Формирование специфического иммунитета у лабораторных животных после одновременной вакцинации против сезонного гриппа и COVID-19

Полный текст

Введение

Грипп и COVID-19 представляют собой респираторные вирусные заболевания, которые могут быть клинически неотличимы и, как правило, опасны для жизни в основном одних и тех же групп населения — пожилых людей и людей, страдающих хроническими заболеваниями. Симптомы COVID-19 в большинстве случаев протекают легко и напоминают простуду. Поскольку и грипп, и COVID-19 — респираторные вирусные заболевания, их пик активности может приходиться на один и тот же период года — зимние месяцы в странах с умеренным климатом. В случае совпадения с сезоном гриппа клиническая дифференциальная диагностика гриппа и COVID-19 может быть затруднительна, что, в свою очередь, может приводить к несвоевременности принятия необходимых мер для борьбы с пандемией SARS-CoV-2 [1].

Во время продолжающейся или рецидивирующей циркуляции SARS-CoV-2 одновременно с вирусом гриппа (ВГ) в осенне-зимний сезон вакцинация против гриппа может снизить как распространённость самого гриппа, так и количество случаев с симптомами, которые можно спутать с симптомами COVID-19. Предотвращение и снижение тяжести симптомов гриппа, уменьшение количества амбулаторных гриппоподобных заболеваний в целом, количества госпитализаций и реанимационных мероприятий за счёт вакцинации против гриппа также может снизить нагрузку на систему здравоохранения [1][2]. Следует также отметить, что диагностические тесты, а также человеческие ресурсы ограничены. Неполная и несвоевременная диагностика, в том числе дифференциальная, будет значительно воздействовать на работу системы здравоохранения в плане принятия адекватных противоэпидемических мер и создавать напряжённость в работе лечебных учреждений, а также повышать вероятность внутрибольничной передачи инфекции.

Исходя из приведённых выше соображений, большинство медицинских работников выступают за расширение программ вакцинации против гриппа, т.к. увеличение охвата населения вакцинацией против сезонного гриппа может помочь организации диагностических и лечебных мероприятий в период продолжающейся пандемии SARS-CoV-2, позволив упростить дифференциальную диагностику, а также снизить нагрузку как на систему здравоохранения в целом, так и на отделения интенсивной терапии в частности [1, 3]. Так, например, в 2002 г. во время вспышки «тяжёлого острого респираторного синдрома», вызванного SARS-CoV-1, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала активизировать кампанию по вакцинации против гриппа, ориентированную на группы риска, чтобы иметь возможность быстро дифференцировать эти инфекции и принимать более точные и эффективные меры противодействия [4]. Руководство Центра по контролю и профилактике заболеваний США в период пандемии SARS-CoV-2 настоятельно рекомендует медицинским работникам использовать любую возможность для проведения вакцинации против гриппа до начала сезона [5].

Однако некоторое время в научном сообществе и в средствах массовой информации велись дискуссии по поводу взаимосвязи между вакцинацией против гриппа и COVID-19. Исследование, проведённое G.G. Wolff, «выявило» повышенный риск заболевания коронавирусом у лиц, вакцинированных против гриппа [6]. Он предположил, что вакцинация против гриппа снижает вероятность заражения гриппом, но при этом отсутствует стимуляция ВГ врождённого иммунитета, что и повышает, в итоге, риск заболевания COVID-19. Исследования G.G. Wolff, и в особенности его неожиданные выводы, привели не только к активному обсуждению, но и к исследованию данного «феномена». Ретроспективный статистический анализ взаимосвязи между вакцинацией против гриппа и другими респираторными, в том числе коронавирусными, заболеваниями сезонов 2010–2011 гг. и 2016–2017 гг. в Канаде [7], а также сезона COVID 2019/2020 в Италии [8] опровергли выводы, сделанные G.G. Wolff. Также было продемонстрировано отсутствие связи между вакцинацией против гриппа и COVID-19 в исследовании, в котором изучались связи между вакцинацией против гриппа и заболеваемостью SARS-CoV-2 у медицинских работников [5]. Более того, M.D. Riccio и соавт., проведя системный анализ опубликованных данных, обнаружили обратную зависимость, которая была несколько неожиданной, учитывая, что гриппозные вакцины не предназначены для защиты от SARS-CoV-2 [3].

Китайскими и канадскими учёными путём математического моделирования была протестирована гипотеза о том, что кампания массовой вакцинации против гриппа будет иметь положительное влияние на организацию медицинской помощи и результаты лечения пациентов с неспецифическими симптомами и гриппоподобными жалобами с риском развития COVID-19 или других респираторных инфекций. Результаты показали, что увеличение уровня охвата вакцинацией против гриппа до оптимального порога задолго до начала сезона будет способствовать усилиям по сдерживанию вспышки COVID-19 в плане быстрой постановки диагноза и принятия адекватных противоэпидемических мер [1].

Многие авторы сходятся во мнении, что исследования зависимости заболеваемости COVID-19 от вакцинации против сезонного гриппа следует продолжать, чтобы подтвердить предварительные выводы и изучить их валидность в отношении различных групп населения [3][5][8].

Существует ещё одна проблема, которая также требует исследования оценки влияния вакцинации против гриппа в период не только пандемии COVID-19, но и в последующие периоды. Проведённый китайскими учёными метаанализ опубликованных данных показал, что распространённость коинфекции у пациентов с COVID-19 варьировала в разных исследованиях, однако могла достигать 50% среди летальных случаев. Сопутствующие патогены включали как бактерии, так и вирусы. Вирус гриппа A был одним из наиболее распространённых среди вирусов, которые сопутствовали коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 [9][10]. Проведённые экспериментальные работы по одновременному заражению хорьков ВГ, штамм A1N1, и вирусом SARS-CoV-2 продемонстрировали значительное утяжеление инфекционного процесса и увеличение смертности [11].

Также было обнаружено, что сопутствующее инфицирование ВГ также может приводить к ложноотрицательному результату на rRT-PCR, особенно при тяжёлой форме острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 [9]. Диагностирование инфекции SARS-CoV-2 важно, поскольку позволяет принимать необходимые меры эпидемиологического контроля и использовать эффективную противовирусную терапию в отношении SARS-CoV-2.

Таким образом, сложно переоценить значимость мероприятий по вакцинации населения против сезонного гриппа в период пандемии COVID-19. Максимальный уровень охвата вакцинацией против сезонного гриппа позволит упростить диагностику и уменьшить вероятность коинфекции ВГ в период пандемии SARS-CoV-2-инфекции.

Целью настоящей работы было изучение взаимного влияния вакцин для профилактики гриппа и SARS-CoV-2 российского производства на формирование специфического поствакцинального иммунитета при одновременном введении лабораторным животным.

Материалы и методы

В исследовании использовали мышей линии BALB/c (гаплотип Н-2^d) обоего пола массой 16–18 г. Животные были получены из питомника «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий ФМБА.

В исследовании использовали зарегистрированные на территории России вакцину для профилактики гриппа трёхвалентную инактивированную (Флю-М; СпбНИИВС ФМБА России), содержащую антигены ВГ типа А (H1N1, H3N2) и типа В; и вакцину для профилактики COVID-19 инактивированную, цельновирионную (КовиВак; ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН). В качестве контроля была использована «Вода для инъекций» («Микроген»).

Животные были разделены на группы по 20 мышей. Иммунизацию животных проводили внутримышечно (бедренная мышца) в дозах, рекомендованных производителями соответствующих вакцин. Животных вакцинировали препаратами КовиВак и/или Флю-М дважды с интервалом 14 сут для проведения сравнительных исследований иммунного ответа и оценки взаимного влияния препаратов при одновременном введении. При иммунизации двумя препаратами их вводили в разные конечности. Животным из группы контроля на 0-е и 14-е сутки эксперимента вводили воду для инъекций в объёме 0,5 мл.

У животных всех групп перед проведением 1-й (на 0-е сутки) и 2-й иммунизации (на 14-е сутки), а также на 28-е сутки эксперимента (14-е сутки после 2-й иммунизации) производили забор крови из глазной вены. Образцы крови после центрифугирования разливали по пробиркам и хранили при –70°С для последующего одномоментного исследования. Специфические антитела (АТ) у иммунизированных животных определяли индивидуально в сыворотке крови каждого животного.

Все процедуры на отдельных мышах проводили в соответствии с Международными принципами «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей» ETS № 123 (Страсбург, 1986), Приказом Минздрава РФ от 01.04.2016 № 199Н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) проводили в соответствии с протоколом ВОЗ [12] по ранее описанной методике [13] с тремя штаммами ВГ: А/H1N1 (Guangdong-Maonan/ SWL1536/2019), А/H3N2 (Hong Kong/2671/2019), B (Washington/02/2019) из рабочей коллекции вирусов НИИВС им. И.И. Мечникова. Для статистической обработки полученные титры специфических АТ переводили в log10 (lg), отрицательный результат (РТГА ≤ 10) приравнивали к 1 lg.

Иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления АТ к SARS-CoV-2 проводили с использованием тест-системы для определения IgG к протеинам N и S (subunit S2) вируса SARS-CoV-2 для лабораторного применения («НПФ Литех») в соответствии с инструкцией разработчика. Для статистической обработки полученный результат переводили в log₁₀ (lg), отрицательный результат (ИФА ≤ 100) приравнивали к 1 lg.

Реакцию нейтрализации (РН) для определения вируснейтрализующих АТ к SARS-CoV-2 проводили с использованием штамма PIK35 SARS-CoV-2 из рабочей коллекции вирусов ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН. Перед проведением анализа готовили двукратные разведения образцов сывороток животных с использованием среды DMEM (ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН). Разведения сывороток смешивали с равными объёмами вирусной суспензии, содержащей 50 ТЦИД₅₀ на лунку. После 1 ч инкубации при 37°C смесь вирус + сыворотка вносили в монослой клеток Vero в 2 повторах. Параллельно контроль клеток Vero инкубировали с аналогичными разведениями неиммунной («–» контроль) и иммунной («+» контроль) мышиных сывороток (ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН). После 5-дневной инкубации при 37°C цитопатическое действие вируса оценивали с помощью светового микроскопа. Титр нейтрализующих АТ рассчитывали согласно методу G. Kärber¹. Для статистической обработки полученный результат переводили в log₂, отрицательный результат (РН ≤ 2) приравнивали к 1 log₂.

РН для определения нейтрализующих АТ к ВГ проводили по ранее описанной методике [13] с 3 штаммами ВГ: А/H1N1 (Guangdong-Maonan/ SWL1536/2019), А/H3N2 (Hong Kong/2671/2019), B (Washington/02/2019) из рабочей коллекции вирусов НИИВС им. И.И. Мечникова. Для дальнейшей статистической обработки полученные титры специфических АТ переводили в lg, отрицательный результат (РН ≤ 20) приравнивали к 1 log₂.

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel 2016». Данные титров специфических АТ по группам животных представлены в виде среднего геометрического (GMT) значения и стандартного отклонения среднего (SD). Достоверность различий сравниваемых величин оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента, парного, с двумя хвостами распределения. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р < 0,05. Корреляцию между вируснейтрализующими АТ с соответствующими специфическими АТ в РТГА и в ИФА оценивали с помощью коэффициента Пирсона (r).

Результаты

Все животные до иммунизации не имели определяемых уровней специфических АТ ни в одном их проводимых тестов.

Формирование соответствующего специфического поствакцинального иммунитета было отмечено во всех группах животных, кроме контрольной. У животных контрольной группы специфические АТ не были обнаружены ни в одном из тестов, ни на одной из точек забора крови. За время наблюдения не погибло ни одно животное.

В РТГА отмечено формирование специфического иммунитета к 3 штаммам ВГ у животных, получивших Флю-М и Флю-М + КовиВак (табл. 1). Через 14 сут после 1-й иммунизации разница между этими группами по уровню АТ к ВГ была статистически недостоверной (p = 0,08–0,16). При сравнении уровня специфических АТ к ВГ после 1-й и 2-й иммунизации в обеих группах выявлено статистически достоверное увеличение уровня АТ ко всем штаммам ВГ, кроме штамма А/H3N2 в группе животных, привитых Флю-М. Следует отметить, что после 1-й иммунизации уровень АТ к штамму ВГ А/H3N2 был достоверно выше, чем уровни АТ к двум другим штаммам ВГ, в обеих группах (р <0,0005). После 2-й иммунизации внутри обеих групп животных титры АТ к штаммам ВГ типа А практически не различались; а АТ к штамму B были достоверно ниже (р < 0,05). После 2-й иммунизации уровни специфических АТ в РТГА были достоверно выше у животных, получивших Флю-М + КовиВак, относительно группы животных, привитых только Флю-М (p = 0,0001–0,002). В группе животных, иммунизированных КовиВак, АТ к ВГ не определялись ни на одной из контрольных точек.

 

В табл. 3 представлены титры специфических АТ к SARS-CoV-2 в ИФА и РН. В результате иммунизации животных отмечено формирование специфических АТ к SARS-CoV-2 в группах, получивших КовиВак и Флю-М + КовиВак. Через 14 дней после 1-й иммунизации разница между уровнями специфических АТ была статистически не достоверна между данными группами в ИФА (p = 0,10) и РН (p = 0,09). При сравнении показателей иммунитета животных внутри групп после 1-й и 2-й иммунизации выявлено статистически достоверное увеличение уровня АТ в ИФА и РН (табл. 3). После 2-й иммунизации разница между уровнями специфических АТ к SARS-CoV-2 в ИФА и РН в группах животных, привитых КовиВак и Флю-М + КовиВак, была статистически недостоверна (p ≥ 0,10). В группе животных, иммунизированных Флю-М, специфические АТ к вирусу SARS-CoV-2 не определялись ни на одной из контрольных точек. Коэффициент корреляции Пирсона между уровнем АТ к SARS-CoV-2 в ИФА и в РН составил 0,89–0,94 в обеих группах животных после 1-й и 2-й вакцинации. Данные значения коэффициента Пирсона соответствуют значимой степени корреляции с достоверностью p < 0,01.

 

Обсуждение

В результате эксперимента, предпринятого для оценки взаимного влияния иммунизации отечественными препаратами КовиВак и Флю-М, выявлено отсутствие негативного влияния как вакцины Флю-М на формирование иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, так и вакцины КовиВак на формирование иммунитета к ВГ при одновременном введении лабораторным животным.

Формирование иммунитета к ВГ выявлено в группах животных КовиВак и Флю-М + КовиВак, что подтверждается наличием специфических АТ в сыворотке крови животных, определённых как в РТГА, так и в РН. Средние показатели АТ к ВГ в обеих группах животных были на достаточно высоком уровне, аналогичном описанному ранее в эксперименте по двукратной вакцинации мышей BALB/c инактивированными отечественными вакцинами для профилактики гриппа [13]. Интересно, что после 1-й иммунизации разница в уровнях специфических АТ как в РТГА, так и в РН между группами, получившими КовиВак и Флю-М + КовиВак, практически отсутствовала. Однако после 2-й иммунизации выявлено очевидное преимущество одновременной иммунизации препаратами КовиВак и Флю-М, что подтверждается статистически достоверной разницей между средними показателями уровней специфических АТ к ВГ как в РТГА, так и в РН. Соотношение между уровнями специфических АТ к 3 штаммам ВГ сохранялось схожим как в динамике в пределах одной группы, так и между группами на соответствующих точках исследования. Уровень АТ к ВГ у обоих штаммов типа А был практически одинаковым и статистически более значим, чем уровень АТ к штамму типа B линии Victoria в обеих группах, как после 1-й, так и после 2-й иммунизации животных. Полученные в данном эксперименте данные сопоставимы с ранее опубликованными [13][14].

Формирование поствакцинального иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 выявлено в группах животных, получивших КовиВак и Флю-М + КовиВак, что подтверждается наличием в сыворотке крови животных специфических АТ, определённых как в ИФА, так и в РН. Интересно, что после 1-й иммунизации кажущаяся разница в уровнях специфических АТ как в ИФА, так и в РН между группами, получившими КовиВак и Флю-М + КовиВак, оказалась статистически недостоверной. А после 2-й иммунизации разница в уровнях АТ как в ИФА, так и в РН между группами отсутствовала.

В результате проведённых исследований выявлено не только отсутствие негативного влияния на иммунитет при одновременной иммунизации вакцинами для профилактики гриппа и COVID-19, но, более того, обнаружено определённое усиливающее влияние на уровень специфических АТ к ВГ, что было несколько неожиданно. Данный феномен, являясь однозначно положительным, требует дальнейшего изучения для выяснения механизмов усиления иммунного ответа к ВГ. Вакцина КовиВак является инактивированной и цельновирионной и содержит гидрооксид алюминия. Учитывая тот факт, что вакцины КовиВак и Флю-М вводились в разные конечности животного, можно предположить отсутствие адъювантного влияния гидроокиси алюминия на формирование специфических АТ к ВГ.

Проведённый несколько ранее эксперимент с одновременной вакцинацией трансгенных мышей вакцинами для профилактики гриппа и COVID-19 продемонстрировал формирование нейтрализующих АТ как к ВГ, штамм A/H1N1, так и к вирусу SARS-CoV-2. Более того, был продемонстрирован протективный эффект при последующем заражении лабораторных животных ВГ и SARS-CoV-2 [11]. В эксперименте L. Bao и соавт. [11], как и в нашем исследовании, применяли инактивированную вакцину для профилактики COVID-19 («PiCoVacc», «Sinovac Biotech Ltd.») и инактивированную вакцину против гриппа («Anflu», «Sinovac Biotech Ltd.»). При сравнении уровней АТ к ВГ, штамм А/H1N1, отмечалась тенденция к более высокому уровню у группы животных, привитых одновременно двумя вакцинами, относительно группы животных, привитых только противогриппозной вакциной. В этом же исследовании изучалось соотношение субпопуляций Т-лимфоцитов CD4⁺/CD8⁺. При анализе баланса иммунного ответа субпопуляциями клеток Th1 и Th2, важного показателя формирования адаптивного иммунитета, определённое преимущество было у группы животных, привитых одновременно обеими вакцинами, которое подтверждалось повышенными уровнями интерлейкина-4 в сыворотке их крови [11]. В отличие от нашего исследования, группы животных были небольшими (n = 6); сами животные были трансгенными Tg (K18-hACE2) для изучения АТ-зависимого эффекта; иммунизация вакциной для профилактики гриппа была проведена однократно [11]. В нашем же исследовании мыши линии BALB/c были привиты дважды гриппозной вакциной, как было описано ранее [13].

Результаты, полученные в настоящем исследовании, подтверждают положительный эффект от одновременной иммунизации лабораторных животных отечественными вакцинами для профилактики гриппа Флю-М и для профилактики коронавирусной инфекции КовиВак, подтверждённый формированием специфических вируснейтрализующих АТ. Обнаруженное нами усиление иммунного ответа к ВГ у лабораторных животных при одновременной иммунизации является положительным результатом, однако требует дальнейшего изучения механизма её возникновения.

Заключение

В ситуации, когда, весьма вероятно, прививаться против COVID-19 надо будет с определённой периодичностью, необходимо планировать стратегию иммунизации, особенно пожилого населения страны, с учётом уже рекомендованных вакцин, как например, вакцин против пневмококка и гриппа. Своевременная вакцинация может предотвратить одновременное заражение и благоприятно повлиять на исход такого заболевания, как COVID-19. Международный Совет по иммунизации взрослого населения (ICAI), отметив высокий риск тяжёлого течения COVID-19 в результате коинфицирования и последующего, вслед за перенесённым COVID-19, инфицирования ВГ, призывает мировое сообщество и правительства расставить приоритеты и разработать отдельную программу иммунизации взрослого населения [15].

Результаты, полученные в настоящем исследовании, подтверждают формирование специфического поствакцинального иммунитета к ВГ и SARSCoV-2 при одновременной иммунизации лабораторных животных отечественными вакцинами для профилактики гриппа Флю-М и для профилактики коронавирусной инфекции КовиВак. Проведённыелабораторные исследования позволяют предположить возможность, при необходимости, одновременной  иммунизации взрослого населения страны вакцинами для профилактики гриппа и COVID-19.

Об авторах

Г. М. Игнатьев

Федеральный научный центр исследования и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9731-3681

Игнатьев Георгий Михайлович - д.м.н., профессор, зам. руководителя направления по качеству и инновационным разработкам

Москва

Россия

И. А. Ленева

НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7755-2714

Ленева Ирина Анатольевна - д.б.н., зав. лаб. экспериментальной вирусологии Отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

Москва

Россия

Е. В. Отрашевская

Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток ФМБА России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2491-4072

Отрашевская Елена Викторовна - начальник отдела научных исследований и опытно-конструкторских работ

Санкт-Петербург

Россия

Л. И. Козловская

Федеральный научный центр исследования и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3029-1035

Козловская Любовь Игоревна - к.б.н., в.н.с.

Москва

Россия

Н. П. Карташова

НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-2096-5080

Карташова Надежда Петровна - н.с. лаб. экспериментальной вирусологии Отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

Москва

Россия

И. Т. Федякина

НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6421-9632

Федякина Ирина Тимофеевна - с.н.с. лаб. экспериментальной вирусологии Отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

Москва

Россия

Е. Ю. Шустова

Федеральный научный центр исследования и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1314-0152

Шустова Елена Юрьевна - н.с. лаб. молекулярной биологии вирусов

Москва

Россия

А. А. Синюгина

Федеральный научный центр исследования и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7251-6570

Синюгина Александра Александровна - руководитель направления по качеству и инновационным разработкам

Москва

Россия

В. В. Зверев

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5808-2246

Зверев Виталий Васильевич - д.м.н., профессор, зав. каф. микробиологии, вирусологии, иммунологии

Москва

Россия

В. П. Трухин

Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток ФМБА России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6635-363X

Трухин Виктор Павлович - к.ю.н., директор

Санкт-Петербург

Россия

А. А. Ишмухаметов

Федеральный научный центр исследования и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6130-4145

Ишмухаметов Айдар Айратович - д.м.н., профессор, член-корреспондент РАН, генеральный директор

Москва

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы