых вирусных вакцин, были получены при аттенуации диких вариантов соответствующих вирусов путём адаптации к выращиванию в условиях пониженной температуры и/или в клетках животных [25][26].

В многочисленных исследованиях доказано, что вирусы человека и животных могут быть адаптированы к росту при субоптимальной пониженной температуре [19]. Почти во всех случаях наблюдалась корреляция между приобретением этими вирусами температурной чувствительности в культуре ткани и аттенуацией у нормального хозяина — животного или человека [19]. Экспериментально доказано, что путём холодовой адаптации возможно получение аттенуированного вируса, который при иммунизации обеспечивает безопасную и эффективную защиту от заражения вирусом дикого типа [19]. Разработанные в СССР и США сезонные живые аттенуированные интраназальные гриппозные вакцины [27–29] выгодно отличаются от инактивированных вакцин тем, что индуцируют системный, мукозальный и клеточный иммунитет, обеспечивают широкую перекрёстную протективную активность и простоту введения. Применение живых вирусных вакцин обосновано не только их высокой иммунологической эффективностью, но и экономической целесообразностью, поскольку отличаются низкой себестоимостью производства [25].

В то же время, по данным ВОЗ на 13.05.2022, из 153 лицензированных и проходящих клинические испытания вакцин против COVID-19 только 2 (1,3%) вакцины созданы на основе живых аттенуированных штаммов: COVI-VAC (Codagenix/Serum Institute of India, Индия), MV-014-212 («Meissa Vaccines, Inc.», США)⁴. Обе вакцины являются интраназальными. Аттенуация использованных в этих вакцинах штаммов достигалась с применением технологии деоптимизации кодонов.

В нашем исследовании показана возможность адаптации SARS-CoV-2 к выращиванию при непермиссивной для дикого вируса температуре 23ºС и получения ts-мутантов. Полученные са-варианты вируса Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 имели значительные геномные отличия по сравнению с родоначальным штаммом Dubrovka, эффективно размножались при 23ºС, но только вариант Dubrovka-са-D2 имел ts-фенотип, т.е. не размножался при 39ºС. Более того, адаптированные к культуре клеток почки обезьяны Vero клоны Dubrovka-са-D2 и Dubrovka-са-B4 достоверно медленнее дикого штамма размножались при 37ºС в культуре клеток лёгких человека Calu-3, что наряду с ts-фенотипом может быть маркером аттенуации вируса по отношению к человеку. В связи с этим у нас были основания предполагать, что как обладающий ts-фенотипом клон Dubrovka-са-D2, так и клон Dubrovkaса-B4, не обладающий ts фенотипом, имеют пониженную вирулентность, т.е. аттенуированы.

На животной модели COVID-19 в эксперименте на сирийских хомяках предположение об аттенуации ca-вариантов штамма Dubrovka нашло убедительное подтверждение. Заражение хомяков вариантами Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 не вызывало у них при интраназальном заражении снижения аппетита, вялости, сонливости и замедления прироста массы, в отличие от вирулентного штамма Dubrovka. В лёгких и головном мозге животных, заражённых ca-вариантами, концентрация вирусной РНК и содержание инфекционного вируса были ниже на 1,2–3,3 lg по сравнению с вирулентным штаммом, причём наименьшая репродуктивная активность в условиях in vivo отмечалась у ts+ клона Dubrovka-са-D2. Примечательно, что в мозге хомяков, заражённых са-вариантами, инфекционный вирус выявлен не был, тогда как при заражении вирулентным штаммом Dubrovka титр вируса достигал 5,0 lg ТЦД₅₀/мл гомогената. С учетом известной нейровирулентности SARS-CoV-2 для человека, снижение репродуктивной активности ca-вариантов вируса в головном мозге хомяков при интраназальном введении уменьшает вероятность неврологических повреждений in vivo и является важным маркером аттенуации вируса. Таким образом, полученные са-варианты Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 обладают выраженным att-фенотипом для сирийских хомяков и представляют интерес для дальнейшего исследования в качестве кандидатных вакцинных штаммов для создания живой аттенуированной вакцины против COVID-19.

Важно отметить, что аттенуационный фенотип са-вариантов вируса был получен для сирийских хомяков и требует дальнейшего исследования на других моделях. Данные по вирулентности вируса, полученные на животных моделях, невозможно безоговорочно экстраполировать на человека. Доклинические испытания на модельных животных позволяют лишь приблизиться к пониманию безопасности клинического применения и восприимчивости человека по отношению к аттенуированному штамму вируса. Кроме того, серьёзным фактором риска применения живой аттенуированной вакцины является возможность реверсии вирулентности вакцинного штамма в результате точечных мутаций либо рекомбинаций. В связи с этим необходимы дальнейшие исследования генетической стабильности са-вариантов SARS-CoV-2 и связанной с ней стабильности att-фенотипа.

В научной литературе описано получение ca-штаммов SARS-CoV-2, обладающих ts-фенотипом, которые не только имели att-фенотип, но и при интраназальном введении были способны индуцировать у иммунизированных животных (сирийских хомяков или трансгенных мышей hACE-2 (K18-hACE2) протективный иммунный ответ против заражения вирулентным штаммом SARS-CoV-2 [30–32]. Для получения ts+-штаммов SARS-CoV-2 в указанных работах применяли различные подходы. В работе S. Seo и соавт. [30] применялся схожий с нашим исследованием подход — длительное пассирование при постепенном снижении температуры от 37ºC до 22ºC в клетках Vero. В работе S. Okamura и соавт. на основе клинического изолята SARS-CoV-2 была получена большая библиотека из 659 клонов со случайными мутациями, из которых были отобраны варианты, вызывавшие ЦПД в культуре клеток при 32ºC, но не при 37ºC [32]. Аттенуация вируса при получении вакцинного штамма должна выдерживать баланс между ослаблением вирулентности и сохранением способности вызывать протективный иммунный ответ. В работах S. Seo и соавт. и S. Okamura и соавт. экспериментально доказана возможность сохранения протективной активности у аттенуированных ts-мутантов SARS-CoV-2 [30][32]. В связи с этим дальнейшее исследование протективной активности полученных в настоящей работе вариантов Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 на животной модели COVID-19 представляет большой практический интерес.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в настоящей работе аттенуированные са-варианты SARS-CoV-2 Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 представляют интерес для дальнейшего исследования в качестве кандидатных вакцинных штаммов для создания живой аттенуированной вакцины против COVID-19.

 

1. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. URL: https://covid19.who.int (дата обращения: 13.05.2022).

2. The GISAID Initiative. URL: https://www.gisaid.org (дата обращения: 13.05.2022).

3. URL: https://github.com/lh3/minimap2

4. R&D Blue Print. World Health Organization. COVID-19 vaccine tracker and landscape. URL: https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines (дата обращения: 13.05.2022).

Об авторах

Евгений Бахтиёрович Файзулоев

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7385-5083

к.б.н., зав. лаб. молекулярной вирусологии

Россия, Москва

Екатерина Романовна Корчевая

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6417-3301

м.н.с., лаб. молекулярной вирусологии

Россия, Москва

Анастасия Вячеславовна Грачева

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8428-4482

м.н.с., лаб. молекулярной вирусологии

Россия, Москва

Роман Владимирович Самойликов

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6405-1390

м.н.с., лаб. молекулярной иммунологии

Россия, Москва

Дарья Ильинична Смирнова

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7325-0834

м.н.с., лаб. молекулярной вирусологии

Россия, Москва

Ольга Сергеевна Соколова

Московский государственный университет имени Ломоносова

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4678-232X

д.б.н., профессор кафедры биоинженерии биологического факультета

Россия, Москва

Григорий Сергеевич Глухов

Московский государственный университет имени Ломоносова

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9540-8249

к.б.н., доцент кафедры биоинженерии биологического факультета

Россия, Москва

Андрей Владимирович Моисеенко

Московский государственный университет имени Ломоносова

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1112-2356

ведущий инженер лаб. электронной микроскопии биологического факультета

Россия, Москва

Ирина Анатольевна Ленева

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7755-2714

д.б.н., зав. лаб. экспериментальной вирусологии

Россия, Москва

Фирая Галиевна Нагиева

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8204-4899

д.м.н., доцент, зав. лаб. гибридных клеточных культур отдела вирусологии

Россия, Москва

Оксана Анатольевна Свитич

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова; Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389

д.м.н., проф., член-корр. РАН, зав. лаб. молекулярной иммунологии, директор

Россия, Москва; Москва

Виталий Васильевич Зверев

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова; Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский
Университет)

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5808-2246

д.б.н., профессор, академик РАН, научный руководитель

Россия, Москва; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы