Email this article Biological properties and genetic characteristics of experimental diagnostic Vibrio cholerae bacteriophages
- Authors: Pogozhova M.P.1, Gayevskaya N.E.1, Vodopyanov A.S.1, Pisanov R.V.1, Anoprienko A.O.1, Romanova L.V.1, Tyurina A.V.1
-
Affiliations:
- Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute
- Issue: Vol 98, No 3 (2021)
- Pages: 290–297
- Section: ORIGINAL RESEARCHES
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1050
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-39
- ID: 1050
Cite item
Full Text
Abstract
Background. Currently, the researches focused on the design of new diagnostic and preventive preparations based on bacteriophages are underway, so it is importatnt to study the biological properties of cholera phages along with their genetic structure. This information is necessary to predict the phage life cycle and assess the prospects of its practical use in experiments, phagodiagnostics and phagoprophylaxis.
Materials and methods. The presence or absence of genes characteristic of temperate bacteriophages was tested using a database created by the authors and developed software "PhageAnalyzer", which allows for rapid analysis of bacteriophage genome-wide sequencing data and prediction of their life cycle.
Results and discussion. The morphological structure of experimental diagnostic cholera phages is represented by head bacteriophages of various morphogroups. Negative colonies phage differed in diameter, shape and degree of transparency. No genetic determinants of resistance factors and toxins have been found in the genomes of bacteriophages Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7, and Rostov M3. Results of phylogenetic analysis demonstrated that the studied experimental cholera bacteriophages resemble headphages from the genus Vibrio, but are unique, since they lie outside “cluster groups”. Vibrio phages Rostov-1 and Rostov M3 are appeared to be lytic. Genes characteristic of moderate bacteriophages were found in cholera phages Rostov-6 and Rostov 7.
Conclusion. The experimental cholera bacteriophage Rostov-1 can be used to differentiate cholera vibrion O1 the serogroup of the El Tor biovar, and Vibrio phage Rostov M3 can be used to differentiate the Classical biovar. Both bacteriophages are lytic and promising components for creating prophylactic drugs against cholera. Vibrio phages Rostov-6 and Rostov 7 can be successfully used only in experimental activities, as well as for monitoring cholera vibrions in the environment. Complete genomic sequences are deposited and available in the international database Genbank (NCBI).
Full Text
Введение
Холера представляет значительную угрозу для здравоохранения и выявляется не только в эндемичных регионах [1][2]. Детальное изучение бактериофагов имеет как теоретическое, так и важное практическое значение. Бактериофаги используют для разработки эффективных методов фагодиагностики и фагопрофилактики возбудителей различных заболеваний, в том числе холеры. Вирулентные формы фагов являются одним из основных элементов биологической борьбы с бактериальной инфекцией [3][4]. Только вирулентные бактериофаги могут применяться в составе профилактических препаратов, поскольку воздействие умеренных бактериофагов на культуру фагочувствительных бактериальных клеток приводит к образованию фагорезистентных вариантов. На сегодняшний день обнаружено множество генов, характерных для умеренных бактериофагов, которые могут быть встроены в геном. Наиболее информативным методом для выявления генетических детерминант умеренных бактериофагов является полногеномное секвенирование [5][6].
Цель исследования — изучение биологических свойств и генетических характеристик холерных бактериофагов Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov М3, входящих в число экспериментальных диагностических бактериофагов Vibrio cholerae О1 серогруппы биоваров El Tor и Classical.
Материалы и методы
В исследование взяты бактериофаги Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov М3, входящие в число экспериментальных диагностических бактериофагов V. cholerae О1 серогруппы биоваров El Tor и Classical. Бактериофаги выделены из водных объектов окружающей среды и находятся в коллекции холерных фагов лаборатории бактериофагов Ростовского-на-Дону противочумного института.
Изучение биологических свойств проводили общепринятыми методами [7]. Для подготовки к электронно-микроскопическому исследованию препарат бактериофагов центрифугировали, отбирали супернатант и вносили в него полиэтиленгликоль 6000. Далее центрифугировали, удаляли супернатант, а осадок ресуспендировали деионизованной водой. Затем наносили препарат на сеточки для электронной микроскопии и контрастировали 2% водным раствором уранилацетата. После высушивания образцы просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе «JEM-1011» («JEOL»). Электронограммы получены при помощи CDC-камеры «Olimpus-SlS-Veleta» («Olimpus») и программного обеспечения «iTEM-TEMimagingPlatform» («ResAlta»).
ДНК фагов выделяли в соответствии с ранее описанными методиками [8][9][10]. Количество и качество выделенной ДНК контролировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле. Качество полученных препаратов фаговой ДНК исследовали, подвергая их гидролизу эндонуклеазами рестрикции, а также в ПЦР. Отсутствие бактериальных хромосом в пробах подтверждали методом ПЦР с использованием ген-специфичных праймеров для определения фрагментов ДНК hly и ctx+. Раствор фаговой ДНК хранили при –20ºС.
Геномную последовательность бактериофагов определяли с использованием одного из методов высокопроизводительного секвенирования. ДНК фагов секвенирована с помощью полногеномного секвенатора «Miseq» («Illumina»).
Первичные данные секвенирования оценивали с использованием программы «FastQC» [11]. Для тримминга и коррекции ридов применяли алгоритмы Trimmomatic [12] и Lighter [13]. Сборку геномов, представленных в виде ридов, проводили в программе «Spades» [14]. Собранные геномы бактериофагов сравнивали с аннотированными последовательностями известных бактериофагов при помощи алгоритма BLASTN 2.2.291. Наличие или отсутствие генов, характерных для умеренных бактериофагов (генетических детерминант факторов резистентности, токсинов и интеграз), проверяли при помощи созданной нами базы данных и разработанного программного обеспечения «PhageAnalyzer»2, позволяющего проводить быстрый анализ данных полногеномного секвенирования бактериофагов и прогнозировать их жизненный цикл.
Результаты
Исследование методом электронной микроскопии показало, что экспериментальные бактериофаги — головчатые, но относятся к различным морфогруппам и семействам (табл. 1).
Таблица 1. Морфология исследованных фаговых корпускул
Table 1. Morphology of the studied phage corpuscles
Название бактериофага The name of bacteriophage | Размер и строение головки Head size and structure | Размер и строение хвоста Tail size and structure | Морфогруппа [15] Morphogroup [15] | Тип [16] Type [16] | Семейство Family |
Rostov-1 | 440x515 Ǻ Многогранная головка Multifaceted head | 125 Ǻ Короткий несократимый хвост Short irreducible tail | III | C | Podoviridae |
Rostov-6 | 453x510 Ǻ Многогранная головка Multifaceted head | 110 Ǻ Короткий несократимый хвост Short irreducible tail |
|
|
|
Rostov 7 | 453x510 Ǻ Многогранная головка Multifaceted head | 1023 Ǻ Длинный сократимый хвост Long contractile tail | V | А | Myoviridae |
Rostov М3 | 451x533 Ǻ Многогранная головка Multifaceted head | 113 Ǻ Короткий сократимый хвост Short contractile tail |
|
|
|
Холерные бактериофаги Rostov-1 и Rostov 7 активны в отношении V. cholerae серогруппы O1 биовара El Tor с диапазоном литической активности 57,5 и 66,3% соответственно. На газоне индикаторной культуры Vibrio фаг Rostov-1 образует колонии двух типов: мелкие (диаметром 1,0–1,5 мм) и крупные (3,0–6,0 мм) (рис. 1), а Vibrio фаг Rostov 7 образует прозрачные негативные колонии (1,0–1,5 мм).
Рис. 1. Негативные колонии, образуемые на газоне индикаторной культуры V. cholerae О1 серогруппы биовара El Tor бактериофагом Rostov-1.
Fig. 1. Negative colonies formed on the lawn of the indicator culture of V. cholerae O1 serogroup of the El Tor biovar bacteriophage Rostov-1.
Бактериофаг Rostov М3 активен в отношении холерного вибриона О1 серогруппы биовара Classical с диапазоном литической активности 83,3%. На газоне индикаторной культуры бактериофаг Rostov М3 образует прозрачные негативные колонии диаметром 1,5–2,0 мм. В свою очередь, Vibrio фаг Rostov-6 активен в отношении V. cholerae О1 серогруппы биоваров Classical и El Tor, в том числе к антибиотикоустойчивому штамму V. cholerae El Tor 19243 (стрептомицин, фуразолидон, триметоприм/сульфаметоксазол, налидиксовая кислота) со спектром литической активности 64,6%. На газоне индикаторной культуры Vibrio фаг Rostov-6 образует прозрачные негативные колонии диаметром 1,0–1,5 мм.
Исследованные фаги устойчивы к воздействию хлороформа и инактивируются при 60ºС в течение 30 мин. Специфичность экспериментальных бактериофагов в отношении хозяина подтверждена на большом наборе представителей близкородственных микроорганизмов семейств Vibrionaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, которые не лизировались испытуемыми фагами.
Результаты, полученные при секвенировании геномов холерных экспериментальных бактериофагов, показали, что размеры их геномов колеблются от 37 до 47 тыс. пар нуклеотидов (табл. 2).
Таблица 2. Анализ последовательностей геномов холерных экспериментальных бактериофагов
Table 2. Sequence analysis of the genomes of the experimental cholera bacteriophages
№ No. | Название фага Phage name | Размер генома п.н. Genome size, bp | Количество открытых рамок считывания Number of Open Reading Frame |
1 | Rostov-1 | 37 247 | 39 |
2 | Rostov-6 | 39 934 | 15 |
3 | Rostov 7 | 45 903 | 35 |
4 | Rostov М3 | 46 669 | 50 |
По данным биоинформационного анализа ДНК исследованных бактериофагов, в их составе выявлены гены, характерные для головчатых фагов V. cholerae (табл. 3).
Таблица 3. Геномы головчатых фагов, представленные в базе данных GenBank (NCBI)
Table 3. Genomes of head phages available in GenBank database (NCBI)
№ No. | Название фага Phage name | Номер доступа в GenBank GenBank accession number |
1 | Vibrio phage vB_VchM-138 | JQ177064.1 |
2 | Vibrio phage 24 | KJ572844.2 |
3 | Vibrio phage CP-T1 | JQ177061.1 |
4 | Phage CP-T1 (Vibrio cholerae) | X12375.1 |
5 | Vibrio phage X29 | KJ572845.2 |
6 | Vibrio phage phi 2 | KJ545483.2 |
7 | Vibrio phage N4 | FJ409640.1 |
8 | Vibrio phage ICP3_2007_A | HQ641344.1 |
9 | Vibrio phage ICP3 | HQ641340.1 |
10 | Vibrio phage ICP3_2008_A | HQ641343.1 |
11 | Vibrio phage ICP3_2009_B | HQ641341.1 |
12 | Vibrio phage JSF25 | MF574151.1 |
13 | Vibrio phage VP4 | DQ029335.1 |
14 | Vibrio phage VP3 | JQ780163.1 |
15 | Vibrio phage H2 | KM612262.1 |
16 | Vibrio phage CJY | KM612260.1 |
17 | Vibrio phage J3 | KM612265.1 |
18 | Vibrio phage H3 | KM612263.1 |
19 | Vibrio phage H1 | KM612261.1 |
20 | Vibrio phage J2 | KM612264.1 |
21 | Vibrio phage phiVC8 | JF712866.1 |
22 | Vibrio phage VP5 | AY510084.1 |
23 | Vibrio phage QH | KM612259.1 |
Обсуждение
Морфологический анализ методом электронной микроскопии показал, что исследованные бактериофаги являются головчатыми. Эти данные подтверждает анализ нуклеотидных последовательностей и относит экспериментальные диагностические холерные бактериофаги к ДНК-содержащим хвостатым фагам. Размеры геномов бактериофагов Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov М3 достаточно большие, в них обнаружены гены, характерные для головчатых фагов рода Vibrio (табл. 3).
Бактериофаги Rostov-1 и Rostov 7 обладают способностью лизировать более широкий спектр штаммов V. cholerae О1 серогруппы биовара El Tor по сравнению с другими холерными фагами El Tor. Фаг Rostov M3 активен в отношении V. cholerae О1 серогруппы биовара Classical с большим диапазоном литической активности. Холерный бактериофаг Rostov-6 также имеет высокий спектр литической активности и уникален тем, что активен в отношении V. cholerae O1 серогруппы биоваров как Classical, так и El Tor, в том числе антибиотикоустойчивого штамма V. сholerae El Tor 19243.
После сравнения генома бактериофага Rostov-1 с имеющимися в базе данных GenBank генами других фагов из группы Vibrio phage обнаружено, что только 23 открытых рамки считывания (ORF) имеют установленные функции. Гомологичные последовательности в известных бактериальных геномах не обнаружены. Установлено, что вибриофаг Rostov-1 является литическим, т.к. в результате биоинформационного анализа не обнаружено генов, характерных для умеренных бактериофагов.
В геноме бактериофага Rostov-6 идентифицированы 13 последовательностей, гомологичных бактериальным, что составляет бóльшую часть генома. Также обнаружены 2 ORF, которые гомологичны фаговым. Бактериофаг Rostov-6 считается умеренным, потому что в нём обнаружена интеграза (YP_009153053.1) с гомологией 96,6%.
Бактериофаг Rostov 7 имеет 28 ORF из рода Vibrio и 7 ORF из других родов с установленными функциями. Обнаружены гомологичные последовательности в известных бактериальных геномах — гипотетические белки гамма-протеобактерий и профаг Bacillus subtilis. Поскольку в геноме найдены 2 интегразы с гомологией 96,6% (YP_009043902.1) и 94% (YP_009043892.1), бактериофаг Rostov 7 является умеренным.
Анализ нуклеотидных последовательностей фага Rostov M3 показал, что в геноме 50 ORF, и все они принадлежат роду Vibrio. После анализа данных, предоставленных системой BLASTN, обнаружены 3 бактериофага, гомологичные Rostov M3, относящиеся к тому же семейству Myoviridae [16]. Из них 2 фага Vibrio vB_VchM-138 и Vibrio phage 24, идентичные Rostov M3 на 99,08 и 98,31% соответственно, являются литическими, организм-хозяин — V. cholerae О1 серогруппы биовара Classical. Данные фаги описаны как диагностические, а также перспективные для фаготерапии [5][17]. Третий Vibrio фаг CP-T1 идентичен Rostov M3 на 98,31%, но является умеренным и способен размножаться на обоих биоварах V. cholerae О1 Classical и El Tor [18]. Генетические детерминанты факторов резистентности, токсинов и интеграз не обнаружены, значит он является литическим.
Анализируя дендрограмму (рис. 2), следует отметить общность сходства исследованных экспериментальных диагностических бактериофагов с головчатыми фагами V. cholerae и принадлежность к данному семейству, но обособленное положение «вне кластерных групп» указывает на их уникальность.
Рис. 2. Филогенетический анализ исследованных фаговых геномов.
Fig. 2. Phylogenetic analysis of genomes of the studied phages.
Исследованные фаги имеют высокий процент сходства с геномами бактериофагов, представленных в базе данных GenBank, — 83–99%, но все же являются уникальными. Аннотированные последовательности фагов зарегистрированы в международной базе GenBank (табл. 4).
Таблица 4. Зарегистрированные геномы исследованных бактериофагов
Table 4. Deposited genomes of the studied bacteriophages
Название бактериофага Phage name | Номер доступа в GenBank GenBank accession number |
Rostov-1 | MG957431 |
Rostov-6 | MH105773 |
Rostov 7 | MK575466.1 |
Rostov М3 | MN379460-MN379463 |
Заключение
Морфологическая структура экспериментальных диагностических холерных фагов представлена головчатыми бактериофагами различных морфогрупп. Негативные колонии фагов различались по диаметру, форме и степени прозрачности.
В геномах бактериофагов Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov M3 генетических детерминант факторов резистентности и токсинов не обнаружено. В результате филогенетического анализа стало известно, что имеют сходство исследованные холерные экспериментальные бактериофаги с головчатыми фагами из рода Vibrio, но являются уникальными, т.к. находятся «вне кластерных групп».
Экспериментальный холерный бактериофаг Rostov-1 может быть использован для дифференциации холерного вибриона О1 серогруппы биовара El Tor, а Vibrio phage Rostov M3 — для биовара Classical. Выявлено, что оба бактериофага не содержат генетических детерминант, которые характерны для умеренных фагов. Холерные бактериофаги Rostov-1 и Rostov M3 являются литическими и перспективными компонентами для создания профилактических препаратов против холеры.
В структуре генома Vibrio phage Rostov-6 и Rostov 7 найдены интегразы, поэтому использование фагов в профилактических препаратах исключено, т.к. они являются умеренными. Данные бактериофаги могут быть успешно использованы при мониторинге холерных вибрионов из окружающей среды, а также в экспериментальной деятельности.
Таким образом, была осуществлена биологическая и генетическая характеристика холерных бактериофагов Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov M3. Полные геномные последовательности зарегистрированы и доступны в международной базе GenBank.
1. URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov
2. Погожова М.П., Водопьянов А.С., Гаевская Н.Е. и др. PhageAnalyzer — программа для анализа данных полногеномного секвенирования бактериофагов. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2019616060 от17.05.2019. Available at: http://antiplague.ru/phageanalyzer/
About the authors
M. P. Pogozhova
Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute
Author for correspondence.
Email: m_pogozheva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9779-3577
Marina P. Pogozhova — junior researcher, Laboratory of bacteriophages
Rostov-on-Don
Russian FederationN. E. Gayevskaya
Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0762-3628
Natalya E. Gayevskaya — Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Deputy head, Laboratory of bacteriophages
Rostov-on-Don
Russian FederationA. S. Vodopyanov
Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute
Email: fake@neicon.ru
Alexey S. Vodopyanov — Cand. Sci. (Med.), Deputy head, Group of virology
Rostov-on-Don
Russian FederationR. V. Pisanov
Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7178-8021
Ruslan V. Pisanov — Cand. Sci. (Biol.), Deputy head, Laboratory for diagnostics of especially dangerous infections
Rostov-on-Don
Russian FederationA. O. Anoprienko
Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8466-9315
Anna O. Anoprienko — junior researcher, Laboratory of bacteriophages
Rostov-on-Don
Russian FederationL. V. Romanova
Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5113-7387
Lyudmila V. Romanova — D. Sci. (Biol.), senior researcher, Microbial biochemistry laboratory
Rostov-on-Don
Russian FederationA. V. Tyurina
Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9359-3997
Anna V. Tyurina — junior researcher, Laboratory of bacteriophages
Rostov-on-Don
Russian FederationReferences
- Москвитина Э.А., Тюленева Е.Г., Кругликов В.Д., Титова С.В., Водопьянов А.С., Куриленко М.Л. и др. Холера: оценка эпидемиологической обстановки в мире и России в 2008-2017 гг. Прогноз на 2018 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; (1): 36–43. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2018-1-36-43
- Centers for Disease Control and Prevention. 2010. Update: cholera outbreak – Haiti, 2010. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. 2010; 59(45): 1473–9.
- Yen M., Cairns L.S., Camilli A. A cocktail of three virulent bacteriophages prevents Vibrio cholerae infection in animal models. Nat. Commun. 2017; 8: 14187. https://doi.org/10.1038/ncomms14187
- D'Andrea M.M., Marmo P., Henrici De Angelis L., Palmieri M., Ciacci N., Di Lallo G., et al. φBO1E, a newly discovered lytic bacteriophage targeting carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae of the pandemic Clonal Group 258 clade II lineage. Sci. Rep. 2017; 7(1): 2614. https://doi.org/10.1038/s41598-017-02788-9
- Bhandare S.G., Warry A., Emes R.D., Hooton S.P.T., Barrow P.A., Atterbury R.J. Complete genome sequences of Vibrio cholerae-specific Bacteriophages 24 and X29. Genome Announc. 2017; 5(46): e01013–17. https://doi.org/10.1128/genomea.01013-17
- Comeau A.M., Tremblay D., Moineau S., Rattei T., Kushkina A.I., Tovkach F.I., et al. Phage morphology recapitulates phylogeny: the comparative genomics of a new group of myoviruses. PloS One. 2012; 7(7): e40102. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040102
- Adams M.H. Bacteriophages. New York: Inter science Publishers; 1959.
- Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., ред. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984.
- Габрилович И.М. Практическое пособие по бактериофагии. Минск: Вышэйшая школа; 1968.
- Yamamoto K.R., Alberts B.M., Berzinger R., Lawhorne L., Treiber G. Rapid bacteriophage sedimentation in the presence of polyethylene glycol and its application to large-scale virus purification. Virology. 1970; 40(3): 734–44. https://doi.org/10.1016/0042-6822(70)90218-7
- Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data 2010. Available at: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc
- Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics. 2014; 30(15): 2114–20. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170
- Song L., Florea L., Langmead B. Lighter: fast and memoryefficient sequencing error correction without counting. Genome Biol. 2014; 15(11): 509. https://doi.org/10.1186/s13059-014-0509-9
- Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5): 455–77. https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021
- Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.; 1968.
- Ackerman H.B. Bacteriophage taxonomy in 1987. Microbiol. Sci. 1987; 4(7): 214–8.
- Comeau A.M., Tremblay D., Moineau S., Rattei T., Kushkina A.I., Tovkach F.I., et al. Phage morphology recapitulates phylogeny: the comparative genomics of a new group of myoviruses. PloS One. 2012; 7(7): e40102. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040102
- Guidolin A., Morelli G., Kamke M., Manning P.A. Vibrio cholerae bacteriophage CP-T1: characterization of bacteriophage DNA and restriction analysis. J. Virol. 1984; 51(1): 163–9. https://doi.org/10.1128/jvi.51.1.163-169.1984
Supplementary files
