Молекулярно-генетические особенности ротавирусов группы А, выявленных в Москве в 2015–2020 гг.

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель работы — анализ генетических характеристик штаммов ротавирусов группы А (РВА), циркулировавших в Москве в 2015–2020 гг., включая редкие штаммы, нетипируемые методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Материалы и методы. Исследовали 289 фекальных образцов от детей в возрасте от 1 мес до 17 лет, госпитализированных с острым гастроэнтеритом. Выявление ротавирусов в образцах проводили методами иммунохроматографии и обратной транскрипции (ОТ) с ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ). Секвенирование ротавирусного генома проводили по Сэнгеру и методом нанопорового секвенирования.

Результаты и обсуждение. В 131 клиническом образце была выявлена РНК РВА, в 125 случаях из них был установлен G/[P]-генотип. В общей структуре преобладали штаммы РВА с генотипом G9P[8]I1 (37%), за ними следовали варианты G3P[8]I2, G4P[8]I1, G2P[4]I2, G1P[8]I1 и G3P[8]I1 (18, 15, 11, 5 и 2% соответственно). Семь (5%) изолятов были идентифицированы как GxP[8]. В 2015–2020 гг. в регионе снизилась частота встречаемости генотипа G4P[8]I1 (с 39 до 9%) и выросла доля генотипа G9P[8]I1 (с 6 до 37%) по сравнению с 2009–2014 гг. В 2018–2020 гг. выявлена высокая доля не встречавшегося ранее DS-1-подобного реассортантного штамма G3P[8]I2, широко распространившегося в мире в последние годы, Методом нанопорового секвенирования проведён анализ генома штамма G3P[8]I2 и редкого штамма G4P[6]I1. Для штамма G4P[6]I1 установлена тесная филогенетическая связь с ротавирусами свиней.

Заключение. За последние годы в генетической структуре РВА, циркулирующих на территории московского региона, произошли существенные изменения. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости постоянного мониторинга ротавирусной инфекции и выборочного секвенирования генов РВА для уточнения данных типоспецифической ОТ-ПЦР-РВ. Из-за постоянных изменений генетического состава циркулирующих штаммов РВА требуется периодическая оптимизация систем генотипирования РВА на основе ОТ-ПЦР-РВ. 

Полный текст

Введение

Ротавирусы группы А (РВА) являются основной причиной госпитализации детей в возрасте до 5 лет с острым гастроэнтеритом в странах с низким охватом вакцинацией против ротавируса. В 2016 г. ротавирусная инфекция (РВИ) вызвала 258 млн эпизодов диареи и 128 500 случаев смерти среди детей в возрасте до 5 лет во всём мире [1].

В 2020 г. вакцинация против РВА была включена в национальные программы иммунизации 107 стран1. Иммунизация от РВИ в России включена в Календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям. Четыре ротавирусные вакцины в настоящее время рекомендованы ВОЗ и лицензированы для использования: пятивалентные — RotaTeq («Merck & Co., Inc.»), ROTASIIL (Serum institute of India PVT. Ltd.); и моновалентные — Rotarix («GlaxoSmithKline»), ROTAVAC («Bharat Biotech»). Массовая вакцинация против РВА снижает заболеваемость и частоту госпитализации с острым гастроэнтеритом во всех возрастных группах, особенно у младенцев и людей старше 65 лет [2].

РВА относятся к виду Rotavirus A, рода Rotavirus, семейства Reoviridae. Геном ротавирусов представлен 11 сегментами двухцепочечной РНК, кодирующими синтез 12 белков [3]. Современная система классификации ротавирусов предполагает генотипирование по всем 11 генам (Gх–P[ х]–Iх– Rх–Cх–Mх–Aх–Nх–Tх–Eх–Hх). Большинство циркулирующих РВА человека относятся к 3 эволюционным линиям, отличающимся констелляциями генома: Wa-подобные штаммы (G1–P[ 8]–I1–R1–C1–M1–A1–N1–T1–E1–H1), DS-1-подобные (G2–P[ 4]–I2–R2–C2–M2–A2–N2–T2–E2–H2) и AU-1-подобные штаммы (G3–P[ 3]–I3–R3–C3–M3–A3–N3–T3–E3–H3) [3]. Ранее широко применялась схема типирования, в которой определялись только гены белков VP7 (G) и VP4 (P). G/[P]-генотипирование штаммов РВА выполняется в реакции ОТ с последующей мультиплексной полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) [4] или секвенированием соответствующих генов.

В настоящее время генотипы G1P[ 8], G2P[ 4], G3P[ 8], G4P[ 8], G12P[ 8] и G9P[ 8], гомотипные или частично гетеротипные по отношению к используемым лицензированным вакцинам (RotaTeq и Rotarix), доминируют среди циркулирующих штаммов РВА во всем мире [5]. Описаны случаи как межвидовой передачи РВА от животных человеку, так и заражения человека штаммами, образованными в результате реассортации штаммов ротавирусов животных и человека [6–8]. Эволюционная изменчивость штаммов РВА во времени [9], территориальные различия в распределении циркулирующих штаммов, увеличение их разнообразия после введения иммунизации в некоторых регионах, изменение генотипической структуры как в странах с плановой вакцинацией, так и без нее требуют постоянного эпидемиологического мониторинга РВИ [10].

Целью настоящего исследования является анализ генетических характеристик штаммов РВА, циркулировавших в Москве в 2015–2020 гг., включая редкие штаммы, не типируемые методом ПЦР.

Материалы и методы

Клинические образцы

Всего за 5 лет (2015–2020 гг.) было собрано 289 образцов стула у детей в возрасте от 1 мес до 17 лет с симптомами острого гастроэнтерита, госпитализированных в МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Дети, прошедшие вакцинацию против РВИ, не были включены в исследование. Информированное согласие было получено от родителей или законных представителей для всех испытуемых.

В 45 пробах антиген РВА был обнаружен методом иммунохроматографии (набор реагентов «RIDA Quick Rotavirus», «R-Biopharm AG»). Образцы фекалий собирались в стерильные контейнеры у пациентов с диарей (не более 72 ч после появления симптомов), до отправки в лабораторию образцы хранились при температуре –20ºС, затем отправлялись в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова для генетического анализа ротавирусов.

Выделение РНК

Для изоляции РНК использовали осветлённые центрифугированием (5000 об/мин, 5 мин) 10% фекальные экстракты, приготовленные в стерильном физиологическом растворе. Выделение РНК из экстрактов проводили набором «АмплиСенс® МАГНО-сорб» («ИнтерЛабСервис») в соответствии с инструкцией по применению. Образцы РНК хранили при –80ºС.

Детекция ротавирусной РНК

Обнаружение РВА в клинических образцах методом ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) выполняли в формате одной пробирки с использованием праймеров и зондов, описанных ранее [11]. Генотипирование РВА двухэтапной мультиплексной ПЦР-РВ для генов белков VP7 (G1, G2, G3, G4, G9), VP4 (P[ 4], P[ 6], P[ 8]) и VP6 (I1, I2) проводили согласно методике [12]. Анализ генотипирования РВА, основанный на мультиплексной ОТ-ПЦР с последующим анализом продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле, использовали в качестве эталонного метода и выполняли, как описано в рекомендациях ВОЗ [4].

Амплификация и секвенирование генов белков VP7 и VP4

Для секвенирования генов белков VP7 и VP4 штаммов G3P[ 8]I2 амплификацию выполняли с использованием описанных ранее праймеров для секвенирования VP7F/VP7R [13] и VP4F/VP4R [14], образующих ампликоны размером 881 и 663 пар оснований соответственно. Аликвоты выделенной РНК (10 мкл) смешивали с 3 пмоль праймерами VP7F или VP4F, инкубировали при 95ºC в течение 1 мин и охлаждали в течение 2–3 мин при комнатной температуре. Реакцию ОТ проводили в общем объёме 25 мкл, содержащем праймер ОТ, 25 единиц обратной транскриптазы MMLV («Синтол», Россия). Стадия ОТ включала инкубацию для синтеза кДНК при 45ºC в течение 30 мин и инактивацию обратной транскриптазы MMLV при 95ºC в течение 5 мин. Температурно-временной режим ПЦР-РВ: 95ºC — 120 с; 95ºC — 60 с, 52ºC — 40 с, 72ºC — 40 с (45 циклов); 72ºC — 40 с. ПЦР-ампликоны каждого гена очищали с помощью набора «Cleanup Standard» («Евроген») и проводили секвенирование обеих цепей ДНК с использованием генетического анализатора «NANOPHORE®05» («Синтол») и реагентов компании «Синтол».

Нанопоровое секвенирование ротавирусного генома и биоинформатический анализ

Полногеномная кДНК ротавирусных генных сегментов была получена с помощью смеси праймеров unRAf1, unRAf2, unRAf3, unRAr1, unRAr2 и unRAr3 (табл. 1) для реакции ОТ. Для одновременной амплификации всех сегментов гена РВА использовали «универсальный» праймер Up [15] (табл. 1). Амплификация проводилась в следующей реакционной смеси: TaKaRa LA Taq полимераза (2,5 ЕД), LA PCR Buffer ll (Mg2+plus), 25 мM MgCl2 (финальная концентрация Mg2+ 5 мM) («TaKaRa»), dNTP 25 мM («Синтол»), 40 пмоль Up праймера. Параметры амплификации: 95ºC — 2 мин, затем 40 циклов при 95ºC по 30 с, 65ºC — 30 с, 68ºC — 3,5 мин. ПЦР-ампликоны очищали экстракцией фенол/хлороформ. Концентрацию и чистоту ампликонов измеряли спектрофотометрическим методом (A260/230, 260/280).

 

Таблица 1. Праймеры для амплификации полноразмер­ных генных сегментов ротавирусов

Table 1. Primers for amplification of full length rotavirus gene segments

Праймер Primer

Последовательность праймера 5’-3’

Primer sequence 5’-3’

unRAf1

GCCGGAGCTCTGCAGAATTCGGCTWTWAAA

unRAf2

GCCGGAGCICIGCAGAATTCGGCTTTTTTT

unRAf3

GCCGGAGCICIGCAGAATTCGGCTTTTAAT

unRAr1

GCCGGAGCTCTGCAGAATTCGGTCAYATC

unRAr2

GCCGGAGCTCTGCAGAATTCGGTCACAWA

unRAr3

GCCGGAGCTCTGCAGAATTCAGCCACATG

Up

GCCGGAGCTCTGCAGAATTC

Библиотеку ДНК для нанопорового секвенирования (НПС) получали с использованием набора реагентов «Rapid Sequencing Kit» на портативном секвенаторе «MinION» с использованием стандартной проточной ячейки R9 («Oxford Nanopore Technologies»). Был разработан конвейер, позволяющий точно классифицировать исходные данные НПС. Конвейер на основе языка программирования Python идентифицировал полученные прочтения, запуская BLAST-анализ для базы данных эталонных последовательностей сегментов генома ротавируса2. Затем проводилось картирование прочтений на референсную последовательность с использованием программы Minimap2 [16] и создание консенсусной последовательности с использованием скрипта3, написанного на языке Python. В консенсусной последовательности выбирался нуклеотид с наибольшей частотой встречаемости в положении выравнивания.

В редких случаях, когда два нуклеотида обнаруживались в одном положении в равном количестве, второй нуклеотид игнорировался. Идентификацию генотипа РВА по нуклеотидной последовательности генных сегментов проводили с помощью онлайн-сервиса «Rotavirus A Genotype Determination»4, основанном на программном обеспечении, написанном Dan Katzel [17]. Методика НПС генома ротавирусов подробно описана в статье E. Faizuloev и соавт. [18].

Идентификационные номера GenBank (NCBI)

Нуклеотидные последовательности, соответствующие 10 сегментам генома изолятов Moscow-40/2020 ( G3P[ 8]I2) и Moscow-1P/2015 (G4P[ 6]I1), депонированы в GenBank под номерами MW558493–MW558502 и MT876633–MT876642 соответственно. Частичные последовательности трех других штаммов с генотипом G3P[ 8]I2 были депонированы под номерами MT648671, MT648671, MT648671 для VP7 и MT814324, MT814326 для VP4.

Филогенетический анализ

Построение филогенетических деревьев проводили в программе MEGA-X [19] методом максимального правдоподобия (двухпараметрическая модель Kimura [20]). Bootstrap-анализ осуществляли на основе 1000 репликаций. В качестве референсных использовали штаммы РВА, рекомендованные Рабочей группой по таксономии ротавирусов [3], а также штаммы, имеющие, по данным BLAST-анализа, не менее чем 99,5% сходство с исследуемыми штаммами.

Результаты

Всего на наличие РНК или антигена РВА было проанализировано 289 фекальных образцов, собранных у детей, госпитализированных в стационар с симптомами острого гастроэнтерита. В 131 (45%) случае была обнаружена РНК, которую в дальнейшем использовали для G/[P]-генотипирования методом ОТ-ПЦР-РВ и/или секвенированием. В 125 случаях (95,4%) был определен G/[P]-генотип РВА, в 7 (5,3%) случаях РВА был типирован только по гену P, а для 6 (4,6%) образцов генотип установить не удалось.

Генетический состав исследованных штаммов РВА представлен на рис. 1. В 2015–2020 гг. штаммы РВА с генотипом G9P[ 8]I1 доминировали в общей структуре (37%), второе место занимали G3P[ 8]I2 (новый DS-1-подобный штамм) — 18%, далее — G4P[ 8]I1 (15%), G2P[ 4]I2 (11%), G1P[ 8] I1 (5%), G3P[ 8]I1 (2%). Семь (5%) штаммов, типированных только по гену P, относились к варианту гена P[ 8]. Также были обнаружены единичный случай смешанной инфекции двумя генотипами (G9P[ 8]I1 и G2P[ 4]I2) и редкий штамм с генотипом G4P[ 6]I1.

Рис. 1. Распределение G/[P]-генотипов РВА, выделенных из 131 клинического образца в 2015–2020 гг. GxP[8]Ix — частично типированные РВА; Mix — смешанные генотипы; Nt — нетипированные образцы.

Fig. 1. Distribution of RVA G/[P]-genotypes isolated from 131 clinical samples in 2015–2020. GxP[ 8]Ix — partially typed PVA; Mix — mixed genotypes; Nt — non-typed samples.

 

На рис. 2 представлено распределение выявленных в Московском регионе генотипов РВА по годам. Доля генотипа G9P[ 8]I1 в последние годы значительно возросла, и в 2015–2020 гг. варьировала в пределах 36–41%. В то же время частота встречаемости генотипов G4P[ 8]I1 снизилась с 38 до 9%, а частота встречаемости генотипа G2P[ 4]I2 выросла до 14%.

Рис. 2. Распространение G/[P]-генотипов, выявленных в Москве за 10 лет наблюдения (2009–2020 гг.) [12]. Nt — нетипированные образцы

Fig. 2. Prevalence of G/[P]-genotypes detected in Moscow during the 10-year monitoring period (2009–2020) [12]. Nt — non-typed samples.

 

Важно отметить, что для G/[P]-генотипирования некоторых штаммов с генотипом GxP[ 8]I2 требовалось частичное секвенирование генов белков VP7 (G) и VP4 (P), поскольку лабораторной тест-системой на основе ОТ-ПЦР-РВ их G/[P]-генотип установить не удалось [12]. Секвенирование и филогенетический анализ G и P генов РВА (номера GenBank: MT648671, MT648671, MT648671 для гена G и MT814324, MT814326 для гена P) в образцах с обнаруженным GxP[ 8]I2 показали, что они принадлежат к генотипу G3P[ 8]I2 (рис. 3). Выявлено, что отсутствие сигнала при генотипировании с помощью ОТ-ПЦР-РВ вызвано несоответствием нуклеотидов между геном VP7 генотипа G3P[ 8]I2 и соответствующим зондом. На нетипируемых образцах с генотипом GxP[ 8]I2 была проведена моноспецифическая ПЦР с праймерами к G3 и электрофоретической детекцией, которая выявила ампликоны ожидаемой подвижности во всех образцах (данные не представлены), что подтвердило их принадлежность к генотипу G3P[ 8]I2.

Рис. 3. Филогенетические деревья, основанные на секвенированных генах белков VP4 и VP7 нового штамма G3P[8]I2. ▲ — сегменты, секвенированные по Сэнгеру; ♦ — ген, секвенированный методом НПС; ∆ — ген белка VP7 РВА лошади. Для обозначения штаммов использовался идентификационный номер GenBank, названия штаммов и G/[P]-генотип.

Fig. 3. Phylogenetic trees based on the sequenced genes of the VP4 and VP7 proteins of the new G3P[ 8]I2 strain. ▲ — segments sequenced using the Sanger technique; ♦ — the gene sequenced using the NPS technique; Δ — the equine RVA VP7 gene. The respective GenBank accession number, name of strains and G/[P]-genotype were used for designation of strains.

 

BLAST-анализ и филогенетический анализ продемонстрировали сходство секвенированных генов VP7 и VP4 с аналогичными генами РВА новой G3-DS-1-подобной констелляции, выявленной по всему миру. Схожие G3-DS-1-подобные штаммы были обнаружены в Австралии (2013) [21], Испании (2014–2015) [22], Венгрии (2016) [23], Бразилии (2016) [24], Индонезии (2016) [25], России (2019) [28] и в других странах (рис. 3).

Кроме того, было проведено НПС изолята Moscow-40/2020 с генотипом G3P[ 8]I2 (табл. 2), в результате которого были идентифицированы варианты генов 10 сегментов генома (номера GenBank MW558493–MW558502) и выявлена высокая (91,0– 99,8%) степень сходства консенсусной последовательности с референcным штаммом RVA/Humanwt/ THA/SKT-281/2013/G3P[ 8] (номера GenBank LC086714–LC086724).

 

Таблица 2. Результаты нанопорового секвенирования генома штаммов РВА с генотипами G3P[8]I2 и G4P[6]I1

Table 2. Results of nanopore sequencing of the genome of RVA strains with G3P[8]I2 and G4P[6]I1 genotypes

Сегмент

Segment

Вирусный белок Viral protein

G4P[6]I1

G3P[8]I2

количество прочтений number of reads

покрытие сегмента, % segment coverage, %

генотип genotype

количество

прочтений number of reads

покрытие сегмента, % segment coverage, %

генотип

genotype

1

VP1

1372

100

R1

12 792

100

R2

2

VP2

3795

100

C1

11 193

100

C2

3

VP3

1995

100

M1

-

-

Mx

4

VP4

633

20

P[6]

2785

100

P[8]

5

NSP1

546

100

A1

53 841

100

A2

6

VP6

15 187

100

11

16 479

100

I2

7

NSP3

14 566

100

T1

80 554

100

T2

8

NSP2

175

36

N1

40 022

100

N2

9

VP7

1465

100

G4

25 059

100

G3

10

NSP4

-

-

Ex

10 222

100

E2

11

NSP5/6

77

100

H1

11 351

100

H2

 

Редкий штамм Moscow-1P/2015 с генотипом G4P[ 6]I1 был обнаружен в клиническом образце, взятом у 8-летнего пациента в 2015 г. Методом ПЦР-РВ удалось установить только вариант гена P[ 6]. Секвенирование методами Сэнгера и НПС позволило установить генотип этого штамма по 10 генам: G4-P6-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-Ex-H1 (номера GenBank MT876633–MT876642, MG271938), что соответствует 81,7% генома (табл. 2).

Филогенетический анализ генов VP7, VP6 и VP4 штамма Moscow-1P/2015 (рис. 4) демонстрирует высокую степень сходства генов анализируемого образца с генами РВА свиней (номера GenBank: VP4 — KX363402, MK227950, KX363435, MK227948; VP6 — MK227391, MK227402, KX363414, MG066585, KJ126830; VP7 — JX498957, JX498956, MK227392, MN133419, MN133444) либо штаммов РВА (штамм RVA/Human-wt/CHN/ R1954/2013/G4P[ 6], номера GenBank: KF726066– KF726076, KF726056), выделенных из фекалий человека, но имеющих доказанное происхождение от РВА свиней [7]. BLAST-анализ остальных 7 генов также демонстрирует высокую степень сходства (92–98%) нуклеотидной последовательности со штаммами РВА свиней. Таким образом, филогенетический анализ свидетельствует о происхождении штамма G4P[ 6] от РВА свиней.

Рис. 4. Филогенетические деревья, основанные на секвенированных генах белков VP4, VP7 и VP6 РВА, штамма G4P[6]I1 (отмечены знаком ♦), референсных штаммах (Wa, AU-1, DS-1) представителей трёх эволюционных линий РВА (отмечены знаком ○) и генов РВА свиного происхождения, наиболее филогенетически близких генам штамма Moscow-1P/2015 согласно BLAST-анализу. Для обозначения штаммов использовался номер GenBank, название штамма и G/[P]-генотип

Fig. 4. Phylogenetic trees based on sequenced genes of RVA VP4, VP7, and VP6 proteins, strain G4P[ 6]I1 (marked by ♦), reference strains (Wa, AU-1, DS-1) representatives of three evolutionary lines RVA (marked by ○) and RVA genes of porcine origin, phylogenetically most closely related to genes of the Moscow-1P/2015 strain based on the BLAST analysis. The respective GenBank number, name of the strain and G/[P]-genotype were used for designation of strains.

 

Обсуждение

Полученные нами результаты свидетельствуют о существенных изменениях, произошедших в «генетическом ландшафте» РВА, циркулирующих в московском регионе. Согласно данным предыдущих исследований [12][26], до 2015 г. большинство генотипированных РВА относились к генотипу G4P[ 8]. Наши данные свидетельствуют о постепенном снижении встречаемости данного генотипа с 38 до 9% в 2017–2018 гг. При этом доля генотипа G9P[ 8] в московском регионе увеличилась до 36–41%. Это соответствует данным независимых исследований, проведенных в Москве [27][28], Нижнем Новгороде [29][30] и Оренбурге [31].

В нашем исследовании изучались клинические образцы, собранные у детей, госпитализированных с острым гастроэнтеритом. Реальный «генетический ландшафт» и распределение генотипов РВА, циркулирующих в Москве, могут отличаться от полученных данных, поскольку мы не включали в исследование пациентов с лёгким или умеренным гастроэнтеритом, не требующих госпитализации. Ранее в исследовании Е.Р. Мескиной показано, что тяжёлое течение ротавирусного гастроэнтерита может быть ассоциировано с конкретными генотипами РВА [32].

Особый интерес представляет штамм с генотипом G3P[ 8]I2, впервые выявленный нами в 2018 г. Его доля в общей структуре РВА составила 18%; по этому показателю он уступает только генотипу G9P[ 8]I1 (рис. 1). По результатам секвенирования и филогенетического анализа (рис. 3) мы предположили, что G3P[ 8]I2 является родственным реассортантному штамму, впервые выявленному в Таиланде в 2013 г. [25] и широко распространившемуся в последние годы на территории Европы, Азии и Австралии [7][22][33][34]. Данный штамм имеет DS-1-подобную констелляцию генов (G3–P[ 8]–I2–R2–C2–M2–A2–N2–T2–E2–H2), за исключением гена белка VP7, который в обычных для данной констелляции случаях представлен геновариантом G2, в то время как для геноварианта G3 более характерна Wa-подобная констелляция [35]. По предположению некоторых исследователей [21][22][25], штамм G3P[ 8]I2 образовался в результате реассортации человеческого DS-1-подобного штамма и лошадиного штамма Erv105 (номер GenBank: DQ981479.1), поскольку с геном белка VP7 этого штамма выявлено наибольшее сходство. При выполнении настоящего исследования мы, как и некоторые другие научные группы [22], столкнулись с невозможностью генотипировать новый штамм вируса методом типоспецифической ПЦР. Тест-система собственной разработки, как и праймеры, предложенные ВОЗ [4], не смогли выявить ген белка VP7 штамма G3P[ 8]I2. В то же время секвенирование по Сэнгеру и проведённый BLAST-анализ позволили достоверно определить геновариант как G3. Из-за точечных мутаций в генах VP4 и VP7 типоспецифические праймеры ПЦР всё чаще не могут идентифицировать их вариант [17]. Этот факт повышает значимость методов секвенирования в эпидемиологическом мониторинге РВИ.

Ещё один нетипичный штамм — Moscow1P/2015 с генотипом G4P[ 6]I1, выявленный в единичном случае, — вероятно, также является результатом реассортации РВА человека и животных либо полностью имеет животное происхождение. В данном случае не ясно, произошло ли заражение данным штаммом в результате передачи от человека к человеку, либо человек заразился вирусом от животных. По данным литературы, доля РВА с генотипом G4P[ 6]I1 в общей структуре выявляемых у человека штаммов РВА невысока [6][38]. Это может быть свидетельством какого-то ограничения для распространения G4P[ 6]I1 в человеческой популяции, например видового барьера, если предположить, что это штамм животного происхождения. В то же время следует принимать во внимание, что в большинстве подобных исследований обследованы дети, госпитализированные с ротавирусным энтеритом, тогда как случаи лёгкого протекания заболевания не рассматриваются. Поэтому мы не можем по этим данным судить о реальной распространённости того или иного штамма РВА.

Штаммы РВА свиней филогенетически близки штаммам ротавирусов человека [34], поэтому сложно установить, является ли исследуемый штамм следствием прямой передачи или реассортации [37–39]. Случаи реассортации или прямой межвидовой передачи РВА с генотипом G4P[ 6]I1 уже были описаны ранее как в Азии [6][25][40], так и в Европе [36].

Заключение

В 2015–2020 гг. в генетической структуре РВА, циркулирующих на территории московского региона, произошли существенные изменения: снизилась встречаемость генотипа G4P[ 8]I1, который занимал лидирующую роль в предыдущие годы; в то же время выросло количество случаев госпитализации с РВИ, вызванной штаммом G9P[ 8]I1. Также в исследуемый период отмечено появление штаммов РВА предположительно животного происхождения как в единичных случаях (G4P[ 6]I1), так и в значительном количестве (реассортантный G3P[ 8]I2), что является свидетельством важной роли межвидовой трансмиссии в эволюции РВА, патогенных для человека. Проведённое нами исследование подчёркивает необходимость постоянного мониторинга РВИ. Эпидемиологический мониторинг РВИ позволяет своевременно выявлять появление новых реассортантов РВА животных и человека, потенциально ускользающих от поствакцинального иммунитета. Выявленные нами и рядом авторов штаммы РВА, не типируемые методом ОТ-ПЦР-РВ (генотипы G3P[ 8]I2 и G4P[ 6]I1) [6][22], подчёркивают необходимость выборочного секвенирования генов РВА и оптимизации последовательностей типоспецифических праймеров для ОТ-ПЦР-РВ.

1. URL: https://preventrotavirus.org/vaccine-introduction/global-introduction-status

2. URL: https://github.com/lioj/bioinformatics/blob/master/py/classificationStat.py

3. URL: https://github.com/lioj/bioinformatics/blob/master/py/bam2consensus.py

4. URL: https://www.viprbrc.org/brc/rvaGenotyper.spg?method=ShowCleanInputPage&decorator=reo

×

Об авторах

О. А. Петруша

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: petrusha.olga@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5022-7962

Петруша Ольга Александровна — м.н.с. лаб. молекулярной вирусологии,

Москва

Россия

Е. Р. Корчевая

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6417-3301

Корчевая Екатерина Романовна — м.н.с. лаб. молекулярной вирусологии,

Москва

Россия

Р. Р. Минтаев

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5398-3627

Минтаев Рамиль Рафаилович — м.н.с. лаб. генетики РНК-содержащих вирусов,

Москва

Россия

И. Ю. Исаков

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5742-6550

Исаков Игорь Юрьевич — м.н.с. лаб. молекулярной биотехнологии,

Москва

Россия

А. А. Никонова

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9610-0935

Никонова Александра Александровна — к.б.н., зав. лаб. молекулярной биотехнологии,

Москва

Россия

Е. Р. Мескина

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова;
Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1960-6868

Мескина Елена Руслановна — д.м.н., зав. отд. детских инфекций отдела терапии,

Москва

Россия

А. Ю. Ушакова

Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8438-7609

Ушакова Анна Юрьевна — к.м.н., ассистент кафедры хирургии,

Москва

Россия

М. К. Хадисова

Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8293-6643

Хадисова Марима Касумовна — к.м.н., н.с. отд. детских инфекций, отдел терапии

Москва

Россия

В. В. Зверев

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0017-1892

Зверев Виталий Васильевич — д.м.н., профессор, академик РАН, зав. кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии,

Москва

Россия

Е. Б. Файзулоев

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7385-5083

Файзулоев Евгений Бахтиерович — к.б.н., зав. лаб. молекулярной вирусологии,

Москва

Россия

Список литературы

  1. Troeger C., Khalil I.A., Rao P.C., Cao S., Blacker B.F., Ahmed T., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatr. 2018; 172(10): 958–65. https://doi.org/10.1001/jamapediatrics.2018.1960
  2. Hoog M.L.A., Vesikari T., Giaquinto C., Huppertz H.I., Martinon-Torres F., Bruijning-Verhagen P. Report of the 5th European expert meeting on rotavirus vaccination (EEROVAC). Hum. Vaccin. Immunother. 2018; 14(4): 1027–34. https://doi.org/10.1080/21645515.2017.1412019
  3. Matthijnssens J., Ciarlet M., Rahman M., Attoui H., Banyai K., Estes M.K., et al. Recommendations for the classification of group A rotaviruses using all 11 genomic RNA segments. Arch. Virol. 2008; 153(8): 1621–9. https://doi.org/10.1007/s00705-008-0155-1
  4. WHO. Manual of rotavirus detection and characterization methods. Geneva; 2009. Available at: https://www.who.int/vaccines-documents
  5. Doro R., Laszlo B., Martella V., Leshem E., Gentsch J., Parashar U., et al. Review of global rotavirus strain prevalence data from six years post vaccine licensure surveillance: is there evidence of strain selection from vaccine pressure? Infect. Genet. Evol. 2014; 28: 446–61. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2014.08.017
  6. Zhou X., Wang Y.H., Ghosh S., Tang W.F., Pang B.B., Liu M.Q., et al. Genomic characterization of G3P[6], G4P[6] and G4P[8] human rotaviruses from Wuhan, China: Evidence for interspecies transmission and reassortment events. Infect. Genet. Evol. 2015; 33: 55–71. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2015.04.010
  7. Salamunova S., Jackova A., Csank T., Mandelik R., Novotny J., Beckova Z., et al. Genetic variability of pig and human rotavirus group A isolates from Slovakia. Arch. Virol. 2020; 165(2): 463–70. https://doi.org/10.1007/s00705-019-04504-6
  8. Doro R., Farkas S.L., Martella V., Banyai K. Zoonotic transmission of rotavirus: surveillance and control. Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 2015; 13(11): 1337–50. https://doi.org/10.1586/14787210.2015.1089171
  9. Velasquez D.E., Jiang B. Evolution of P[8], P[4], and P[6] VP8* genes of human rotaviruses globally reported during 1974 and 2017: possible implications for rotavirus vaccines in development. Hum. Vaccin. Immunother. 2019; 15(12): 3003–8. https://doi.org/10.1080/21645515.2019.1619400
  10. Hungerford D., Vivancos R., Read J.M., Iturriza-Gomicronmara M., French N., Cunliffe N.A. Rotavirus vaccine impact and socioeconomic deprivation: an interrupted time-series analysis of gastrointestinal disease outcomes across primary and secondary care in the UK. BMC Med. 2018; 16(1): 10. https://doi.org/10.1186/s12916-017-0989-z
  11. Freeman M.M., Kerin T., Hull J., McCaustland K., Gentsch J. Enhancement of detection and quantification of rotavirus in stool using a modified real-time RT-PCR assay. J. Med. Virol. 2008; 80(8): 1489–96. https://doi.org/10.1002/jmv.21228
  12. Kiseleva V., Faizuloev E., Meskina E., Marova A., Oksanich A., Samartseva T., et al. Molecular-genetic characterization of human rotavirus a strains circulating in Moscow, Russia (2009- 2014). Virol. Sin. 2018; 33(4): 304–13. https://doi.org/10.1007/s12250-018-0043-0
  13. Iturriza-Gomara M., Isherwood B., Desselberger U., Gray J. Reassortment in vivo: driving force for diversity of human rotavirus strains isolated in the United Kingdom between 1995 and 1999. J. Virol. 2001; 75(8): 3696–705. https://doi.org/10.1128/JVI.75.8.3696-3705.2001
  14. Simmonds M.K., Armah G., Asmah R., Banerjee I., Damanka S., Esona M., et al. New oligonucleotide primers for P-typing of rotavirus strains: Strategies for typing previously untypeable strains. J. Clin. Virol. 2008; 42(4): 368–73. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2008.02.011
  15. Froussard P. rPCR: a powerful tool for random amplification of whole RNA sequences. PCR Methods Appl. 1993; 2(3): 185–90. https://doi.org/10.1101/gr.2.3.185
  16. Li H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 2018; 34(18): 3094–100. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty191
  17. Maes P., Matthijnssens J., Rahman M., Van Ranst M. RotaC: a web-based tool for the complete genome classification of group A rotaviruses. BMC Microbiol. 2009; 9: 238. https://doi.org/10.1186/1471-2180-9-238
  18. Faizuloev E., Mintaev R., Petrusha O., Marova A., Smirnova D., Ammour Y., et al. New approach to genetic characterization of group A rotaviruses by the nanopore sequencing method. J. Virol. Methods. 2021; 292: 114114. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2021.114114
  19. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Mol. Biol. Evol. 2018; 35(6): 1547–9. https://doi.org/10.1093/molbev/msy096
  20. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 1980; 16(2): 111–20. https://doi.org/10.1007/BF01731581
  21. Cowley D., Donato C.M., Roczo-Farkas S., Kirkwood C.D. Emergence of a novel equine-like G3P[8] inter-genogroup reassortant rotavirus strain associated with gastroenteritis in Australian children. J. Gen. Virol. 2016; 97(2): 403–10. https://doi.org/10.1099/jgv.0.000352
  22. Arana A., Montes M., Jere K.C., Alkorta M., Iturriza-Gomara M., Cilla G. Emergence and spread of G3P[8] rotaviruses possessing an equine-like VP7 and a DS-1-like genetic backbone in the Basque Country (North of Spain), 2015. Infect. Genet. Evol. 2016; 44: 137–44. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2016.06.048
  23. Doro R., Marton S., Bartokne A.H., Lengyel G., Agocs Z., Jakab F., et al. Equine-like G3 rotavirus in Hungary, 2015 — Is it a novel intergenogroup reassortant pandemic strain? Acta. Microbiol. Immunol. Hung. 2016; 63(2): 243–55. https://doi.org/10.1556/030.63.2016.2.8
  24. Guerra S.F.S., Soares L.S., Lobo P.S., Penha Junior E.T., Sousa Junior E.C., Bezerra D.A.M., et al. Detection of a novel equinelike G3 rotavirus associated with acute gastroenteritis in Brazil. J. Gen. Virol. 2016; 97(12): 3131–8. https://doi.org/10.1099/jgv.0.000626
  25. Komoto S., Tacharoenmuang R., Guntapong R., Ide T., Haga K., Katayama K., et al. Emergence and characterization of unusual DS-1-Like G1P[8] rotavirus strains in children with diarrhea in Thailand. PLoS One. 2015; 10(11): e0141739. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141739
  26. Kaira A.N., Fayzuloyev E.B., Lavrov V.F., Svitich O.A., Solomay T.V., Nikonova A.A., et al. Epidemiological trends of morbidity and issues of rotavirus vaccination at the present stage. Sanitary Doctor. 2020; 6: 16–25. https://doi.org/0.33920/med-08-2006-02
  27. Ivashechkin A.A., Yuzhakov A.G., Grebennikova T.V., Yuzhakova K.A., Kulikova N.Y., Kisteneva L.B., et al. Genetic diversity of group A rotaviruses in Moscow in 2018-2019. Arch. Virol. 2020; 165(3): 691–702. https://doi.org/10.1007/s00705-020-04534-5
  28. Yuzhakov G., Yuzhakova K., Kulikova N., Kisteneva L., Cherepushkin S., Smetanina S., et al. Prevalence and genetic diversity of group a rotavirus genotypes in Moscow (2019–2020). Pathogens. 2021; 10: 674. https://doi.org/10.3390/pathogens10060674
  29. Sashina T.A., Morozova O.V., Epifanova N.V., Novikova N.A. Predominance of new G9P[8] rotaviruses closely related to Turkish strains in Nizhny Novgorod (Russia). Arch. Virol. 2017; 162(8): 2387–92. https://doi.org/10.1007/s00705-017-3364-7
  30. Новикова Н.А., Сашина Т.A., Солнцев Л.А., Епифанова Н.В., Кашников A.Ю., Погодина Л.В. и др. Проявление эпидемического процесса ротавирусного процесса в Нижнем Новгороде в предвакцинальный период. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 94(5): 46–52. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-5-46-52
  31. Денисюк Н.Б. Генетическая характеристика ротавирусов группы А, циркулирующих в Оренбургском регионе в сезон 2016–2017 гг. Детские инфекции. 2017; 16(4): 42–5. https://doi.org/10.22627/2072-8107-2017-16-4-42-45
  32. Мескина Е.Р., Ушакова А.Ю., Файзулоев Е.Б., Бахтояров Г.Н., Киселева В.В. Сравнительная характеристика гастроэнтерита, вызванного ротавирусами генотипов G4P[8] и G9P[8], у детей, госпитализированных в стационар г. Москвы (эпидсезон 2012–2013 гг.). Инфекционные болезни. 2017; 15(1): 23–8. https://doi.org/10.20953/1729-9225-2017-1-23-28
  33. Katz E.M., Esona M.D., Betrapally N.S., De La Cruz De Leon L.A., Neira Y.R., Rey G.J., et al. Whole-gene analysis of inter-genogroup reassortant rotaviruses from the Dominican Republic: Emergence of equine-like G3 strains and evidence of their reassortment with locally-circulating strains. Virology. 2019; 534: 114–31. https://doi.org/10.1016/j.virol.2019.06.007
  34. Fujii Y., Oda M., Somura Y., Shinkai T. Molecular characteristics of novel mono-reassortant G9P[8] rotavirus a strains possessing the NSP4 gene of the E2 genotype detected in Tokyo, Japan. Jpn J. Infect. Dis. 2020; 73(1): 26–35. https://doi.org/10.7883/yoken.JJID.2019.211
  35. McDonald S.M., Matthijnssens J., McAllen J.K., Hine E., Overton L., Wang S., et al. Evolutionary dynamics of human rotaviruses: balancing reassortment with preferred genome constellations. PLoS Pathog. 2009; 5(10): e1000634. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000634
  36. Papp H., Borzak R., Farkas S., Kisfali P., Lengyel G., Molnar P., et al. Zoonotic transmission of reassortant porcine G4P[6] rotaviruses in Hungarian pediatric patients identified sporadically over a 15 year period. Infect. Genet. Evol. 2013; 19: 71–80. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2013.06.013
  37. Esona M.D., Geyer A., Banyai K., Page N., Aminu M., Armah G.E., et al. Novel human rotavirus genotype G5P[7] from child with diarrhea, Cameroon. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15(1): 83–6. https://doi.org/10.3201/eid1501.080899
  38. Wang Y.H., Kobayashi N., Nagashima S., Zhou X., Ghosh S., Peng J.S., et al. Full genomic analysis of a porcine-bovine reassortant G4P[6] rotavirus strain R479 isolated from an infant in China. J. Med. Virol. 2010; 82(6): 1094–102. https://doi.org/10.1002/jmv.21760
  39. Zeller M., Patton J.T., Heylen E., De Coster S., Ciarlet M., Van Ranst M., et al. Genetic analyses reveal differences in the VP7 and VP4 antigenic epitopes between human rotaviruses circulating in Belgium and rotaviruses in Rotarix and RotaTeq. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(3): 966–76. https://doi.org/10.1128/JCM.05590-11
  40. Imagawa T., Saito M., Yamamoto D., Saito-Obata M., Masago Y., Ablola A.C., et al. Genetic diversity of species A rotaviruses detected in clinical and environmental samples, including porcine-like rotaviruses from hospitalized children in the Philippines. Infect. Genet. Evol. 2020; 85: 104465. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2020.104465

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Распределение G/[P]-генотипов РВА, выделенных из 131 клинического образца в 2015–2020 гг. GxP[8]Ix — частично типированные РВА; Mix — смешанные генотипы; Nt — нетипированные образцы.

Скачать (69KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Распространение G/[P]-генотипов, выявленных в Москве за 10 лет наблюдения (2009–2020 гг.) [12]. Nt — нетипированные образцы

Скачать (48KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Филогенетические деревья, основанные на секвенированных генах белков VP4 и VP7 нового штамма G3P[8]I2. ▲ — сегменты, секвенированные по Сэнгеру; ♦ — ген, секвенированный методом НПС; ∆ — ген белка VP7 РВА лошади. Для обозначения штаммов использовался идентификационный номер GenBank, названия штаммов и G/[P]-генотип.

Скачать (704KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Филогенетические деревья, основанные на секвенированных генах белков VP4, VP7 и VP6 РВА, штамма G4P[6]I1 (отмечены знаком ♦), референсных штаммах (Wa, AU-1, DS-1) представителей трёх эволюционных линий РВА (отмечены знаком ○) и генов РВА свиного происхождения, наиболее филогенетически близких генам штамма Moscow-1P/2015 согласно BLAST-анализу. Для обозначения штаммов использовался номер GenBank, название штамма и G/[P]-генотип

Скачать (200KB)
Метаданные

© Петруша О.А., Корчевая Е.Р., Минтаев Р.Р., Исаков И.Ю., Никонова А.А., Мескина Е.Р., Ушакова А.Ю., Хадисова М.К., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах