Antigenic and genetic characterization of  Streptococcus pneumoniae  strains isolated from patients with invasive and non-invasive pneumococcal infections by using high-throughput sequencing

K. O. Mironov; Миронов К. О.; I. I. Gaponova; Гапонова И. И.; V. I. Korchagin; Корчагин В. И.; Yu. V. Mikhailova; Михайлова Ю. В.; A. A. Shelenkov; Шеленков А. А.; V. V. Kaptelova; Каптелова В. В.; A. N. Chagaryan; Чагарян А. Н.; N. V. Ivanchik; Иванчик Н. В.; R. S. Kozlov; Козлов Р. С.

doi:10.36233/0372-9311-144

Антигенная и генетическая характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных инвазивными и неинвазивными пневмококковыми инфекциями, с использованием высокопроизводительного секвенирования

Авторы: Миронов К.О.¹, Гапонова И.И.¹, Корчагин В.И.¹, Михайлова Ю.В.¹, Шеленков А.А.¹, Каптелова В.В.¹, Чагарян А.Н.², Иванчик Н.В.², Козлов Р.С.²
Учреждения:
1. Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
2. НИИ антимикробной химиотерапии Смоленского государственного медицинского университета
Выпуск: Том 98, № 5 (2021)
Страницы: 512-518
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 02.11.2021
Дата принятия к публикации: 02.11.2021
Дата публикации: 02.11.2021
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1102
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-144
ID: 1102

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель работы заключалась в характеристике и сопоставлении данных об антигенных и генетических свойствах полученных с помощью высокопроизводительного секвенирования штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных инвазивными и неинвазивными формами пневмококковой инфекции (ПИ). Материалы и методы. Исследовано 158 штаммов S. pneumoniae, выделенных при проведении различных этапов многоцентрового исследования «ПеГАС» в 2015-2020 гг. При анализе данных использовалась информация о полногеномных последовательностях 46 штаммов, выделенных ранее в том же исследовании. Для определения серотипов применены методики ПЦР в режиме реального времени и высокопроизводительное секвенирование (платформа «Illumina»). При обработке данных использовались программы «SeroBA», «PneumoCaT» и программные возможности интернет-ресурса PubMLST.org.
Результаты и обсуждение. Определены серотипы всех штаммов, включённых в исследование. Найден ряд несовпадений серотипов внутри серогруппы 6 и один дискордантный результат при анализе полногеномных последовательностей двумя программами. Предлагаемые ПЦР-подходы позволяют охарактеризовать серотип у 87% возбудителей инвазивных и 69% неинвазивных форм ПИ. Доля штаммов с серотипами, входящими в состав PCV13, составляет 59 и 37%, в состав PPV23 — 78 и 53% для штаммов, выделенных от больных инвазивными и неинвазивными ПИ соответственно. Анализ данных не позволяет выявить преобладающий сиквенс-тип (всего найден 81 сиквенс-тип) или определить клональные комплексы, за исключением штаммов серотипа 3, что согласуется с полученными ранее данными об отсутствии выраженной клональной структуры S. pneumoniae, ассоциированных с пневмококковыми менингитами, на территории России.
Заключение. Получены данные, позволяющие определить распределение циркулирующих серотипов и генетические характеристики штаммов, выделенных от больных ПИ, что даёт возможность оценить эффективность существующих поливалентных вакцин и предоставляет информацию для коррекции основанных на ПЦР способов серотипирования.

Ключевые слова

Streptococcus pneumoniae, инвазивные пневмококковые инфекции, неинвазивные пневмококковые инфекции, высокопроизводительное секвенирование, серотипирование, ПЦР в режиме реального времени, мультилокусное секвенирование-типирование

Полный текст

Введение

Streptococcus pneumoniae является одним из распространённых патогенов человека, способных вызывать инфекции различной локализации. Клинически принято выделять инвазивные и неинвазивные пневмококковые инфекции (ПИ) [1]. К инвазивным формам относят инфекции, при которых возбудитель выделен из стерильных в норме локусов (например, кровь или спинномозговая жидкость). К неинвазивным формам относят в том числе небактериемические пневмонии, при которых возбудитель может быть выделен из отделяемого нижних дыхательных путей. В этой связи далее в статье инвазивными и неинвазивными штаммами будут обозначены культуры микроорганизмов, выделенные от больных соответствующими формами ПИ.

Важным элементом эпидемиологического надзора за ПИ является микробиологический мониторинг, включающий антигенную и генетическую характеристики возбудителей ПИ, а также данные о чувствительности к антибиотикам. Антигенная характеристика возбудителей заключается в определении серотипов, что позволяет оценить эффективность существующих поливалентных вакцин. В России широкое применение получили 13-валентная конъюгированная пневмококковая вакцина (PCV13, «Превенар 13») и 23-валентная полисахаридная вакцина (PPV23, «Пневмовакс 23»). Определение спектра серотипов возбудителей ПИ позволяет планировать иммунопрофилактические мероприятия и оценивать их эффективность в группах лиц, вовлечённых в эпидемический процесс.

Если чувствительность к антибиотикам оценивается, согласно рекомендациям EUCAST [2][3], с использованием стандартных микробиологических методов и, в связи с многообразием механизмов резистентности [1], она не всегда может быть исследована с использованием молекулярно-биологических методов, то эффективность использования молекулярно-биологических методов для определения серогрупп и серотипов (ключевой элемент антигенной характеристики S. pneumoniae) была неоднократно показана в отечественных и зарубежных исследованиях [4–7]. Определение генетических свойств штаммов S. pneumoniae с использованием мультилокусного секвенирования типирования (МЛСТ) или других подходов, основанных на анализе полногеномных данных, позволяет описать клональную структуру микроорганизмов, вовлечённых в эпидемический процесс, оценить рекомбинационный потенциал бактериальной популяции и охарактеризовать эволюционные процессы, приводящие к возникновению новых потенциально вирулентных или резистентных к антибиотикам штаммов [1][8–10].

Антигенная и генетическая характеристики могут быть определены с использованием молекулярно-биологических методов, таких как ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РРВ) и секвенирование. Применение высокопроизводительного секвенирования позволяет получить исчерпывающую характеристику микроорганизмов на основании анализа их полногеномных сиквенсов: последовательностей генов cps-локуса для определения серотипов и данных о первичных последовательностях локусов «основного генома» (core genome), анализ которых обладает максимальной дискриминирующей способностью для определения генетических взаимоотношений штаммов и определения клональной структуры бактериальной популяции. Несмотря на очевидные преимущества ПЦР-РРВ для определения серотипов, эффективность её применения не всегда очевидна, что обусловлено постоянной адаптацией возбудителей под давлением популяционного иммунитета, в том числе обусловленного иммунопрофилактикой с использованием поливалентных вакцин. К настоящему времени известно не менее 100 серотипов S. pneumoniae, из которых значительная часть ассоциирована с инвазивными ПИ [1][11], что диктует необходимость изучения штаммов, не типируемых с помощью стандартных серологических или основанных на ПЦР методик, с целью оптимизации существующих лабораторных подходов, например, за счёт использования дополнительных серотип-специфических мишеней, и даёт информацию об эпидемиологических особенностях циркулирующих возбудителей для эффективного планирования и контроля эффективности программ по вакцинации.

В связи с этим цель данного исследования заключалась в характеристике с помощью высокопроизводительного секвенирования штаммов S. pneumoniae, выделенных от больных инвазивными и неинвазивными формами ПИ, сравнительном анализе их антигенных и генетических свойств в контексте проводимого микробиологического мониторинга.

Материалы и методы

Проведено исследование 22 инвазивных штаммов (выделены из крови или спинномозговой жидкости) и 90 неинвазивных штаммов (выделены из мокроты больных внебольничными пневмониями пневмококковой этиологии) S. pneumoniae. Все штаммы были получены при проведении различных этапов многоцентрового исследования «ПеГАС» в 2015–2020 гг. [2]. Большинство штаммов, охарактеризованных в данном исследовании, и инвазивные штаммы, также полученные при проведении исследования «ПеГАС» и охарактеризованные ранее [5], были выделены в 2019 (n = 58) и 2020 гг. (n = 47).

Условия транспортировки и хранения, микробиологические методы, методы видовой идентификации, методика выделения ДНК, процедура полногеномного секвенирования и сборки генома описаны ранее [2][5]. Все штаммы были дополнительно исследованы с использованием методики ПЦР-РРВ для определения 16 серотипов [4] и с помощью дополнительно разработанной методики для определения серотипов 12F, 15BC, 22FA и 8. Реакционные смеси для ПЦР-РРВ содержат набор из 4 серотип-специфических олигонуклеотидов, соответствующих группам, представленным в табл. 1. Для определения серотипов на основе данных полногеномного секвенирования использовали программы «SeroBA» [6] и «PneumoCaT» [7].

Депонирование нуклеотидных последовательностей, обработка результатов секвенирования с обозначением аллелей и сиквенс-типов, а также анализ данных МЛСТ с помощью программных модулей BURST и Genome Comparator проводили с использованием интернет-ресурса PubMLST.org¹[9]. На момент окончания исследования база данных содержала информацию о более чем 37 тыс. геномов S. pneumoniae, включая 288 полногеномных последовательностей российских изолятов, охарактеризованных преимущественно в работах [5][10]. Поскольку ранее нами была исследована выборка из 46 инвазивных штаммов, также выделенных в рамках исследования «ПеГАС», при сопоставлении результатов антигенной и генетической характеристик инвазивных и неинвазивных штаммов использована объединённая выборка инвазивных штаммов (n = 68), включающая штаммы, описанные нами ранее [5].

Результаты

Полногеномные нуклеотидные последовательности изученных штаммов, данные о серотипах и чувствительности к антибиотикам (для большинства штаммов), а также информация об источниках штаммов внесены в базу PubMLST, идентификационные номера (id): инвазивные штаммы — 73010, 73011, 73013–73015, 73017–73033, неинвазивные штаммы — 142542, 142543, 142546–142569, 142572–142574, 142578, 142579, 142581, 142583–142604, 142606 142610, 142612–142625, 142627–142643. Для всех штаммов определены аллельные профили и соответствующие им сиквенс-типы, при этом часть аллелей и сиквенстипов были описаны впервые.

В результате анализа полногеномных данных с использованием двух программ [6][7] удалось определить серотиповую принадлежность всех изученных штаммов. При этом у неинвазивных штаммов наблюдались несовпадения при определении серотипов, принадлежащих серогруппам 6 (определялись серотипы В или С, А или В и D или С), у 5 штаммов, 15 (В или С) — у 3 штаммов и 35 (А или С) — у 1 штамма, однократно был получен дискордантный результат: у изолята id142633 серотип определён неоднозначным образом (35A или 42). Несоответствий между определением серотипов in silico и при использовании методик ПЦР-РРВ для определения серотипов не выявлено.

Обсуждение

Антигенная характеристика

Всего у инвазивных и неинвазивных штаммов было найдено 28 и 33 варианта серотипов соответственно (неповторяющихся — 42). Наиболее часто (более чем у 5%) у инвазивных штаммов были найдены серотипы 3 (18%), 19F (9%) и 23F (7%), у неинвазивных — 3 (11%), 19F (10%), 15С (8%) и 11A (8%), 23F (7%) и 23A (6%). В табл. 1 представлены данные о частотах серотипов, разделённых по группам, для обеих выборок штаммов. Группам серотипов соответствуют серотип-специфические мишени, детектируемые методиками ПЦР-РРВ, и капсульные антигены, входящие в состав поливалентных вакцин PCV13 и PPSV23. Как следует из табл. 1, доля штаммов, серотип которых может быть определён с помощью методики ПЦР-РРВ для 16 серотипов [4], включающей все серотипы вакцины PCV13, составляет 67% для инвазивных штаммов и 53% для неинвазивных. Эти значения соответствуют доле определённых серотипов (65%), полученных при исследовании возбудителей пневмококкового менингита, циркулирующих на территории Москвы в сопоставимый промежуток времени (2016–2019 гг.) [12], и ниже (79%) циркулирующих ранее (2007–2010 гг.) [4]. Уменьшение доли серотипов, входящих в состав вакцины PCV13, может объясняться как изменяющимся спектром антигенного разнообразия S. pneumoniae, связанным с вакцинацией, так и территориальным разнообразием возбудителей, включённых в данное исследование и изученных при проведении различных этапов исследования «ПеГАС» [2]. Детекция дополнительных серотип-специфических мишеней 12F, 15BC, 22FA и 8 позволяет повысить долю определяемых серотипов до 87 и 69%, при этом наблюдается статистически значимое различие между выборками. Разработанная в 2014 г. методика ПЦРРРВ и предложенный алгоритм её использования [4] не оптимальны как для инвазивных, так и для неинвазивных штаммов в охарактеризованной выборке, собранной на территории нескольких регионов России и циркулирующей преимущественно в 2019–2020 гг. Оптимальный способ определения серотипов методом ПЦР-РРВ должен включать дополнительные серотип-специфические мишени 12F, 15BC, 22FA и 8, при этом детекция серотипов 2, 5, 7AF и 19A может не проводиться.

Таблица 1. Группы серотипов, выявленные у инвазивных и неинвазивных штаммов
Table 1. Serotype groups identified in invasive and non-invasive strains

Возраст, лет Age, years	Заболеваемость в возрастной группе Incidence in age groups	Минимальный показатель Minimum rate		Максимальный показатель Maximum rate		Стандартное отклонение Standard deviation
Возраст, лет Age, years	Заболеваемость в возрастной группе Incidence in age groups	⁰/₀₀₀₀	возраст, лет age, years old	⁰/₀₀₀₀	возраст, лет age, years old	Стандартное отклонение Standard deviation
Мужчины / Men
0-18	3109,6	1475,6	2	6684,8	17	1703,4
19-29	5385,3	3686,6	19	7401,6	29	1282,7
30-49	5979,1	5016,6	49	6585,8	33	381,6
50-69	6071,8	5252,8	69	7053,8	60	369,5
70-79	5813,4	3620,8	77	8008,6	71	1418,9
> 80 5330,2 219,5 > 100 6851,9 82 1796,4
Женщины / Women
0-18	3126,4	1246,6 3 6711,5			17	1830,6
19-29	6655,7	4111,6	19	9507,6	29	1777,8
30-49	7137,7	5788,4	47	7762,6	33	513,0
50-69	6742,9	5372,9	69	7911,5	59	754,3
70-79	4804,3	2992,5	77	6268,9	71	1074,8
> 80	4285,0	430,4	> 100	6194,4	81	1260,0

Примечание. *χ² Пирсона с поправкой Йейтса; **точный тест Фишера, p-value.
Note. *χ² of Pearson with Yates correction; **Fisher's exact test, p-value.

Доля серотипов, входящих в вакцины PCV13 и PPSV23, для исследованных выборок штаммов различна, при этом доля входящих в вакцины серотипов статистически значимо выше в выборке инвазивных штаммов для обеих вакцин.

Генетическая характеристика

У изученных штаммов в совокупности с результатами исследования [5] был выявлен 81 сиквенстип, из которых наиболее часто встречались ST180 (6%), ST-505 (5%), ST-1025, ST-1262 и ST-6202 (по 4%), ST-81 и ST-239 (по 3%). В обеих выборках штаммов максимальное количество сиквенс-типов было выявлено однократно. Из 81 сиквенс-типа 18 (22%) встречались в обеих выборках штаммов, 27 (33%) сиквенс-типов — только у инвазивных штаммов и 36 (44%) — только у неинвазивных. Часть различий в распределении и частотах найденных сиквенс-типов представлена в табл. 2.

Таблица 2. Сиквенс-типы инвазивных и неинвазивных штаммов, выявленные в 2 и более случаях
Table 2. Sequence types of invasive and non-invasive strains identified in 2 or more cases

Периоды эпидемии Epidemic periods		Тяжесть течения COVID-19 / Severity of COVID-19				Доля госпитализированных Proportion of hospitalized patients
Периоды эпидемии Epidemic periods		бессимптомная asymptomatic form	лёгкая mild form	среднетяжёлая moderate form	тяжёлая severe form
Мужчины / Men
Период «завоза» "Importation" period	02.03.2020 30.03.2020	5,23% (2,95-8,47)	25,09% (20,18-30,52)	53,66% (47,70-59,54)	16,03% (11,98-20,79)	87,11% (82,67-90,76)
Период эпидемического подъёма Period of epidemic upswing	01.04.2020 16.05.2020	33,63% (32,51-34,76)	39,08% (37,92-40,25)	21,51% (20,54-22,50)	5,78% (5,24-6,36)	29,21% (28,15-30,29)
Период эпидемического снижения Period of epidemic decline	17.05.2020 31.07.2020	7,41% (6,65-8,22)	47,88% (46,39-49,37)	28,43% (27,10-29,80)	16,28% (15,20-17,41)	45,39% (43,97-46,82)
Эпидемическое «затишье» Epidemic slowdown	01.08.2020 27.09.2020	20,10% (18,61-21,66)	50,29% (48,40-52,19)	14,43% (13,13-15,81)	15,17% (13,84-16,57)	27,40% (26,19-28,64)
Сезонный рост Seasonal surge	28.09.2020 29.11.2020	19,24% (18,48-20,01)	60,22% (59,27-61,17)	17,82% (17,08-18,57)	2,72% (2,41-3,05)	9,85% (9,52-10,18)
Эпидемический максимум Epidemic maximum	30.11.2020 05.01.2021	15,28% (14,98-15,59)	71,36% (70,97-71,75)	12,90% (12,61-13,19)	0,46% (0,41-0,53)	13,50% (12,56-14,49))
Период снижения Period of decline	06.01.2021 08.02.2021	12,65% (12,24-13,06)	73,60% (73,06-74,14)	12,48% (12,07-12,89)	1,27% (1,14-1,42)	6,83% (6,22-7,48)
Период эпидемической стабильности Period of epidemic stability	09.02.2020 04.04.2021	12,10% (11,48-12,74)	73,24% (72,37-74,09)	14,63% (13,96-15,33)	0,03% (0,01-0,08)	10,54% (8,56-12,79)
Женщины / Women
Период «завоза» "Importation" period	02.03.2020 30.03.2020	13,47% (9,80-17,89)	24,92% (20,10-30,24)	48,82% (43,00-54,66)	12,79% (9,22-17,14)	83,84% (79,15-87,84)
Период эпидемического подъёма Period of epidemic upswing	01.04.2020 16.05.2020	22,66% (21,67-23,69)	46,06% (44,86-47,27)	25,51% (24,47-26,57)	5,76% (5,22-6,35)	32,24% (31,14-33,35)
Период эпидемического снижения Period of epidemic decline	17.05.2020 31.07.2020	7,92% (7,20-8,69)	49,65% (48,28-51,01)	28,72% (27,49-29,97)	13,72% (12,79-14,68)	42,84% (41,56-44,13)
Эпидемическое «затишье» Epidemic slowdown	01.08.2020 27.09.2020	21,01% (19,69-22,38)	50,67% (49,02-52,32)	14,46% (13,33-15,66)	13,85% (12,74-15,03)	24,17% (23,18-25,18)
Сезонный рост Seasonal surge	28.09.2020 29.11.2020	18,28% (17,66-18,91)	61,96% (61,17-62,74)	17,71% (17,09-18,33)	2,06% (1,83-2,30)	9,09% (8,81-9,36)
Эпидемический максимум Epidemic maximum	30.11.2020 05.01.2021	14,15% (13,90-14,40)	73,92% (73,61-74,24)	11,59% (11,36-11,82)	0,34% (0,30-0,38)	13,15% (12,30-14,03)
Период снижения Period of decline	06.01.2021 08.02.2021	11,66% (11,33-12,00)	76,26% (75,82-76,70)	11,22% (10,89-11,55)	0,86% (0,77-0,96)	6,93% (6,42-7,47)
Период эпидемической стабильности Period of epidemic stability	09.02.2020 04.04.2021	11,17% (10,67-11,69)	75,29% (74,59-75,98)	13,51% (12,97-14,07)	0,03% (0,01-0,07)	8,36% (6,82-10,11)

Примечание. *Жирным шрифтом выделены сиквенс-типы, найденные в обеих выборках.
Note. *Sequence types found in both samples are in bold.

Несмотря на различия в составе и количестве найденных сиквенс-типов у исследованных инвазивных и неинвазивных штаммов, индекс разнообразия по Симпсону, рассчитанный согласно [13], не отличается и составляет 98,3 и 98,5% соответственно. С одной стороны, полученные высокие значения индекса разнообразия не позволяют говорить о выраженной клональной структуре исследованных возбудителей, с другой — проведённый анализ данных МЛСТ методом BURST определяет две группы генетически близких штаммов с центральными сиквенс-типами ST-311 и ST-505 (при условии объединения в группу штаммов, имеющих не более 2 несовпадений в аллельном профиле). Группа ccST-311 объединяет 9 штаммов с сиквенс-типами ST-36, ST-42, ST15248, ST-16095 и ST-16358, все они принадлежат серогруппе 23 (серотипы A или F). Группа ccST-505 объединяет 20 штаммов серотипа 3 с сиквенс-типами ST-180, ST-2049, ST-15250 и ST-15251, при этом инвазивные штаммы имеют сиквенс-тип ST-180, а неинвазивные — ST-505 (табл. 2). Группе ccST-505 соответствует обозначенная в исследовании [3] клональная группа СС180 — один из наиболее распространённых в России клональных комплексов S. pneumoniae, выделенных в 1980–2017 гг.

При сопоставлении найденных сиквенс-типов с сиквенс-типами 81 российского штамма S. pneumoniae (39 сиквенс-типов), выделенных от больных менингитом в 2011–2015 гг. и охарактеризованных в исследовании [10], найдено 12 совпадений, при этом различий в количестве совпадений между выборками инвазивных и неинвазивных штаммов не наблюдалось. Проведённый анализ по «основному геному» (cgMLST), включающий расчёт генетического расстояния по 1367 локусам, позволяет обозначить обособленные группы штаммов определённых серотипов (для наиболее распространённых серотипов: 3, 19F, 11А, 15BC и 9V), в то же время некоторые группы содержат штаммы нескольких серогрупп (например, 10А и 6С). Сопоставление результатов двух исследований и проведённая генетическая характеристика подтверждают сформулированные ранее положения об отсутствии выраженной клональной структуры S. pneumoniae, ассоциированных с инвазивными ПИ, на территории России [5].

Использование полногеномного секвенирования в молекулярно-биологическом мониторинге возбудителей ПИ позволяет своевременно получать достоверные данные об изменениях в структуре циркулирующих серотипов S. pneumoniae, что может быть эффективно использовано при планировании и оценке эффективности иммунопрофилактических мероприятий. Основанная на полногеномных данных генетическая характеристика является эффективным инструментом внутривидовой классификации возбудителей, проводимой с целью расширенного микробиологического мониторинга как элемента эпидемиологического надзора за ПИ. Накопление и анализ полногеномных данных в перспективе позволит расширить представления об основных генетических вариациях, ассоциированных со способностью отдельных представителей вида S. pneumoniae вызывать инвазивные формы ПИ.

1. PubMLST. Streptococcus pneumoniae MLST Databases. URL: https://pubmlst.org/organisms/streptococcus-pneumoniae