Безопасность и иммуногенность препарата живой коклюшной вакцины ГамЖВК интраназального применения на экспериментальной модели детёнышей обезьян вида павиан гамадрил

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Коклюш — высококонтагиозное инфекционное заболевание, передающееся воздушно-капельным путём и вызываемое бактериями Bordetella pertussis. Несмотря на успехи вакцинопрофилактики, коклюш продолжает оставаться серьёзной проблемой здравоохранения во всём мире. Разработка и внедрение в практику здравоохранения во второй половине ХХ в. цельноклеточных коклюшных вакцин (ЦКВ) снизили заболеваемость до единичных случаев на 100 тыс. населения. Эпидемиологический эффект от вакцинации позволил отнести коклюш к категории управляемых инфекций и сформировать общепринятое мнение, что это заболевание находится под сдерживающим контролем прививок. В то же время, наряду со снижением заболеваемости коклюшем, многолетняя массовая иммунизация ЦКВ выявила нежелательные побочные реакции и поствакцинальные осложнения. В ряде стран в 1990-х гг. инициировали отмену вакцинации против коклюша, следствием чего стало резкое увеличение заболеваемости, в том числе в тяжёлых формах со смертельным исходом. В экономически развитых странах ЦКВ были заменены на менее реактогенные бесклеточные коклюшные вакцины (БКВ) [1].

Тем не менее заболеваемость коклюшем неуклонно растёт и за последние 20 лет увеличилась почти в 10 раз [1]. Ежегодно регистрируется около 1 млн смертельных случаев, связанных с коклюшем — шестой инфекцией по частоте детской смертности. Наблюдается подъём заболеваемости коклюшем и в странах с высоким уровнем охвата прививками декретированного населения, в том числе в экономически развитых странах [1]. В России наблюдается рост заболеваемости коклюшем с локальными вспышками и формированием очагов разной интенсивности в школьных коллективах. По данным Роспотребнадзора, в 2019 г. число заболевших коклюшем увеличилось почти на 40%¹, и стало в 2,7 раза больше в сравнении с 2018 г.

Поствакцинальный иммунитет, индуцированный современными ЦКВ и БКВ, оказался недостаточно продолжительным, что способствует, по-видимому, росту числа восприимчивых к возбудителю коклюша подростков и взрослых. Увеличивающиеся случаи атипичных форм течения заболевания затрудняют диагностику коклюша. Взрослые являются резервуаром бактерий B. pertussis для младенцев и детей старшего возраста, а дети — для взрослых. Наличие неконтролируемого источника коклюшной инфекции, особенно в семьях с новорождёнными и в детских организованных коллективах, диктует необходимость проведения максимально ранней иммунизации и ревакцинации всех возрастных групп населения. Однако в настоящее время вакцинацию против коклюша БКВ или ЦКВ начинают не ранее 2–3-месячного возраста. Иммунизация включает три внутримышечные инъекции с интервалом 1,5 мес и ревакцинацию в 18 мес. Современные вакцины не рекомендуют для новорождённых и детей первых 2 месяцев жизни — наиболее уязвимого возраста для коклюшной инфекции и развития тяжёлых форм заболевания.

В настоящее время увеличивается доля циркулирующих бактерий B. pertussis с мутациями в генах, ответственных за синтез протективных антигенов, кодирующих белки, входящие в состав БКВ. Для ревакцинации подростков и взрослых используют только аАКДС (АКДС с бесклеточным коклюшным компонентом). Однако последние исследования выявили бoльшую эффективность бустерной вакцинации в случае праймирования иммунитета у детей 1-го года жизни АКДС, содержащей ЦКВ, в сравнении с БКВ. Тем не менее в обоих случаях антитела сохранялись не более 1–3 лет, а ревакцинация не обеспечивала противобактерийной защиты. Согласно современным представлениям, для эрадикации возбудителя коклюша необходим не только, а скорее всего, не столько гуморальный иммунный ответ, но клеточный ответ, опосредованный Т-хелперами Th1 и Th17 [1]. В прямых экспериментах на приматах показано, что защита от вирулентных бактерий B. pertussis формируется после перенесённой коклюшной инфекции, в меньшей степени от иммунизации ЦКВ, после инъекционной вакцинации обезьян БКВ противобактерийный иммунитет не обнаруживали [2][3].

Альтернативой ЦКВ и БКВ в настоящее время является разработанный в НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи препарат ГамЖВК (живая вакцина интраназального применения для профилактики коклюша для интраназального применения на основе рекомбинантных аттенуированных бактерий возбудителя коклюша [4]. Подобная рекомбинантная живая коклюшная вакцина разработана и во Франции [5]. Обе живые рекомбинантные коклюшные вакцины находятся в настоящее время на разных стадиях клинических испытаний на взрослых добровольцах. По завершении клинических исследований и получения разрешительных документов препарат ГамЖВК предполагается использовать для ревакцинации подростков и взрослых. Однако в условиях роста заболеваемости коклюшем требуются более интенсивные исследования, направленные на скорейшее внедрение безопасной, удобной для применения интраназальной вакцины, обеспечивающей противобактерийный иммунитет, в практику вакцинации наиболее уязвимой категории — новорождённых и младенцев первых месяцев жизни. В связи с этим, учитывая требования, предъявляемые к препаратам, применяемым для лечения и профилактики заболеваний детей раннего возраста и решения вопроса о проведении клинических исследований препарата ГамЖВК для детей младшего возраста, необходимо проведение доклинических исследований на экспериментальных моделях младенцев лабораторных животных.

Безопасность препарата ГамЖВК была продемонстрирована нами в экспериментах с сосунками мышей и крыс [6]. Второй признанной экспериментальной моделью, наиболее адекватной человеку, являются приматы [7][8]. Поскольку нами разработана экспериментальная модель коклюшной инфекции на обезьянах вида макак резус (Macaca mulatta) и павиан гамадрил (Papio hamadryas) и получены доказательства безопасности, иммуногенности и противобактерийной активности препарата ГамЖВК при использовании половозрелых особей [8–10], представляется возможным и целесообразным провести доклинические исследования препарата ГамЖВК на младенцах обезьян.

Цель исследования: изучение безопасности и иммуногенности препарата ГамЖВК при интраназальном 1-, 2- и 3-кратном введении детёнышам обезьян вида P. hamadryas.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использовали 3 здоровых детёнышей обезьян P. hamadryas в возрасте 5–7 нед, рождённых здоровыми матерями. Номера животных: 32295, 32322, 32317. Детёныши были рождены и содержались вместе с матерями в питомнике НИИЭПиТ (г. Сухум). В сыворотках крови матерей и детёнышей специфических коклюшных антител не зарегистрировано. В ротоносоглотке ДНК B. pertussis не выявлено. Перед отбором животных в исследование по теме 1.8. «Оценка безопасности и иммуногенности препарата живой коклюшной вакцины ГамЖВК интраназального применения на экспериментальной модели младенцев павианов гамадрилов» было получено одобрение приматологической комиссии (Протокол № 4 от 12.02.2018), а проведение эксперимента, исходя из утверждённого плана работы, с соблюдением норм и стандартов по использованию лабораторных животных, было одобрено этическим комитетом НИИЭПиТ (Протокол № 3 от 16.02.2018). В ходе эксперимента ни одна обезьяна не пострадала.

За состоянием здоровья экспериментальных обезьян наблюдали при ветеринарном осмотре. Обследование матерей и детёнышей включало клинический анализ крови, анализ сыворотки крови на наличие антител к бактериям B. pertussis, физикальный осмотр ротоглотки и взвешивание; взятие мазков из зева и носоглотки для анализа; взвешивание детёнышей, их осмотр ветеринарным врачом, определение общего соматического здоровья, состояния ротоглотки, поведения и реакций на внешние факторы. Экспериментальную работу с животными проводили в соответствии с ГОСТ 33218-2014 РФ и правилами работы с лабораторными животными [12].

Иммунизацию, взятие крови и назофарингеальных мазков у детёнышей проводили без наркоза. Матерей вводили в медикаментозный сон внутримышечным введением 0,03–0,04 мл золетила («Virbac») в концентрации 100 мг/мл (с премедикацией ксилазингидрохлоридом, 20 мг/мл).

Непосредственно перед интраназальным введением во флакон с препаратом ГамЖВК добавляли 0,70 мл стерильного 0,85% раствора NaCl. Лиофилизат растворялся в течение 1 мин, флакон слегка встряхивали и вводили суспензию интраназально по 0,3 мл в каждую ноздрю через шприц объёмом 2 мл с распыляющей насадкой («Shenzhen Bona Pharma Technology»).

Детёнышей фиксировали вручную, в положении лёжа на спине и удерживали до полного поступления жидкости в носовые полости. Матерям вирулентные бактерии вводили с использованием наркоза и прижимных клеток [8].

Кровь для анализа у детёнышей брали из паховой вены. Назофарингеальные мазки и ротоглоточные аспираты забирали с помощью назофарингеальных зондов и ротоглоточных тампонов. Кровь и аспираты от матерей отбирали по описанной ранее схеме, с использованием наркоза и прижимных клеток [8].

Образцы крови обрабатывали на автоматическом гематологическом анализаторе «Micros ES 60» («Horibo ABX»). Количество глюкозы измеряли глюкометром «Accu-Chek» («Roche»).

Анализ сыворотки крови на присутствие специфических иммуноглобулинов проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора реагентов для определения IgG антител к B. pertussis («RIDASCREEN Bordetella IgG»). Для этого заменили Sero G HD конъюгат антител кролика к IgG человека на конъюгат антител кролика к IgG обезьяны («Abcam»). Адаптированная тест-система, скорее всего, не может быть использована для количественного анализа IgG, но пригодна для оценки динамики изменения показателя. В реакции прямой агглютинации (РПА) применяли набор «Диагностикум коклюшный жидкий» («Эколаб»).

Для молекулярно-биологического анализа использовали ДНК B. pertussis, выделенную из смывов заднеглоточных и назофарингеальных зондов. Осадки из этих препаратов после центрифугирования обрабатывали раствором гуанидинтиоцианата с последующей сорбцией ДНК на магнитном сорбенте («Promega») [13][14]. Для определения количества геном-эквивалентов ДНК B. pertussis в аспиратах использована разработанная и валидированная нами тест-система полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) [13][14].

Дизайн исследования

Биоматериал собирали в динамике в следующие сроки:

• перед иммунизацией (фоновые значения) — контрольная точка (к.т.) 1.0;
• через 1 ч после иммунизации (только мазок);
• на 3-й день после иммунизации;
• через 1 нед после иммунизации — к.т. 1.1;
• через 2 нед после иммунизации — к.т. 1.2;
• через 1 мес после иммунизации — к.т. 1.3;
• через 1,5 мес после иммунизации — к.т. 1.4;
• через 2 мес после иммунизации — к.т. 1.5;
• перед первой реиммунизацией — к.т. 2.0;
• через 1 ч после первой реиммунизации (мазок);
• через 3 дня после первой реиммунизации;
• через 1 нед после первой реиммунизации — к.т. 2.1;
• через 2 нед после первой реиммунизации — к.т. 2.2;
• через 1 мес после первой реиммунизации — к.т. 2.3;
• через 1,5 мес после первой реиммунизации — к.т. 2.4;
• через 3–4 мес после первой реиммунизации — к.т. 2.5;
• перед второй реиммунизацией — к.т. 3.0;
• через 1 ч после второй реиммунизации (мазок);
• через 1 нед после второй реиммунизации — к.т. 3.1;
• через 2 нед после второй реиммунизации — к.т. 3.2;
• через 1 мес после второй реиммунизации — к.т. 3.3;
• через 1,5 мес после второй реиммунизации — к.т. 3.4;
• через 3 мес после второй реиммунизации — к.т. 3.5.

В те же сроки, кроме точки «1 ч после введения препарата», брали биоматериал и у матерей. Через 12 мес после второй реиммунизации было проведено экспериментальное инфицирование животных вирулентными изогенными бактериями B. pertussis 475. Материал для анализа отбирали в те же сроки, что и после иммунизации.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Разработка экспериментальной модели коклюшной инфекции на детёнышах обезьян

Результаты экспериментов с детёнышами обезьян недостаточно описаны в литературе. По этой причине на первом этапе было необходимо определить саму возможность и методы работы с обезьянами младенческого возраста (в 1–2-месячном возрасте). Для решения этой задачи, учитывая социальные особенности поведения животных в семьях с детёнышами, а также имеющийся отрицательный опыт изоляции детёнышей от матерей, было принято решение по изоляции от семьи матерей с детёнышами. Учитывая объём анализов, прежде всего крови, необходимый для оценки безопасности препаратов и оценки развития коклюшной инфекции, в качестве модели были выбраны наиболее крупные, доступные для экспериментов обезьяны вида P. hamadryas.

Все обезьяны на начало эксперимента находились в состоянии клинического и соматического здоровья и были серонегативными к антигенам B. pertussis. За самками наблюдали во время их беременности и после рождения детёнышей. Даты рождения детёнышей отличались у разных самок, в связи с этим иммунизацию и соответствующее обследование обезьян проводили в разное время.

В эксперимент были включены 3 самки обезьян P. hamadryas, каждая со своим детёнышем. Нумерация обезьян осуществлялась в месячном возрасте в связи с невозможностью более раннего отлучения детёнышей от матери. В документах отмечали номер регистрации матери, отца, расположение семьи и номер детёныша. По достижении малышами месячного возраста мать с детёнышем загоняли в прижимную клетку. Мать вводили в медикаментозный сон, а детёныша переносили в манипуляционную комнату для осуществления всех требуемых процедур. Все манипуляции с детёнышем проводили на заранее подготовленной одноразовой пелёнке. Перенос детёныша и все манипуляции контролировал ветеринарный врач. Манипуляции со спящей матерью (взятие мазков, крови, осмотр врачом) проводили в отдельной комнате. Детёныша возвращали матери до её пробуждения. Матери с детёнышами, участвующие в эксперименте, находились в общем помещении (загоне), отдельно от остальных членов семей на протяжении всего времени наблюдения.

Безопасность интраназального введения обезьян ГамЖВК

Детёнышам проводили первичную иммунизацию в возрасте 1 мес и в более позднем возрасте — 2 реиммунизации с интервалом 3,0–3,5 мес. Через 12 мес после второй реиммунизации детёнышей экспериментально инфицировали изогенными вирулентными бактериями возбудителя коклюша.

Критериями оценки безопасности препарата ГамЖВК и введения вирулентных бактерий B. pertussis 475 служило отсутствие отклонений от нормы клинического анализа крови, состояния здоровья обезьян — отсутствие местных реакций, потери массы и изменения поведения. За поведением детёнышей и матерей регулярно наблюдали на протяжении всего срока эксперимента.

На протяжении всего периода наблюдения не было выявлено отклонений в состоянии здоровья и развитии детёнышей, в том числе не было обнаружено признаков кашля, изменения температуры и нарушения прироста массы, местных реакций на каждое из трёх интраназальных введений ГамЖВК и экспериментальное инфицирование. Результаты общего клинического анализа крови в первые 2 нед наблюдения — сроки, определённые как наиболее значимые по результатам предыдущих исследований на взрослых животных, приведены в таблице. Не было отмечено значимого изменения СОЭ и общего соматического состояния и анализов крови у матерей (результаты приведены только после экспериментальной инфекции), находящихся в постоянном контакте с иммунизированными детёнышами.

 

Во всех описанных нами ранее исследованиях анализ сыворотки крови обезьян на присутствие специфических иммуноглобулинов проводили с помощью наборов реагентов («RIDASCREEN Bordetella IgG»), предназначенных для ИФА сыворотки крови человека [6][8–10]. Для адаптации тест-системы к иммуноглобулинам произведена замена конъюгата антител кролика к IgG человека, входящего в набор, на конъюгат антител кролика к IgG обезьяны. Подбор рабочих разведений конъюгата и анализируемой сыворотки был проведён в результате постановок контрольных реакций ИФА с использованием планшетов со специфическими антигенами — коклюшным токсином (КТ) и филаментозным гемагглютинином (ФГА) — и конъюгата антител кролика к IgG обезьяны. В качестве стандарта использованы отобранные и охарактеризованные ранее сыворотки крови контрольных обезьян и обезьян, экспериментально инфицированных вирулентными бактериями B. pertussis. Для постановки реакции ИФА на модифицированном наборе определено рабочее разведение конъюгата 1 : 40 000 и сыворотки крови 1 : 20.

На рис. 1 представлены результаты определения оптической плотности (ОП) в лунках планшет ИФА, содержащих разведённые сыворотки иммунизированных обезьян, в динамике после первого интраназального введения ГамЖВК и двух реиммунизаций. Значения ОП принимали в качестве характеристики содержания антител IgG в исследуемом образце. После первой иммунизации только у одного детёныша зарегистрировано некоторое количество фоновых антител IgG, достигающее максимума к 28–43-му дню. После 2 последующих реиммунизаций значимый рост специфических IgG наблюдался спустя 1 нед и достигал максимума через 14–30 дней после первой реиммунизации и 7–14 дней — после второй.

В РПА определяли титры противококлюшных антител, образовавшихся в ответ на интраназальное введение препарата ГамЖВК. Для постановки реакции использовали суспензию бактерий B. pertussis и различные разведения сыворотки крови иммунизированных обезьян. После первой иммунизации агглютинация сывороткой практически отсутствовала, тогда как после двух реиммунизаций быстро нарастала и достигала максимума через 14–30 дней (рис. 2).

Через 12 мес после второй реиммунизации было проведено экспериментальное инфицирование животных вирулентными изогенными бактериями B. pertussis 475. Количество специфических IgG (КТ + ФГА) и титр агглютинации у матерей и детёнышей после экспериментальной инфекции достигали максимума уже к 14-му дню и сохранялись на высоком уровне до конца наблюдения (рис. 3, 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведённые нами ранее доклинические исследования показали, что неоднократное интраназальное введение препарата ГамЖВК взрослым обезьянам не вызывало отклонений от нормы соматического здоровья и изменения поведения. Последующее экспериментальное инфицирование вирулентными бактериями B. pertussis иммунизированных обезьян не приводило к формированию клинических и лабораторных показателей течения коклюшной инфекции [8–10]. Полученные нами данные указывали на безопасность, хорошую переносимость и иммуногенность препарата ГамЖВК. Результаты 2 этапов клинического исследования ГамЖВК на здоровых добровольцах подтвердили сделанный вывод.

Экспериментальное инфицирование нативных (контрольных, неиммунизированных) обезьян сопровождалось развитием ряда клинических симптомов и лабораторных показателей развития коклюшной инфекции и формирования иммунного ответа, соответствующих течению коклюша у людей [8–10]. Наблюдения за детёнышами и матерями P. hamadryas, проведённые в настоящем исследовании, также не выявили отклонения от нормы или динамических изменений измеренных параметров, в том числе увеличения количества лимфоцитов и снижения уровня глюкозы, характерных при развитии коклюшной инфекции у обезьян и человека. Из-за невозможности отбора более 1 мл крови удалось выполнить только общий анализ крови и определить глюкозу с помощью глюкометра. Представленные результаты подтверждают безопасность и хорошую переносимость ГамЖВК — отсутствие местных и общих реакций, стабильность всех измеренных показателей: общего и биохимического анализов крови после трехкратного интраназального введения детёнышам P. hamadryas.

Особенностью работы с использованной экспериментальной моделью является ограничение на взятие необходимых для исследования объёмов крови в возрасте 1 мес, а также физиологическая и психологическая привязанность матерей и детёнышей. Это обстоятельство было учтено при выборе параметров для анализа, особенно после первичной иммунизации. В качестве приоритетных для оценки показателей безопасности и иммуногенности выбраны приведённые в работе показатели. На следующем этапе предполагается провести оценку недостающих параметров безопасности (аланини аспартатаминотрансферазы).

Предыдущий этап исследования с использованием половозрелых обезьян показал, что экспериментальное инфицирование после иммунизации препаратом ГамЖВК вирулентными бактериями B. pertussis приводит к формированию защитной реакции организма, проявляющейся в выраженном росте специфических IgG, достигающем максимума спустя 7–14 дней после вторичной иммунизации или повторного инфицирования, и ускоренному выведению бактерий B. pertussis из ротоносоглотки [8]. Аналогичнную картину наблюдали после реиммунизации обезьян препаратом ГамЖВК [8–10]. При клинических исследованиях ГамЖВК также наблюдали нарастающий после повторной вакцинации добровольцев иммунный ответ [15].

Для характеристики иммунного ответа детёнышей обезьян нами использована тест-система «RIDASCREEN Bordetella IgG», предназначенная для ИФА сыворотки крови человека [6][8–10]. Однако приобретённые у того же производителя тест-системы другого лота не выявляли антител IgG в сероположительных сыворотках крови взрослых обезьян видов P. hamadryas и M. mulatta. Консультации с производителем позволили предположить, что отрицательный результат связан с отсутствием связывания конъюгата к IgG человека у нового лота набора с иммуноглобулином обезьяны. Этот результат потребовал замены конъюгата человека на конъюгат обезьяны M. mulatta. На рис. 1 представлены результаты измерения специфических коклюшных антител класса IgG с помощью модифицированной нами тест-системы. Наблюдаемая на рис. 1 картина не имеет принципиальных отличий от динамики нарастания IgG-антител после иммунизации взрослых обезьян и добровольцев [6][8–10]. Как и в первом случае, только у части обезьян зарегистрированы некоторое количество фоновых антител IgG после первой иммунизации и значительное нарастание при реиммунизациях.

Ещё одним используемым в настоящее время методом определения иммуногенности коклюшных вакцин является определение титров агглютинации с суспензией бактерий B. pertussis с разведениями сывороток крови иммунизированных людей и животных. Значение 1 : 160 заложено в национальном стандарте России в качестве определяющего при оценке защитной активности ЦКВ при полном курсе первичной вакцинации детей². Результаты, представленные на рис. 2, показывают, что динамика изменения титров агглютинации качественно не отличается от изменения количества антител IgG в сыворотке крови обезьян. У 2 из 3 детенышей после первичной иммунизации не зарегистрировано роста титра в РПА и сывороточных специфических коклюшных антител класса IgG. У детёныша № 32317 через 1,5 мес зарегистрировали четырёхкратное увеличение антител IgG в сравнении с базовым значением и рост титра в ПА до значения 1 : 40. Через 3 мес количество IgG и значение титра агглютинации снизились до исходного уровня.

Повторное введение вакцины (реиммунизация) всем 3 детёнышам обезьян привело к значительно более раннему росту антител IgG в сыворотке крови. У всех детёнышей значимый рост IgG отмечали уже через 1 нед с максимумом на 2–4 нед. Через 6 мес после первичной иммунизации только одна обезьяна сохраняла уровень IgG достоверно выше исходного. Результаты третьего введения (вторая реиммунизация) принципиально не отличались от второго, как и после экспериментального инфицирования, подобно взрослым обезьянам. При этом у детёнышей значения титров антител IgG достигали максимума после первичного введения несколько позже (через 14–28 дней), чем у взрослых обезьян (7–14 дней). После второй реиммунизации IgG у детёнышей выходили на максимум уже через 7–14 дней. Следует отметить, что реиммунизации через 3,0–3,5 мес при последующем выраженном бустерном эффекте проводились на фоне низкого, близкого к фоновому уровню IgG. После повторных введений ГамЖВК детёнышам у контактировавших с ними матерей не было зарегистрировано значительного роста IgG и увеличения титра агглютинации в РПА.

Таким образом, интраназальная иммунизация детёнышей обезьян P. hamadryas препаратом ГамЖВК приводила к формированию противококлюшного иммунного ответа, характеризующегося нарастанием количества специфических IgG (КТ + ФГА) и титров антител в РПА. Бустерный эффект повторной иммунизации свидетельствовал о целесообразности реиммунизации с целью достижения максимального защитного эффекта. Полученные результаты соответствовали описанным нами ранее у взрослых обезьян [8–10] и позволяют предположить, что, несмотря на невысокие средние значения уровня антител IgG (КТ + ФГА) в ИФА и общих противококлюшных антител в РПА, первичная иммунизация детёнышей обезьян препаратом ГамЖВК способна обеспечивать защитный иммунный ответ при повторном контакте с коклюшной инфекцией. Эффективность одноили двукратного первичного введения препарата ГамЖВК для формирования напряжённого и более продолжительного противобактерийного иммунитета предполагается изучать в дальнейших исследованиях при помощи экспериментальной модели обезьян и в клинических исследованиях на здоровых добровольцах.

Через 12 мес после второй реиммунизации проведено экспериментальное инфицирование детёнышей обезьян вирулентными изогенными бактериями B. pertussis 475. Динамика изменения содержания антител IgG (КТ + ФГА) у детёнышей соответствовала описанной нами ранее у взрослых обезьян [9]. Особенный интерес представлял быстрый и значительный рост антител IgG в сыворотке крови матерей при их практическом отсутствии на протяжении всего срока после иммунизации детёнышей. Рост титров антител в сыворотке матерей отмечен примерно в те же сроки, что и у детёнышей, — на 14-й и 28-й дни после инфекции (рис. 4), но был менее выраженным и быстрее возвращался к первоначальному уровню. Быстрое увеличение уровня специфических антител в сыворотке крови матерей после экспериментального инфицирования свидетельствует о возможной пассивной иммунизации матерей при тесном контакте с иммунизированными детёнышами. В пользу такого предположения свидетельствует отсутствие лабораторных показателей и клинических признаков коклюшной инфекции у матерей после экспериментальной инфекции вирулентными бактериями.

Напряжённость и длительность формирования защитного иммунитета от коклюша после вакцинации и/или перенесённой инфекции оценивается по наличию гуморального и клеточного противобактерийного ответа. Во втором случае, говоря о противококлюшном иммунитете, прежде всего оценивают индуцированную продукцию интерферона и интерлейкина-17 полиморфноядерными клетками крови [1]. Такая работа была проведена нами ранее в доклинических экспериментах со взрослыми обезьянами и осуществляется в настоящее время в рамках клинических исследований на здоровых добровольцах [9][15]. Однако наиболее адекватное представление о защитном потенциале препарата ГамЖВК, с нашей точки зрения, может дать сравнительный показатель времени элиминации бактерий B. pertussis (вирулентных и/или аттенуированных) у иммунизированных и нативных животных.

В дальнейшем планируется изучение структуры популяции аттенуированных бактерий B. pertussis и их персистенции в организме. Скорость элиминации бактерий B. pertussis и динамика измерения количества их ДНК в назофарингеальных и ротоглоточных аспиратах будет изучена с помощью метода ПЦР-РВ и созданной нами тест-системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отсутствие местных и общих реакций организма у детёнышей обезьян вида P. hamadryas, а также стабильность показателей клинических анализов крови и выраженный бустерный эффект после реиммунизации и экспериментального инфицирования свидетельствуют о наличии защитной реакции организма детёнышей, иммунизированных препаратом ГамЖВК, от коклюшной инфекции и подтверждают его безопасность при интраназальном введении. Наличие бустерного антительного ответа после экспериментального инфицирования у неиммунизированных матерей, которые находились в тесном контакте с иммунизированными детёнышами, указывает на формирование у матерей противобактерийного иммунного ответа.

Созданный нами препарат ГамЖВК на основе аттенуированных бактерий B. pertussis представляется наиболее перспективным для формирования коллективного иммунитета против коклюша и так называемого семейного «кокона».

Об авторах

А. А. Джидарян

Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8792-5289

Джидарян Ануш Ашотовна — старший лаборант с высшим образованием лаб. иммунологии и вирусологии 

Сухум

А. З. Матуа

Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3275-0941

Матуа Алиса Зауровна — к.б.н., зам. директора по научной работе, зав. лаб. иммунологии и вирусологии 

Сухум

А. Ю. Медкова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1509-0622

Медкова Алиса Юрьевна — к.м.н., с.н.с. лаб. генетики бактерий

Москва

Россия

Е. Г. Семин

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6696-8362

Cёмин Евгений Григорьевич — н.с. лаб. генетики бактерий

Москва

Россия

Л. Н. Синяшина

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1708-5453

Синяшина Людмила Николаевна — д.м.н., в.н.с. лаб. генетики
бактерий 

Москва

Россия

И. Н. Дьяков

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи; Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5384-9866

Дьяков Илья Николаевич — к.б.н., в.н.с., зав. лаб. биосинтеза
иммуноглобулинов 

Москва

Россия

И. Н. Чернышова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи; Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5053-2433

Чернышова Ирина Николаевна — к.м.н., с.н.с. лаб. биосинтеза
иммуноглобулинов

Москва

Россия

Д. Т. Кубрава

Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9104-4014

Кубрава Дженни Тамазовна — м.н.с. лаб. иммунологии и вирусологии

Сухум

А. А. Амичба

Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-4986-1392

Амичба Астанда Арнольдовна — м.н.с. лаб. иммунологии и вирусологии 

Сухум

И. Г. Конджария

Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3707-4874

Конджария Ирина Георгиевна — к.б.н., с.н.с. лаб. иммунологии и вирусологии 

Сухум

З. Я. Миквабиа

Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0729-6516

Миквабия Зураб Ясонович — д.м.н., профессор, директор

Сухум

Г. И. Каратаев

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи

Автор, ответственный за переписку.
Email: karataevgi@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-8771-6092

Каратаев Геннадий Иванович — д.б.н., в.н.с., рук. лаб. генетики бактерий

Москва

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы