Взаимодействие возбудителей сапронозов с клетками наземного растения воробейника краснокорневого

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Существенную роль в экологии возбудителей сапронозов Yersinia pseudotuberculosis и Listeria monocytogenes и в эпидемиологии вызываемых ими инфекций играют наземные растения, употребляемые в пищу. Эти микроорганизмы часто обнаруживаются на растительных субстратах, они размножаются на разных овощных культурах и корнеплодах. В связи с этим актуально изучение жизнеспособности и биологической активности Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes при контакте с разными наземными растениями, в том числе с теми, которые не употребляются в пищу, но используются для лечения.
Цель исследования — изучение взаимодействия возбудителей сапронозов Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes с каллусными культурами наземного растения воробейника краснокорневого (Lithospermum erythrorhizon Siebold et Zucc).
Материалы и методы. В исследование включены штаммы бактерий Y. pseudotuberculosis 512 1b серотипа, рYV+, 82MD+ и L. monocytogenes NCTC (4b) 10527 из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова, а также культура клеток из корней воробейника краснокорневого, линия ВК-39 (Коллекция ФНЦ биоразнообразия ДВО РАН).
Перед исследованиями Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes культивировали на питательном агаре при рН 7,1–7,2 в течение 18–20 ч. Готовили рабочее разведение микроорганизмов (106 микробных клеток на 1 мл) и наносили их в дозе 100 мкл на поверхность каллусов растений. В динамике через 3 и 14 сут брали пробы материала и готовили их для сканирующей электронной микроскопии.
Результаты. Уже в течение 3–14 сут после начала эксперимента Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes образовывали биоплёнки на поверхности клеток исследуемых растений. При этом впервые обнаружено, что Y. pseudotuberculosis разрушали компоненты оболочки клеток. Заключение. Новые данные, полученные при исследовании, расширяют представления о средах и формах обитания, а также потенциале патогенности возбудителей сапронозов в окружающей среде.

Полный текст

Введение

К настоящему времени имеются данные о способности возбудителей сапронозов [1], в частности Yersinia pseudotuberculosis [2], Listeria monocytogenes [3], а также зоонозов [4] использовать разные среды обитания. Значительную роль в экологии этих микроорганизмов и в эпидемиологии вызываемых ими инфекций играют растения [5][6]. Анализ многочисленных вспышек, вызванных Y. pseudotuberculosis [7] и Y. enterocolitica [8], показал, что чаще всего факторами передачи этих бактерий человеку являются овощи и корнеплоды, а также блюда, приготовленные из них, в которых они размножаются и накапливаются в значительных количествах, поддерживая высокую степень вирулентности.

Имеются сведения о том, что сок многих овощей, например, моркови, свёклы, капусты, содержит аттрактанты для Y. pseudotuberculosis [9]. На этом основании авторами сделано предположение о роли хемотаксиса названных бактерий при обсеменении ими овощей. В экспериментах с помощью сканирующей электронной микроскопии выявлено, что Yersinia и некоторые другие энтеробактерии формируют микроколонии на поверхности кусочков корма, яичной скорлупы, листьев капусты [10]. Также выявлена способность этих бактерий формировать биоплёнки на поверхности каллусов женьшеня — Panax ginseng C.A. Mey штамм R-1 [11]. Исследования в этом направлении своевременны и актуальны.

В представленной статье основное внимание сосредоточено на изучении взаимодействия бактерий — возбудителей сапронозов — с каллусами наземного растения воробейника краснокорневого (Lithospermum erythrorhizon) — ВК. Это травянистое многолетнее растение распространено на Дальнем Востоке России, в Приморье, Приамурье, а также в Китае, Монголии, Японии и Корее. В лечебных целях применяются его корни, листья и плоды.

Основными биоактивными метаболитами в корнях ВК являются шиконин и его производные [12][13]. Согласно многочисленным исследованиям, шиконин эффективен при воспалениях, лечении ран, а также есть сведения о его выраженном противораковом эффекте в отношении различных типов опухолей вследствие ингибирования пролиферации клеток и их миграций, индукции апоптоза, автофагии, некроза и значимом антиоксидантном действии [14][15].

Известно о противогрибковом [16] и противовирусном [17] действии экстрактов из ВК. Культура клеток из корней ВК-39 продуцирует эфиры шиконина, на основе которых производят шикониновое масло. Оно эффективно ингибирует грамположительную микрофлору (Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. lutea, Bacillus subtilis и др.), обладает противогрибковым действием, является эффективным нестероидным противовоспалительным препаратом, т.к. нормализует продукцию ключевых медиаторов воспаления — интерлейкинов-1 и -2, γ-интерферона, снижает отёк и сосудистую проницаемость в очаге острого воспаления. Антимикробное и противовоспалительное действие этого средства сочетается с его способностью регенерировать эпителий после различных поражений.

Имеющиеся данные свидетельствуют об актуальности исследований в этом направлении для расширения и углубления познания механизмов, используемых патогенными для человека и животных бактериями — возбудителями сапронозов — при обитании их в разных средах, в частности, клетках наземных растений, а также создания на этой основе новых диагностических и лечебных препаратов [18–21].

Цель исследования: изучение взаимодействия возбудителей сапронозов Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes с каллусными культурами ВК.

Материалы и методы

В работе использованы штаммы бактерий Y. pseudotuberculosis 512 1b серотипа, pYV+, 82MD+ и L. monocytogenes NCTC (4b) 10527, изолированные от больных (Коллекция НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова) и культура клеток из корней ВК, линия ВК-39 (Коллекция ФНЦ биоразнообразия ДВО РАН).

Перед исследованиями Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes культивировали на питательном агаре при рН 7,1–7,2 в течение 18–20 ч. Готовили рабочее разведение микроорганизмов (106 микробных клеток на 1 мл) и наносили их на поверхность каллусов растений в дозе 100 мкл. В динамике через 3 и 14 сут брали пробы материала и готовили их для сканирующей электронной микроскопии. Каллусы ВК культивировали на агаризованной питательной среде W0, содержащей дополнительно 2 мг/л кинетина, 0,2 мг/л индол-3-уксусной кислоты и 0,25 мг/л CuSO4, в пробирках в темноте при 25 ± 1ºС [14]. Через 30 сут каллусы переносили на свежую аналогичную питательную среду, затем через неделю добавляли исследуемые бактерии. Начальная масса каллусов составила 0,20–0,22 г. Условия культивирования не меняли до конца эксперимента.

В динамике через 3 и 14 сут после добавления бактерий брали пробы материала для сканирующей электронной микроскопии. Образцы фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде, приготовленном на 0,1 М какодилатном буфере рН 7,2 в течение 24 ч. Промывали пробы в том же буфере в течение 24 ч. Затем дополнительно фиксировали их в 1% ОsО₄, приготовленном на дистиллированной воде (20 мин), и промывали в дистиллированной воде в течение 5 ч. Пробы обезвоживали с использованием установки «BAL-TEC CPD 030» («Bal-Tec»), закрепляли на столиках для сканирующей электронной микроскопии, используя двустороннюю ленту, и напыляли хромом толщиной 10–15 нм («Q150 TES», «Quorum Technologies»). Приготовленные препараты анализировали с использованием сканирующего электронного микроскопа «Evo40» («Carl Zeiss»). Разгонное напряжение составило 29 кВ.

Результаты

С помощью сканирующей электронной микроскопии исследован характер взаимодействия возбудителей сапронозов Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes с каллусными культурами ВК.

В контроле клетки культуры на протяжении всего периода наблюдения (14 сут) имели целостную поверхность без признаков разрушения (рисунок, а).

Через 3 сут после заражения клеток ВК Y. pseudotuberculosis на поверхности растительных клеток бактерии формировали биоплёнку, состоящую из палочек длиной до 2,5 мкм, объединённых длинными контактными отростками (рисунок, г, д). Часть микроорганизмов имела неровную поверхность, что отражало начальный этап их фрагментации в ходе формирования бесструктурного матрикса — компонента биоплёнки. Через 14 сут после начала эксперимента зрелая биоплёнка покрывала бóльшую часть поверхности клеток ВК. Под действием бактерий нарушалась целостность оболочек растительных клеток, в результате чего обнажалась сеть полисахаридных волокон, входящих в состав клеточных стенок. Бактериальная биоплёнка была представлена бесструктурным матриксом и погружёнными в него бактериальными клетками (рисунок, д), длина некоторых экземпляров достигала 8 мкм.

На 3-и сутки после внесения L. monocytogenes в культуру клеток ВК на поверхности растений имелись участки, покрытые формирующейся бактериальной биоплёнкой (рисунок, б). Группы коротких (длиной около 1 мкм) палочек были соединены длинными контактными отростками, формирующими сетчатые структуры на поверхности клеток ВК. На 14-е сутки после заражения поверхность растительных клеток покрывала зрелая биоплёнка, состоящая из тяжей бесструктурного матрикса и бактериальных клеток (рисунок, в). При этом поверхность растительных клеток выглядела целостной, без признаков разрушения.

Сканирующая электронная микроскопия возбудителей сапронозов Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes при взаимодействии с каллусными культурами ВК.

а — стерильная культура клеток ВК, контрольный образец (14-е сутки после начала эксперимента); б — формирование биоплёнки L. monocytogenes на поверхности клеток культуры (3-и сутки), бактериальные клетки (черная стрелка) объединены сетью контактных отростков (белые стрелки); в — L. monocytogenes (черная стрелка) погружены в бесструктурный матрикс (белая стрелка), покрывающий поверхность растительных клеток (14-е сутки); г — биоплёнка, образованная Y. pseudotuberculosis на поверхности растительных клеток (3-и сутки), бактерии (чёрные стрелки) объединены контактными отростками (белая стрелка); д, е — биоплёнка Y. pseudotuberculosis (черные стрелки) на поверхности растительных клеток (14-е сутки), бактериальные клетки погружены в аморфный матрикс (белые стрелки).

Scanning electron microscopy of the causative agents of sapronosis Y. pseudotuberculosis and L. monocytogenes in interaction with callus cultures of the Lithospermum erythrorhizon.

a — sterile culture of L. erythrorhizon cells, control sample (14 days) after the start of the experiment; b — formation of L. monocytogenes biofilm on the surface of cultured cells (3 days), bacterial cells (black arrow) are united by a network of contact projections (white arrows); c — L. monocytogenes (black arrow) immersed in a structureless matrix (white arrow) covering the surface of plant cells (14 days); d — biofilm formed by Y. pseudotuberculosis on the surface of L. erythrorhizon cultured cells, the third day after the start of the experiment; bacteria (black arrows) are united by contact projections (white arrow); e, f — biofilm of Y. pseudotuberculosis (black arrows) on the surface of L. erythrorhizon cells (14 days), bacterial cells are immersed in an amorphous matrix (white arrows).

 

Обсуждение

В настоящее время активно развиваются исследования, касающиеся мест и форм обитания возбудителей инфекционных заболеваний, их жизнеспособности, биологической активности и вирулентности. Известно, что Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes относятся к возбудителям сапронозов. Названные микроорганизмы обнаружены в разных наземных объектах, в том числе в растениях, употребляемых в пищу. Имеющиеся данные о важной роли растений в развитии патологии человека и животных не вызывают сомнений и требуют дальнейшего изучения.

Основными результатами проведённого исследования являются следующие:

1. Получены новые данные о способности возбудителей сапронозов Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes длительный период времени обитать на клетках ВК, не употребляемого в пищу, но используемого для получения лечебных и профилактических препаратов.

2. Установлено, что Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes образовывали биоплёнки на поверхности каллусов ВК.

3. Обнаружено, что Y. pseudotuberculosis, в отличие от L. monocytogenes, разрушали компоненты оболочки растительных клеток, что, очевидно, может способствовать проникновению бактерий внутрь этих клеток.

Заключение

Новые сведения о жизнеспособности возбудителей сапронозов в наземных растениях, применяемых, в частности, для лечения, расширяют представление о биологической активности этих микроорганизмов и требуют дальнейших исследований.

×

Об авторах

Н. Ф. Тимченко

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова

Автор, ответственный за переписку.
Email: ntimch@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6051-292X

Тимченко Нэлли Федоровна - д.м.н., проф., в.н.с.

Владивосток

Россия

М. Г. Елисейкина

Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5361-6261

Елисейкина Марина Геннадьевна — к.б.н., с.н.с.

Владивосток

Россия

Г. К. Чернодед

Федеральный научный центр биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии Дальневосточного отделения Российской академии наук

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7570-2881

Чернодед Галина Кирилловна - н.с.

Владивосток

Россия

О. В. Грищенко

Федеральный научный центр биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии Дальневосточного отделения Российской академии наук

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0123-7195

Грищенко Ольга Вадимовна - н.с.

Владивосток

Россия

А. В. Раков

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1917-9189

Раков Алексей Владимирович - к.м.н., с.н.с.

Владивосток

Россия

М. Ю. Щелканов

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова; Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8610-7623

Щелканов Михаил Юрьевич - д.б.н., доцент, директор

Владивосток

Россия

Список литературы

  1. Терских В.И. Сапронозы (о болезнях людей и животных, вызываемых микробами, способными размножаться вне организма во внешней среде, являющейся для них местом обитания). Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1958; 35(8): 118–20.
  2. Сомов Г.П. Еще раз о сапронозах. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1985; 62(5): 98–104.
  3. Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П., Долматова Л.С., Сомова-Исачкова Л.М. Токсины Yersinia pseudotuberculosis. Владивосток; 2004.
  4. Erickson M.C., Jue-Yin L., Payton A.S., Cook P.W., Bakker H.C.D., Bautista J., et al. Survival of Salmonella enterica and Escherichia coli 0157:H7 Sprayed onto the Foliage of Field-grown cabbage plant. J. Food Prot. 2019; 82(3): 479–85. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-18-326
  5. Пушкарева В.И., Ермолаева С.А. Экспериментальное обоснование роли растений в эпидемиологии сапронозных инфекций. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95(5): 113–21. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-5-113-121
  6. Пушкарева В.И. Бактериальные патогены: миграция от их естественных резервуаров человеку. Успехи современной биологии. 2019; 139(5): 457–65. https://doi.org/10.1134/S0042132419040070
  7. Nuorti J.P., Niskanen T., Hallanvuo S., Mikkola J., Kela E., Hatakka M., et al. A widespread outbreak of Yersinia pseudotuberculosis 03 infection from iceberg lettuce. J. Infect. Dis. 2004; 189(5): 766–74. https://doi.org/10.1086/381766
  8. Espenhain L., Riess M., Müller L., Colombe S., Ethelberg S., Litrup E., et al. Cross-border outbreak of Yersinia enterocolitica 03 associated with imported fresh spinach, Sweden and Denmark, March 2019. Euro Surveill. 2019; 24(24): 1900368. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2019.24.24.1900368
  9. Венедиктов В.С., Тимченко Н.Ф., Антоненко Ф.Ф., Степаненко В.И. Хемотаксис Yersinia pseudotuberculosis как механизм поиска тканевых мишеней организма хозяина. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1988; 65(5): 77–81.
  10. Павлова И.Б., Ленченко Е.М. Электронно-микроскопическое исследование патогенных бактерий на объектах внешней среды. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1998; 55(5): 13–7.
  11. Тимченко Н.Ф., Елисейкина М.Г., Чернодед Г.К., Грищенко О.В., Булгаков В.П. Взаимодействия Yersinia pseudotuberculosis с каллусами Panax ginseng C.A. Mey. Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2019; (3): 4–7. https://doi.org/10.5281/zenodo.3559604
  12. Yaron S., Römling V. Biofilm formation by enteric pathogens and its role in plant colonization and persistence. Microb. Biotechnol. 2014; 7(6): 496–516. https://doi.org/10.1111/1751-7915.12186
  13. Найда Н.М., Опалихина В.А. Морфобиологические особенности воробейника краснокорневого в условиях Ленинградской области. Вестник студенческого научного общества. 2018; 9(1): 63–4.
  14. Журавлев Ю.Н., Булгаков В.П., Писецкая Н.Ф., Козыренко М.М., Старун Т.В., Артюков А.А. и др. Штамм культивируемых клеток растений Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc — продуцент шиконина. Патент РФ №1707073; 1992.
  15. Bulgakov V.P., Kozyrenko M.M., Fedoreyev S.A., Mischenko N.P., Denisenko V.A., Zvereva L.V., et al. Shikonin production by p-fluorophenylalanine resistant cells of Lithohttps://doi.org/10.1016/s0367-326x(00)00343-9
  16. Булгаков В.П., Федореев С.А., Журавлев Ю.Н. Биотехнология – здоровью человека: научные достижения и первые шаги инноваций на Дальнем Востоке. Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2004; (3): 93–8.
  17. Guo C., He J., Song X., Wang M., Jiang P., Li Y., et al. Pharmacological properties and derivatives of shikonin — A review in recent years. Pharmacol. Res. 2019; 149: 104463. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2019.104463
  18. Таран Л.М., Слободенюк Е.В., Башаров А.Я. Фармакологические свойства шиконина и его производных. Дальневосточный медицинский журнал. 2015; (1): 98–103.
  19. Sasaki K., Yoshiaki F., Abe H. The anti-candida activity of shikonin. Yakugaki Zasshi. J. Pharm. Soc. Japan. 2000; 120(6): 587–9. https://doi.org/10.1248/yakushi1947.120.6_587
  20. Yan Y., Tan F., Miao H., Wang H., Cao Y. Effect of shikonin against Candida albicans biofilms. Front. Microbiol. 2019; 10: 1085. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01085
  21. Zhang Y., Han H., Sun L., Qiu H., Lin H., Yu L., et al. Antiviral activity of shikonin ester derivative PPM-034 against enterovirus 71 in vitro. Braz. J. Med. Biol. Res. 2017; 50(10): e6586. https://doi.org/10.1590/414-431X20176586

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Сканирующая электронная микроскопия возбудителей сапронозов Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes при взаимодействии с каллусными культурами ВК.

Скачать (139KB)
Метаданные

© Тимченко Н.Ф., Елисейкина М.Г., Чернодед Г.К., Грищенко О.В., Раков А.В., Щелканов М.Ю., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах